2010年9月
September2010
色 谱
ChineseJournalofChromatography
V01.28N0.9
859~862
研究论文 DOI:10.3724/SP.J.1123.2010.00859
高效液相色谱.串联质谱法测定牛奶和奶粉中的三聚氰酸
桂茜雯4, 柳 菡, 赵增运, 丁 涛, 徐锦忠,
沈伟健, 沈崇钰, 吴 斌, 张 睿
(江苏出入境检验检疫局动植物与食品检溯中心,江苏南京210001)
摘要:建立了牛奶和奶粉中三聚氰酸(CYA)的高效液相色谱一串联质谱(HPLC,MS/MS)测定
。样品用乙腈提
取并沉淀蛋白,经强阴离子交换柱富集和净化,AX色谱柱分离,HPLC·MS/MS法测定.内标法定量。50~2000
斗g/L范围内CYA的线性关系良好(r≥0.999);在奶粉和牛奶基质中,添加200、500和l000斗g/kg3个添加水平
的同收率均在97%~12l%之间,相对
偏差(RSD)均小于4.8%;定量限(LOQ)为200斗g/kg。方法的前处理快
速简便,净化效果好,准确度和精密度高,可用于牛奶和奶粉中CYA的测定。
关键词:高效液相色谱一串联质谱;=三聚氰酸;牛奶;奶粉
中图分类号:0658 文献标识码:A 文章编号:1000-8713(2010)09-0859—04
Determinationofcyanurieacidinmilkandmilkpowder
41
byhighperformanceliquidchromatography一
tandemmassspectrometry
GUIQianwen8,LIUHan,ZHAOZengyun,DINGTao,XUJinzhong,
SHENWeijian,SHENChongyu,W.UBin,ZHANGRui ‘
(Animal,PlantandFoodInspectionCenterofJiangsuEntry·ExitInspection
。。.
and蛳绍£l孵Bureau,Nanfing210001,China) 溺
Abstract:Amethodforthedeterminationofcyanuficacid(CYA)inmilkandmilkpowder
wasdevelopedusinghighperformanceliquidchromatography—electrosprayionizationtandem
massspectrometry(HPLC·ESIMS/MS).Thetargetanalytewasextractedfromsamplesby
acetonitrile,andtheproteinswereprecipitatedatthesametime.ThesupernatantWascleaned
upandenrichedwithastronganionexchangecolumn,analysedbyHPLC—MS/MSwithanAX
column,andquantifiedbyinternalstandardmethod.Goodlinearitywasobtainedintherange
of50—2000斗g/L.Therecoverieswereallrangedfrom97%to12l%atthreelevels,200,500
and1000I_Lg/kg,andtherelativestandarddeviations(RSDs)wereallbelow4.8%.Limitof
quantification(LOQ)was200斗g/kg.Themethodhashighaccuracyandprecision,theopera-
tionisfast,easyandsuitableforthedeterminationofCYAinmilkandmilkpowder.
Keywords:highperformanceliquidchromatography-tandemmassspectrometry(HPLC-Ms/
MS);cyanuncacid;milk;milkpowder
三聚氰酸(CYA)又名氰尿酸,与三聚氰胺结构
类似,同属三嗪类含氮杂环有机化合物。CYA因含
氮量高,有人将其作为伪蛋白添加使用。而另一种
非法添加物三聚氰胺在强酸或强碱溶液中水解最终
也会生成CYA。研究结果显示,生物体内单独摄入
三聚氰胺毒性较低,同时摄人CYA和三聚氰胺后会
导致肾毒性¨。1。
目前对CYA的检测方法有高效液相色谱法
(HPLC)’4。71、气相色谱.质谱联用法(GC—MS)J‘II]
和液相色谱一质谱联用法(HPLC.MS)。12。“,单独检
测CYA㈠5’7·¨t14。或与三聚氰胺同时检测:6’8。住’13·”3。
常用的前处理方法是用有机溶剂或水溶液等试剂提
$通讯联系人:桂茜雯。助理
师,主要研究方向为食品检测.Tel:(025)52345177,E—mail:wendy_gqw@yahoo.corn.ca
收稿日期:2010-05—26
篱:{;,。麓
万方数据
·860· 色 谱 第28卷
取,离心后过滤膜直接进行HPLC或HPLC—MS测
定,大都缺乏更加有效的前处理方法。采用GC—MS
法需经过衍生,衍生化试剂会产生一定的杂质,对目
