国内外食品微生物检测方法

*国内外食品微生物检测方法*微生物检验方法的必要性和重要性有法可依有法必依执法必严违法必究有法可依有章可循有据可查有错必纠有洞必补对食品中的致病微生物进行监测是国家意志的体现食品安全食品政治国家执行部门*准确、可靠的检验结果是正确评价和保证食品安全性的先决条件也是国际贸易上公平交易的有力科学依据在食品微生物检验领域中，检验规程规范化和分析方法标准化是检验结果可信性的重要保证。避免“公说公有理，婆说婆有理”；避免“仁者见仁，智者见智”*内容第一部分国内外食品微生物标准检验体系第二部分微生物检验快速检测系统第三部分方法的选择第四部分微生物检验方法的编写第五部分食品微生物检验方法的验证和确认*第一部分国内外的食品微生物标准检验体系一、术语和定义讲义、标准方法：指国际、区域、国家发布的经过严格确认的以及公认的方法标准方法包括参考方法和公定方法。（1参考方法：指适用于特殊待验目标的经过国际或国家公认的检验方法。对于食品微生物检验而言典型的传统的参考方法是培养法。（2）公定方法：指知名的技术组织或机构（如AOAC）公布的检测方法。2、非标准方法：标准方法中未包含的需要确认后才能采用的方法。可替代方法：指用来检验某一特定产品中某种目标微生物的与相应参考方法等效的方法（ISO讲义6140:2003如快速检测试剂盒和自动化系统值得说明的是，并非所有的可替代方法都是标准方法。*二、国内外食品微生物检测体系国内主要食品微生物检测体系国家标准(GB)检验检疫行业标准(SN)卫生行标(WS)农业行标(NY)国外主要食品微生物检测体系国际标准化组织(ISO)美国食品药品监督局（FDA）(online)美国官方分析化学师协会(AOAC)美国农业部（USDA）(online)加拿大健康署(HPB)(online)美国公共卫生协会(APHA)北欧食品分析委员会（NMKL）法国标准协会(AFNOR)标准、英国国家标准(BS)、日本国家标准(JIS)、韩国国家标准（KS）等标准方法非标准方法科学书籍和期刊公布的方法；实验室研发的未出版的方法；部分由设备制造商指定的方法；扩充和修改过的标准方法；企业标准；部分协会标准；部分地方标准等。食品微生物检测方法标准方法未包含的方法http://www.foodmate.net*食品中常规指示菌和致病菌的关系好氧菌总数肠杆菌科大肠菌群粪大肠菌群大肠杆菌沙门氏菌致泻性大肠杆菌金黄色葡萄球菌粪链球菌弧菌科单增李斯特氏菌志贺氏菌芽孢杆菌O157厌氧梭菌弯曲菌*常规指示菌和致病菌的危害分类VeryfewmicrobesarealwayspathogenicManymicrobesarepotentiallypathogenicMostmicrobesareneverpathogenic如霍乱弧菌、O157、单核细胞增生李斯特氏菌等如肠球菌、蜡样芽孢杆菌、白色念珠菌、枯草芽孢杆菌等如乳酸杆菌、双歧杆菌等*食品微生物检测方法方法定量方法定性方法直接计数方法细菌总数*、大肠菌群*、大肠杆菌*、肠球菌*、金黄色葡萄球菌*、蜡样芽孢杆菌、产气荚膜梭菌、单核增生李斯特氏菌、沙门氏菌、弯曲菌属、肠杆菌科*、副溶血性弧菌、亚硫酸盐还原梭菌、李斯特氏菌属、霉菌和酵母菌数*、嗜冷菌*、乳酸菌、双歧杆菌等间接计数法(MPN法)大肠菌群*、粪大肠菌群*、大肠杆菌*、肠球菌*、金黄色葡萄球菌*、蜡样芽孢杆菌、单核增生李斯特氏菌、肠杆菌科*、副溶血性弧菌、亚硫酸盐还原梭菌等致病菌：单核细胞增生李斯特氏菌、沙门氏菌、空肠弯曲菌、O157、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、肉毒梭菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、产毒霉菌等带*者通常被列为食品卫生指示菌*传统直接计数法平板倾注法平板涂布法***MPN法适用于污染程度低，含有受到损伤的加工食品，目标微生物数量低，否则，应用直接计数方法间接计数法——最大可能数量（MPN*三、区分几个关系讲义、国家标准与行业标准的关系食品微生物检验的国家标准是GB/T4789其为基础标准，行业标准方法原则上应与其一致，至少不能与国家标准相矛盾进口产品用GB??