SNT 2663-2010 贝类中失忆性贝类毒素检验方法 酶联免疫吸附法
书书书
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
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酶联免疫吸附法
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版权所有 · 禁止翻制、电子发售
书书书
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书书书
中华人民共和国出入境检验检疫行业
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贝类中失忆性贝类毒素检验方法
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实施
中 华 人 民 共 和 国
国家质量监督检验检疫总局 发 布
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书书书
中华人民共和国出入境检验检疫
行 业 标 准
贝类中失忆性贝类毒素检验方法
酶联免疫吸附法
SN/T2663—2010
中 国 标 准 出 版 社 出 版
北京复兴门外三里河北街16号
邮政编码:100045
网址 www.spc.net.cn
电话:68523946 68517548
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷
开本 880×1230 1/16 印张 0.5 字数 9 千字
2011年4月第一版 2011年4月第一次印刷
印数1—1600
书号:155066·221748 定价 14.00 元
版权所有 · 禁止翻制、电子发售
书书书
前 言
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。
本标准起草单位:中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、中华人民共和国云南出入境检验检疫
局、中华人民共和国山东出入境检验检疫局。
本标准主要起草人:王秋艳、曹际娟、王刚、赵昕、郑惠芳、于兵、黄大亮、吴振兴、徐维加、郑秋月、
徐君怡。
Ⅰ
犛犖/犜2663—2010
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贝类中失忆性贝类毒素检验方法
酶联免疫吸附法
1 范围
本标准规定了贝类及其制品中失忆性贝类毒素检验的酶联免疫吸附法。
本标准适用于贝类及制品中失忆性贝类毒素的检测。
2 术语、定义和缩略语
2.1 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
2.1.1
失忆性贝类毒素 犪犿狀犲狊犻犮狊犺犲犾犾犳犻狊犺狆狅犻狊狅狀;犃犛犘
化学结构以软骨藻酸为代
,摄食后可产生头晕目眩,定向力障碍及持续性短期记忆缺失等症状的
存在于贝类体内的海洋生物毒性物质的总称,它是一类具有神经兴奋的氨基酸类物质。
2.1.2
软骨藻酸 犱狅犿狅犻犮犪犮犻犱;犇犃
主要由拟菱形藻属硅藻产生的一种谷氨酸和红藻酸的类似物,能够污染鱼贝类等海洋生物,是引起
人类记忆缺失性中毒的致病因子。
2.2 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
ASP(amnesicshellfishpoinson):失忆性贝类毒素。
ELISA(enzymelinkedimmunosorbentassay):酶联免疫吸附试验。
3 样品保存和制备
3.1 样品的保存
3.1.1 样品要有充分的代表性并尽可能没有个体差异,且至少要10个以上。去壳贝肉、带壳的或罐装
的等,均应采取足够的个数并使贝肉达200g以上。
3.1.2 远离实验室不能及时送检的样品,除了在常温下品质不会发生变化的,应将样品置于保温盒中
冷冻送检。如为带壳样品,应按3.2的方法开壳,去除水分后冷冻送检。
3.2 样品的制备
3.2.1 生鲜带壳样品的前处理
用清水将贝壳外表彻底洗净,切断闭壳肌,开壳,用重蒸馏水淋洗内部去除泥沙及其他外来物。将
闭壳肌和连接在胶合部的组织分开,仔细取出贝肉,切勿割破肉体。开壳前不要加热或用麻醉剂。收集
100g贝肉置于筛子中沥水5min(不要使肉堆积),检出碎壳等杂物,将贝肉均质,备用。
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3.2.2 冷冻样品的前处理
在室温下,使冷冻样品呈半冷冻状态。带壳冷冻样品,按3.2.1方法清洗、开壳、淋洗取肉,此时的
贝肉仍呈冷冻状态,除去贝肉外部附着的冰片,轻轻抹去水分后;事先已去除水分的冷冻去壳样品,室温
缓化。将100g上述贝肉均质,备用。
3.2.3 贝类罐头
将罐头内容物沥干水分,倒入均质器充分均质,备用。
3.2.4 贝肉干制品
称取100g干制品放入足量清水中浸泡24h~48h(4℃冷藏),沥干、备用。
3.2.5 盐渍品
用清水洗涤,流水脱盐,沥干,备用。
4 测定方法
4.1 测定原理