标物的测定产生干扰,也易对仪器造成污染。有研
究使用透析方法H1将CYA与高蛋白基质分离,净化
效果较好但是耗时过长。也有方法¨¨为达到较好
的净化效果,多次加入不同试剂,前处理相对烦琐,
处理后样品浓度被稀释多倍,不利于痕量检测。本
文建立了采用乙腈提取牛奶和奶粉中的CYA,经强
阴离子交换固相萃取(SPE)柱富集和净化,采用
AX色谱柱进行分离,HPLC·MS/MS测定,内标法定
量的
方法。
1 实验部分
1.1仪器与试剂
AppliedBiosystems4000QTrap质谱仪(美国
AppliedBiosystems公司),配有电喷雾离子源
(ESI);Agilent1200液相色谱仪(美国Agilent公
司);真空氮气吹干仪(美国Zymark公司);Milli—Q
去离子水发生器(美国Millipore公司);XW一80A涡
旋混匀器(上海医科大学仪器厂);LDZ5—2离心机
(北京医用离心机厂);KQ·250DE超声仪(江苏昆
山超声仪器有限公司)。
乙腈、甲醇、甲酸、氢氧化钠(分析纯,江苏南京
化学试剂厂);乙腈(色谱纯,德国Merck公司);强
阴离子交换SPE柱(60mg,3mL,天津Agela公
司);CYA(纯度≥99.0%,美国Fluka公司);CYA
同位素(CYA_13C,,纯度≥98.2%,上海振翔公司);
水为去离子水;牛奶和奶粉样品为各地送检的阴性
样品。
1.2仪器条件
HPLC条件BioBasiclMAX(150mmx2.1
mm,5“m,美国ThermoFisher公司);流动相:
90%(体积分数)乙腈水溶液;等度洗脱,流速0.5
mL/min;柱温:室温;进样体积:25wL;分析时间:
5 min。
MS条件离子源:ESI,负离子方式检测;检测
模式:多反应监测(MRM);离子喷雾(IS)电压:
一4500V;雾化气(GSI)压力:55Pa;气帘气
(CUR)压力:25Pa;辅助气(GS2)压力:50Pa;离
子源温度:550℃;去簇电压(DP):一4lV;碰撞气
能量(CE):一14V;碰撞室入口电压(EP):一10V;
碰撞室出口电压(CXP):一15V。CYA和其同位素
内标的其他质谱条件见
1。
表I 三聚氰酸及其内标的质谱条件
Table1 MS/MSconditionsofcyanuricacidandCyA.13C,
1.3标准溶液配制
准确称量lOmg的CYA标准品或CYA同位素
标准品,用50%(体积分数)乙腈水溶液溶解并定容
于100mL容量瓶中,配制成100mg/L的CYA或
CYA同位素的标准储备液。放置于冰箱中0—4℃
下避光存放(有效期1年)。
准确吸取一定量的100mg/LCYA和CYA同
位素标准储备溶液,用乙腈逐级稀释为lmg/L的
标准溶液,于0~4℃下保存备用。
逐级稀释CYA标准溶液,用乙腈配制质量浓度
分别为50、100、200、500、1000、2000斗g/L,每个浓
度的标准溶液都含0.1mg/LCYA同位素。
1.4样品前处理
准确称取1g(±0.02g)样品于50mL有盖塑
料离心管中(奶粉样品中需加入2mL去离子水,涡
旋30S混匀),加入lmg/L的CYA同位素内标标
准溶液100斗L,在涡旋器上快速混匀10S,再加入
乙腈8mL,加盖涡旋30S,超声15min。以8000
r/min速率离心4min,将上层清液转移至10mL氮
吹管中,在45℃水浴下氮气吹至1mL,加去离子水
8mL,加入1moVL的氢氧化钠溶液0.5mL,混匀,
待净化。
用3mL甲醇、3mL水依次活化强阴离子交换
柱,将待净化液全部上柱,再用3mL水和3mL甲
醇依次洗涤SPE小柱,用3mL1.0%(体积分数)
甲酸甲醇溶液洗脱至10mL氮吹管中,在45℃水
浴下氮气吹干。用1.0mL90%乙腈水溶液定容
后,涡旋,过0.45ixm有机相滤膜到进样瓶中,供
HPLC—MS/MS测定。
2结果与讨论
2.1提取和净化条件的选择和优化
乳制品蛋白含量较高,需要加入有机溶剂沉淀
蛋白。实验中考察过甲醇、乙醇、乙腈,发现乙腈的
沉淀蛋白效果和提取效果均较好,因此选择乙腈作
为提取溶剂。对于奶粉样品,需先加入少量水溶解,
再加入乙腈,比直接加入乙腈时的提取回收率高,净
化效果好。
万方数据
第9期 桂茜雯.等:高效液相色谱一串联质谱法测定牛奶和奶粉中的三聚氰酸 ·861·
由于CYA含羟基,呈弱酸性,因此可采用强阴
离子交换柱进行SPE净化。实验中发现洗脱液中
甲酸含量(用体积分数表示)对CYA的回收有显著
影响。对洗脱液中甲酸含量(10%、5%、3%、l%、
0.5%和O.1%)进行考察,发现用甲酸含量较高
(5%以上)的洗脱液回收率较低,且随洗脱后溶液
放置时间的延长而降低,推测CYA在较多甲酸环境
中不稳定。含0.1%甲酸的洗脱液回收率较低,增
加洗脱液体积可以提高回收率。可见甲酸含量低时
洗脱能力下降,不能将CYA完全洗脱。采用1%的
甲酸甲醇溶液,既能将CYA洗脱,又不影响其稳定
性。因此选择1%的甲酸甲醇溶液作为洗脱溶液。
2.2色谱和质谱条件的优化
在实验方法调试过程中,采用C,。色谱柱与AX
色谱柱分别进行测定。由于CYA极性较大,在C,。
柱上没有保留,与很多杂质同时流出,在离子化时相
互竞争,造成严重的基质抑制效应,影响峰形和灵敏
度。使用具有正相机理的AX柱,正相模式下进行