出口产品用SN??????2、国家标准与国际标准的关系？为了公平贸易，国家标准应与国际标准接轨。应考虑优先使用国际标准。现状。实例：2004年USDA来青进行等效性评估。3、国内国家标准/行业标准与[他国]国家标准/行业标准的使用？根据ISO/IEC17025的规定，如果进口国要求使用他国国家标准/行业标准，原则上要满足客户的要求，否则，需与客户协商。即使国内国家标准/行业标准与他国国家标准/行业标准等效或等同，也必须与客户协商和沟通，只有做客户统一的情况下方可使用。*第二部分微生物快速检测系统*第一节主要微生物检验快速检测系统一、以免疫学为基础的检验法*免疫磁珠检验法的优点:特异性好灵敏度高≤讲义CFU所捕获的菌是活菌快速、操作步骤简便可快速处理较大量样品**商业化免疫磁珠有：沙门氏菌O157:H7单核细胞增生李斯特氏菌VTECO145VTECO111VTECO103VTECO26等等SN/T***-****进出口食品中产志贺氏毒素大肠杆菌的检验方法*可筛选沙门氏菌、肠出血性大肠杆菌O157、李斯特氏菌、空肠弯曲菌、单核细胞增生李斯特氏菌、葡萄球菌肠毒素；可免疫浓缩沙门氏菌、免疫浓缩肠出血性大肠杆菌O157Mini-VIDAS自動微生物筛选儀*二、以分子生物学为基础的检验法DIN10135：1999《沙门氏菌聚合酶连锁反应(PCR)检验方法》、ISO/TS20863：2005《食品和动物饲料微生物学—聚合酶链反应(PCR)检测食源病原体—热循环器的性能试验》、ISO/TS22174:2005《食品和动物饲料微生物学—聚合酶链反应(PCR)检测食源病原体—通用要求和定义》、ISO20837:2006《食品和动物饲料微生物学—聚合酶链反应(PCR)检测食源病原体—定性检测用样品的制备》、ISO/TS20838：2006《食品和动物饲料微生物学—聚合酶链反应(PCR)检测食源病原体—定性方法的扩增和检测条件》、HealthCanadaMFLP-72、USAFDABAM第9章和USAAPHA第40章规定可用PCR检测食品中的致病弧菌（如霍乱弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌等）、HealthCanadaMFLP-24和USAFDABAM第24章和USAAPHA第35章规定可用PCR检测食品中产志贺氏毒素的致病大肠杆菌和霍乱弧菌。SN/T1632.2：2005《奶粉中阪崎肠杆菌检验方法第2部分：PCR方法》SN/T1632.3：2005《奶粉中阪崎肠杆菌检验方法第3部分：荧光PCR方法》PCR检测食品中霍乱弧菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、产志贺氏毒素大肠杆菌等致病菌的SN均在报批中，即将发布。*PCR技术将是众多食品微生物快速检测中被认可的一枝独秀的快速检测技术之一。但须注意：如何减少培养基成分的干扰？死菌的干扰和风险？等等*基因芯片-DNA点样仪基因芯片的基本技术路线1、采用数据库中各种微生物的全基因组序列资料或部分基因组序列资料，通过生物信息学方法找出各种微生物的特异序列，每个检测目标找3-5个特异序列，每个序列长度为25-75mer。并设计五条阴性序列（这些序列不代表任何一个待分析的微生物）。2、合成上述特异序列（探针）。探针将不是传统的cDNA形式，而是oligo寡聚核酸，这样将大大提高检测灵敏度。3、利用基因芯片点样系统将探针点样到载体上。同一种微生物的特异性探针点样到芯片的一个区域。4、寻找适当的方法，提取微生物的基因组核酸。5、加入相应的引物、荧光染料或用分子信标的方法，通过PCR扩增特异性片段。6、将带有荧光染料标记的核酸与基因芯片杂交。7、杂交结果由基因芯片扫描仪进行扫描判读，对于管帽芯片也可用荧光显微镜进行观察。