本方法的测定基础是竞争性酶联免疫反应,酶标板上包被有针对软骨藻酸抗体的捕捉抗体,加入抗
软骨藻酸抗体、标准液或样品溶液及软骨藻酸酶标记物,游离的失忆性贝类毒素与软骨藻酸酶标记物竞
争软骨藻酸抗体,同时软骨藻酸抗体与捕捉抗体连接。没有结合的酶标记物在洗涤步骤中被除去。将
酶基质和显色剂加入到孔中并且孵育。结合的酶标记物将无色的发色剂转化为蓝色的产物。加入反应
终止液后使颜色由蓝转变为黄色。在450nm测量微孔溶液的吸光度值,样品中的失忆性贝类毒素溶
液与吸光度值成反比,按绘制的标准曲线定量计算。
4.2 试剂和
除另有规定外,所有化学试剂均为
纯或生化试剂,水为重蒸馏水。
4.2.1 无水甲醇。
4.2.2 半对数坐标纸。
4.2.3 DA标准物质。
4.2.4 DA酶标记物。
4.2.5 抗DA抗体。
4.2.6 包被有捕捉抗体的微孔板。
4.2.7 基质(过氧化氢)/发色剂(四甲基联苯胺)。
4.2.8 洗脱液:0.5%吐温20PBS。
4.2.9 反应终止液:6mol/L硫酸。
4.2.10 商业化试剂盒如比利时CER和挪威Biosence公司生产的失忆性贝类毒素检测试剂盒1),若测
定低限和回收率达到本标准的要求则也适合于本标准。
1) 给出这一信息是为了方便本标准的使用者,并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果,则
可使用这些等效产品。
4.3 仪器和设备
4.3.1 酶标仪(450nm)。
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4.3.2 均质器。
4.3.3 离心机。
4.3.4 微量加样器:50μL,100μL,200μL,1000μL。
4.3.5 微量多通道加样器:50μL~300μL。
4.3.6 天平(感量0.01g)。
4.3.7 0.45μm滤器。
4.4 试样的提取
称取第3章均质的贝类组织10.0g(精确至0.01g),加入10.0mL水,涡旋振荡1min,加入
20.0mL100%甲醇,涡旋振荡1min。3000犵离心10min,用0.45μm滤器过滤上清液,得到样品提
取液。用稀释缓冲液将样品提取液稀释100倍(如吸取10μL样品与990μL稀释缓冲液混合)。取
50μL按4.5方法进行酶联免疫测定。此时的稀释倍数是300。高浓度的样品,如超出标准曲线范围,
可进一步用缓冲液稀释,直至样品浓度在标准曲线范围以内。
4.5 酶联免疫测定
将足够数量的已包被捕捉抗体的微孔条插入微孔架(空白对照、标准液和样液分别做复孔),记录空
白对照、标准液和样液的位置。向空白对照孔加入150μL稀释缓冲液,向标准液和样液孔分别加入相
应的50μL5个~7个失忆性贝类毒素标准液或样液到各自的微孔,每个标准液和样液应使用新的吸
头。向上述所有的微孔中加入100μLDA酶标记物工作液,向除空白对照孔之外的所有微孔中加入
100μLDA抗体工作液,迅速充分混合1min,用粘胶纸封住微孔以防溶液挥发,4℃孵育2h。孵育结
束后,倒去孔中液体,每个微孔注入300μL洗液冲洗,翻转微孔板,倾去孔内液体,再重复以上洗板操作
2次,在吸水纸上拍干。每孔加150μL底物/显色剂溶液,充分混合,室温避光孵育30min。每孔加入
50μL终止液迅速混匀后,在30min内测量并记录450nm波长下的吸光度值。
4.6 结果的计算和表述
4.6.1 计算百分比吸光度值
标准液和样液的平均吸光度值(OD值)减去空白对照孔的平均OD值作为标准液和样液的平均校
正OD值。按式(1)分别求得每个失忆性贝类毒素标准液和样液的百分比吸光度值:
犃=犛-犛1犛0-犛1×
100% …………………………(1)
式中:
犃———百分比吸光度值;
犛———失忆性贝类毒素标准液或样液的平均OD值;
犛1———空白对照孔的平均OD值;
犛0———0μg/L的失忆性贝类毒素标准液的平均OD值。
4.6.2 绘制标准曲线
以百分比吸光度值为纵坐标,以失忆性贝类毒素溶液浓度(ng/mL)的对数值为横坐标,绘制标准
曲线。每次试验均应重新绘制标准曲线。或通过软件计算出浓度与百分比吸光度值间的标准曲线公
式,得到回归方程[见式(2)]:
犢=犃log犡+犅 …………………………(2)
式中:
犢———百分比吸光度值;
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结果的表述
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测定低限和回收率
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回收率
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健康和安全
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的样品即被认为是有害的"对人类食用不安全'
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甲醇对人体有害"建议有条件的实验室在通风橱中操作'
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