分离,使CYA在色谱柱上产生保留,与杂质有效分
离,既改善了CYA的色谱行为,又减少了电喷雾时
基质中其他成分对CYA离子化的抑制。负离子模
式下的电喷雾离子化使CYA产生m/z127.8的准
分子离子峰[M—H]一,对碰撞能量进行优化得到子
离子m/z41.9和84.9,其丰度比为100:74。CYA
同位素内标产生m/z130.8的准分子离子峰[M—
H]一,子离子为m/z43.1。
2.3线性范围和定量限
用CYA及其内标配制相应浓度的系列标准溶
液,以CYA和内标物的峰面积比为纵坐标,CYA的
质量浓度为横坐标进行线性回归,结果表明本方法
在CYA为50—2000¨g/L时,相关系数为0.9990,
线性关系良好。在空白奶粉和牛奶基质中添加
CYA标准品,当CYA质量浓度达200斗∥kg时,信
噪比远远大于10,而此浓度已达到国际贸易的限量
要求(250v.g/kg)。121,故确定定量限为200¨g/kg。
CYA和其内标标准溶液的MRM谱图见图1。
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U
、
蚤
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董
t/min timin
圈1 CYA标准溶液1200●喀/L)及内标标准溶液的MRM谱图
Fig.1LC.MS/MSehromatogramsofCYA(200v./L)andCYA
13
C3inmulti.reactionmonitoring(MRM)mode
2.4回收率和精密度
在空白牛奶和奶粉样品中添加CYA标准溶液,
添加的水平分别为200、500和l000斗g/kg,计算其
回收率和精密度(n=7),结果见表2。牛奶基质和
奶粉基质在200斗g/kg添加水平下的MRM谱图见
图2和图3。
t/min t/min
图2奶粉阴性样品中添加CYAf200.1jg/kg)和内标标准溶液的MRM谱图
Fig.2LC.MS/MSchromatogramsofablankmilkpowderspikedCYA(200pg/kg)andCYA一”C3inMRMmode
&=童slIo菪一
sdo、扫ISco董『Isd口、扫一su3c一
万方数据
·862· 色 谱 第28卷
t|rain t|rain
圈3 牛奶阴性样品中添加CYA(200tug/kgl和内标标准溶液的MRM谱图
Fig.3LC-MS/MSchromatogramsofablankmilkspikedCYA(200pg/kg)andCYA-13C3inMRMmode
袭2奶粉和牛奶基质中不同添加水平的CYA的回收率和精密度(n=7)
Table2 ReeoveriesandprecisionsofCYAspikedinblankmilkandmilkpowder【n=7)
2.5实际样品检测
除了对送检样品进行检测以外,我们采用本方
法对市场上8种品牌的牛奶和奶粉做抽样检测后发
现,在品牌A的鲜奶中检测出CYA,其中瓶装奶和
袋装奶检出值分别为310Ixg/kg和270Ixg/kg;品
牌B的鲜奶中的CYA的检出量约为210¨g/kg。
而其他品牌鲜奶未检出CYA。抽样的各品牌奶粉
中均没有检出CYA。
3 结语
建立了HPLC-MS/MS检测牛奶和奶粉中CYA
的方法。利用乙腈沉淀样品中的蛋白质并提取
CYA,用强阴离子交换柱富集净化,用AX色谱柱取
代C,。色谱柱进行HPLC分离,HPLC—MS/MS方法
检测,内标法定量。方法前处理操作简便,净化效果
好,CYA在AX柱上的色谱行为得到改善,抗干扰能
力强,准确度和精密度高,在牛奶和奶粉基质中有较
高的回收率。经200余个样品的实际检测证明,该
方法适合国内外监控和检测的要求。
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p.二|
二.
2
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万方数据
高效液相色谱-串联质谱法测定牛奶和奶粉中的三聚氰酸
作者: 桂茜雯, 柳菡, 赵增运, 丁涛, 徐锦忠, 沈伟健, 沈崇钰, 吴斌, 张睿, GUI
Qianwen, LIU Han, ZHAO Zengyun, DING Tao, XU Jinzhong, SHEN Weijian, SHEN
Chongyu, WU Bin, ZHANG Rui
作者单位: 江苏出入境检验检疫局动植物与食品检测中心,江苏,南京,210001
刊名: 色谱
英文刊名: CHINESE JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY
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13.李锋格;姚伟琴;田延河 查看详情 2010(03)
14.Miao H;Fan S;Wu Y N 查看详情 2009
15.Brown C A;Jeong K S;Poppenga R H 查看详情 2007
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