8、结果分析，针对杂交阳性位点，找出对应的阳性样品。SN/T1543:2005食源性致病菌基因芯片鉴定方法*三、生化鉴定系统*BDPHOENIX™全自动微生物鉴定系统大肠杆菌（G-）沙门氏菌(G-)志贺氏菌(G-)弯曲杆菌(G-)弧菌(G-)小肠结肠炎耶尔森氏菌(G-)金黄葡萄球菌(G+)李斯特氏菌(G+)***产气甲膜梭菌(G+)肉毒梭菌(G+)链球菌(G+)炭疽杆菌(G+)双歧杆菌（G+）乳酸菌（G+）VITEK2COMPACT*四、根据酶触反应及代谢产物快速检测细菌***五、其他部分自动化系统*BIOLOG自动微生物鉴定系统BIOLOGOmniLog&OmniLogPlusMicroLog讲义MicroLog2MicroLog3MicroStation)OmniLogMicroLog*第二节微生物快速检测系统的局限性大部分快速方法适用于检测单一微生物适用于质量控制程序中快速筛选大量食品样品中所存在的特殊病原体或毒素然而，快速检验方法所得阳性者，仅仅是可疑，必须用标准参考方法予以证实，虽然证实试验需要几天，但不能予以限制。快速检验方法的评估结果表明其对于某类食品的性能优于其它食品，很大程度上是由于食品成分干扰所致，有些食品成分对于快速方法中所应用的技术是比较麻烦的例如，每一食品成分可能抑制DNA杂交或Taq聚合酶，但对抗原-抗体相互作用没有影响，反之亦然。既然方法的灵敏度、特异性和精确性依赖于待验食品，那么进行比较研究以确保某一特殊检验方法能有效分析此类食品是明智的。*基于DNA检验方法的特异性通过短的探针来显示因此用特殊探针或引物检测毒素基因，阳性结果仅仅表明某细菌具有该基因序列，以及某细菌可能是产毒的，不能从客观上说明该基因得以表达，并产生毒素，例如在梭菌和葡萄球菌中毒病例中，DNA杂交和PCR仅能检测到基因的存在，但不能用来检测预先形成的毒素是否存在随着某一快速方法更加频繁的使用，其好处和局限性同时变得更加明显。使用者在选择和彻底评估这些快速方法时，必须保持谨慎。*FDA认可使用的检测系统和试剂盒检测和鉴定食源性病原菌的微量生化复合试剂盒微生物自动鉴定系统核酸杂交分析（分子生物学方法免疫学分析方法其它商品化快速检测方法和培养基第三节微生物快速检测系统的认可一、USDAFDA认可情况*******二、AOAC、NMKL、AFNOR、NORDVAL、MICROVAL的认可情况AOAC指南美国管理者(USregulators)ISO16140AOAC研究所NMKLNordValMicroValAOAC&OMA非美国管理者，如NATAAFNOR认可微生物快速检测系统的主要知名技术组织或机构的相互关系认可(agreement)逐步淘汰(phasingout)*第三部分方法的选择讲义．客户要求；2．方法的准确性；3．方法的特异性；4．方法的实用性；5．方法的稳定性；6．方法的灵敏度；7．方法的检测限和测量限；8．实验室硬件条件（仪器、设备、场地设施、人员资质等；9．商业快速检测系统的供应保证、价格、认可程度和售后服务*通常情况下实验室应采用满足客户（注：对于企业实验室，其所在单位为其内部客户需要并适用于所进行的检测的方法，包括在抽样的方法应优先使用以国际、区域或国家标准发布的方法。当认为客户提出的方法不合适或已过期时，实验室应通知客户。当客户未指定所用方法时除优先使用国际、区域、国家或知名的技术组织发布的标准方法外，还可选择非标准方法，但必须对所选择的非标准方法进行严格验证、确认和审批，如能满足实验室的预期用途，并经客户同意，也可使用*第四部分微生物检验方法的编写标准方法的一般构成和编写顺序：讲义．资料性技术要素：封面、目次*、前言、引言；2．规范性一般要素：名称、范围、规范性引用文件*；3．规范性技术要素：术语和定义*、符号和缩略语、食品微生物检验原理*、培养基和试剂、设备和材料、采样*、制样、增菌培养、筛选、鉴定和确认等)、结果判定（判定方法和判定标准、结果报告*、规范性附录*；4．资料性补充要素：资料性附录*、参考文献*、索引*上述构成要素不是任何一项标准都需要全部包括的标有*者可根据标准化对象的特征和制定标准化的目的而取舍。第一节标准方法的编写***第二节非标准方法的编写一般要求以接近国家标准（如GB/T讲义.1－2000或行业标准推荐方法的格式进行编写等同、修改采用国际标准或国外先进标准时其编写格式和方法可与被采用的标准一致。力求标准结构严谨、层次分明、主题突出，简单易懂。一、非标准方法的编写原则*二、非标准食品微生物学检验方法的基本编写格式（讲义封面每项非标准微生物检验方法应该有封面封面的内容有×××（单位）×××（部门）非标准方法字样和非标准方法的标志（注：选择性的）、中文名称、英文名称（注：选择性的）、非标准方法的唯一性编号、代替非标准编号（注：选择性的）、发布日期、实施日期、标准的审批部门等（见附录1示例2）（2）正文内容一般包含下列内容，必要时可增减相关条目：①目的、范围；②方法提要或原理:简述所用方法的主要步骤及采用的基本原理；③设备和材料：标明规格和型号；④培养基和试剂：必须符合GB/T4789.28和SN/T1583的规定；⑤检验程序：画出主要的检验程序框图；⑥操作步骤：包括试样制备（含稀释或按特定条件的制备）、培养（含前增菌培养和增菌培养，分离培养等，可根据需要取舍和分步描述）、初步鉴定（可根据需要取舍）、确证鉴定（含进一步的生化反应和血清学分型，可根据需要确定试验内容）毒素试验（可根据需要取舍）、动物试验（可根据需要取舍）；⑦结果报告；⑧其它（包括内部质量保证要点、生物防护要求；）；⑨附录（资料性附录和规范性附录）⑩方法来源（如参考文献、仪器设备方法等）。*三、非标准方法的审批制订SOP，实施需要其它材料？进一步规范方法实验室将全部材料送至主管部门实验室提供材料和信息审核全部材料被批准和备案否实验室认可，提交材料是是否需要采取后续措施（包括能力验证、实验室内试验、实验室间协作试验等）？实验室编写和确认方法实验室采取所需的措施主管部门组织技术专家组进行材料审查和技术审核（包括能力验证结果、性能特征、实验室内试验结果、实验室间协作试验结果等），决定是否需要现场考查。现场核查实验室调研现场核查？否专家组评估所采取措施是否充分合理？是否是是否非标准食品微生物学检验方法的审批程序*第三节标准操作程序的编写标准操作程序（standardoperationpracticesSOP是用来指导某个具体过程、事物所形成的技术性细节描述的可操作性文件，国内常常称之为作业指导书，二者没有本质区别SOPs的编写及使用是实验室成功质量体系中的一部分，因为它能为操作人员提供正确完成一项工作的信息，从而保证不同操作人员都能在一定的不确定度范围内得到相同的微生物检验结果。实验室应关注以下四个方面SOPs：讲义．方法类：包括食品微生物检验方法中不详细或不完善部分的补充，期间核查、方法确认及比对等；2．设备类：重要或复杂设备的使用、操作规范（如设备制造商提供的技术不够明细等）；3．样品类：取样、制样和样品处置的“”等；4．数据类：定量检测结果的表达、异常数据的剔除、测量结果不确定度的评定等等。SOP是技术性的文件，并不要求必须制订。一、定义和分类*二、食品微生物检验SOP的编写依据目前在国内，尚未检索到关于食品微生物检验SOP的编写导则及相关要求；在国外，美国环境保护署EPA)(http://.epa.gov/quality/sops.html)和美国农业部销售司(AMS)(http://www.ams.usda.gov/science/mpo/)均发布关于微生物检验SOP的编写导则及相关要求，前者是后者的蓝本：①EPAQA/G-6GuidanceforPreparingStandardOperatingProcedures(SOPs)；②EPASOPADM-02-02《StandardOperatingProcedureforPreparationandReviewofStandardOperatingProcedures(SOPs)》；③USDAMDP-ADMIN-07《PreparationandMaintenanceofStandardOperatingProcedures(SOPs)》以上文本均可从相应网站免费下载，同时EPA和USDAAMS制定了一系列与微生物检验相关的SOPs，这些SOPs的编写结构和格式值得借鉴和参考。*SOP的格式方法一：参照美国农业部农业销售司AMS)的微生物数据程序http://.ams.usda.gov/science/mpo/sops.htm方法二：参照美国环境保护署（EPA的EPAQUALITYSYSTEMhttp://www.epa.gov/quality/sops.html作业指导书与SOP无本质区别*三、SOP的基本编写格式下面结合一个实例介绍一下编写微生物检验SOP的基本格式和要求：（讲义封面①编写单位：中英文对照②标题：测定对象—测定项目—测定方法名称中英文对照)；测定对象：以产品为主，采用最常规的产品名称（可参照国际、国家或行业的产品标准）；测定项目：应写明具体被测项目；当被测项目为多项时，应一一列出，超过8项时，可只写出前3个项目。③编写人及时间：为保证SOP内容的全面性和准确性，由实验室内具有一定资质的使用者编写；④审核人及时间；⑤批准人及时间：批准人一般为实验室的技术负责人；⑥文件编号：唯一编码；⑦受控状态：是否受控；⑧修订号：第×××次修订；⑨发放序号。（2）正文内容一般包含下列内容，必要时可增减相关条目：①目的；②范围；③方法提要或原理:简述所用方法的主要步骤及采用的基本原理；④程序提纲：包括培养基和血清、设备和玻璃器皿、取样、测试样品的制备、测试样品和最初悬浮液、非选择性前增菌、选择性增菌、筛选、可疑典型菌落的分离和纯化、生化鉴定、血清学确认和血清型、确认；⑤安全性；⑥质量保证；⑦参考文献；⑧特殊程序：与④对应；⑨结果表达和测试报告；⑩附录（资料性附录和规范性附录）。*SOP实例USDA：MDP-DATA-0讲义MicrobiologicalDataandResultsReportingEPA：QC-02-02Air-SurfaceMonitoringofMicrobiologyLaboratories山东CIQ：SOP沙门氏菌的检测方法*第五部分食品微生物检验方法的验证和确认一个实验室拟用某一食品微生物检验方法前无论是标准方法还是非标准方法，皆应对其进行严格验证或确认详见食品微生物实验室质量管理手册*第一节验证和确认导则在GB/T讲义9000：2000质量管理体系基础和术语中验证被定义为通过提供客观证据对规定要求已得到满足的认定，确认被定义为“通过提供客观证据对特定的预期用途或应用要求已得到满足的认定”在ISO/IEC17025中5.4.5.1中确认被定义为“通过核查并提供客观证据，以证实某一特定预期用途的特殊要求得到满足”。从以上定义可以看出，验证要保证“做得正确”，而确认则要保证“做的东西正确”。验证注重“过程”，确认注重“结果”。一、概念*二、微生物检验方法验证和确认的依据①美国官方分析化学家协会AOAC)执行标准为：AOACInternationalMethodsCommmitteeGuidelinesforValidationofQualitativeandQuantitativeFoodMicrobiologicalOfficialMethodsofAnlysis-2002；②国际标准化组织(ISO)，执行标准为：ISO/TR讲义3843：2000Waterquality--Guidanceonvalidationofmicrobiologicalmethods和ISO16140:2003《Microbiologyoffoodandanimalfeedingstuffs--Protocolforthevalidationofalternativemethods》；③NordVal：NV-DOC.D–2005-01-01《Protocolforthevalidationofalternativemicrobiologicalmethods》；④新加坡认可委员会(SAC)：C&BandENV002《MethodValidationofMicrobiologicalMethods》此外，可参考GB/T18510-2001《煤和焦炭试验可替代方法确认准则》。*三、验证和确认试验技术用于验证和确认食品微生物检验方法性能的试验技术包括：①使用参考菌株进行核实；②与其他方法所得的结果进行比较；③实验室间比对；④对影响结果的因素作系统性评审；⑤根据对方法的理论原理和实践经验的科学理解对所得结果不确定度进行评定以上验证和确认食品微生物检验方法性能的试验技术，可概略分为两大类：实验室间验证/确认试验（协作试验和实验室内验证/确认试验（单一试验）。实验室间验证/确认试验是指在若干实验室内由不同操作者进行的验证/确认试验，而实验室内确认试验是仅在特定的实验室内进行的验证/确认试验。*四、对试验人员的要求验证和确认食品微生物检验方法的人员必须符合以下要求：A掌握方法中试样处理的原理；B掌握方法中食品成分对微生物的干扰以及微生物的增菌原理；C掌握方法中目标微生物分离、纯化、鉴定和确认的原理；D对仪器的构造要有基本了解；E对仪器/试剂盒的工作原理有基本了解；F能熟练使用仪器/试剂盒；G熟悉仪器/试剂盒的维护和性能确认方法；H熟悉方法所使用的试剂、材料和仪器/试剂盒；I熟练掌握分析步骤的每一个步骤；J了解方法的关键所在；K能熟练进行分析结果的计算；L掌握方法能独立进行数据处理并判断结果的准确性*五、对协作实验室的要求如果进行实验室间验证/确认试验（协作试验协作试验室必须符合以下要求：A按ISO/IEC讲义7025认可，并且进行协作试验所需技术在实验室认可范围之内，必须提供一份实验室认可证书和认可范围；B令人满意地进行实际样品的分析C有操作和处理分析物或相关混合物及适用对象的经验；D不能将试验转包给其他实验室；E有独立的质量保证体系和程序文件，应能提供一份组织结构图，应能提供一份标准操作程序的提纲提要；F拥有必需设备，并进行了规范的维护和校准，应能提供相关记录；G有培训和资格确认记录，应能确保食品微生物检验方法的验证和确认人员符合前文要求；H有内部质量控制和外部质量评估措施，必须提供这些措施的记录；I有适当的令人满意地记录和保护数据的系统。*第二节食品微生物检验方法的验证建议实验室在以下情况下对检验方法进行严格的验证：讲义.拟用经过完整确认的标准方法以及经过严格确认的并被审批的非标准方法时；2.培养基供应商、人员、设备、仪器/试剂盒等发生变动时*第三节食品微生物检验方法的确认实验室必须对非标准方法、实验室设计（制定的方法、超出其预定范围使用的标准方法、扩充和修改过的标准方法进行严格的完整确认否则不可使用可根据AOAC官方食品微生物定量和定性检验方法确认指南-2002、ISO/TR讲义3843-2000、ISO16140:2003、NV-DOC.D–2005-01-01或C&BandENV002的进行确认，其中AOAC官方食品微生物定量和定性检验方法确认指南-2002和ISO16140:2003最常用，这两个标准大同小异。*方法之一AOACINTERNATIONALMicrobiologyGuidelines-2002：AOACINTERNATIONALMETHODSCOMMITTEEGUIDELINESFORVALIDATIONOFQUALITATIVEANDQUANTITATIVEFOODMICROBIOLOGICALOFFICIALMETHODSOFANALYSISAOAC国际方法委员会-2002：关于官方食品微生物定性和定量分析方法确认指南*方法之二ISO讲义6140:2003：Microbiologyoffoodandanimalfeedingstuffs--Protocolforthevalidationofalternativemethods食品和动物饲料微生物学——备用方法确认规范ISO/TR13843：2000Waterquality--Guidanceonvalidationofmicrobiologicalmethods水质——微生物方法的确认指南*方法之三*谢谢Thankyou