2008年 2月
第 29卷 第 1期
首 都 医 科 大 学 学 报
Journal of Cap italMedical University
Feb. 2008
Vol. 29 No. 1
·临床研究 ·
膀胱癌等位基因缺失研究
李 光 1 张海峰 2 徐妙生 1 王全红 3
(1. 首都医科大学附属北京天坛医院病理科 ; 2. 山西省太原市第二人民医院检验科 ; 3.山西省肿瘤医院病理科 )
【摘要 】 目的 了解膀胱癌克隆演变 ( clonal evolution)过程中的遗传学机制。
分别利用 4个位于染色体 9p21区和 17p13
区上具有多态性的微卫星标记物 ,
了 18位膀胱癌病人原发癌及相应转移灶中等位基因的缺失或保留方式。利用显微切割
技术在保存的石蜡包埋组织中获取基因组 DNA。结果 在原发癌和转移灶中总的等位基因缺失频率均为 89% (16 /18) , 而在
原发癌中 D9S161的缺失频率为 86% , D9S171为 67% , IFNA 71% , TP53 80% ;在转移灶中各位点缺失频率分别为 100%
(D9S161) , 67% (D9S171) , 71% ( IFNA) , 80% ( TP53)。18例病例中 , 16例 (89% )在原发癌及相应转移灶中所有位点均表现为
相同的等位基因缺失或保留模式 ,而另外 2例 (11% )则显示不一致的等位基因缺失。这 2例在原发癌灶表现为等位基因保留而
在相应转移灶则为缺失。结论 膀胱癌在原发癌及相应转移灶遗传组成上有相当一致性 ;当转移癌的原发癌不能确定来源时 ,
这些位点的杂合性缺失 (LOH)可作为膀胱癌的标志物。
【关键词 】 膀胱癌 ; 转移 ; 显微切割 ; 肿瘤进展
【中图分类号 】 R 737. 14
A llelic L oss in Bladder Cancer
L i Guang1 , Zhang Haifeng2 , Xu M iaosheng1 , W ang Quanhong3
(1. D epartm ent of Pa thology, B eijing Tiantan Hospita l, Capita l M edica l U niversity; 2. D epartm en t of C lin ical Laboratory,
The Second People’s Hospita l of Ta iyuan; 3. D epartm en t of Pathology, Shanxi Cancer Hospita l)
【ABSTRACT】 O bjective To better understand the genetic basis of bladder cancer p rogression. M ethods The study exam ined the
patterns of allelic loss with polymorphic m icrosatellite markers on chromosomes 9p21 (D9S161, D9S171, IFNA ) , regions of putative
tumor supp ressor gene p16, and on chromosome 17p13 ( TP53) , the p53 locus, in matched p rimary and metastatic bladder cancers in 18
patients. A ll patients underwent cystectomy for bladder cancer and were found to have regional lymph node metastases at the time of
surgery. Genom ic DNA was obtained from p rimary cancers and matched synchronous lymph node metastases using a m icrodissection
method. Results The overall frequencies of allelic loss were 78% in p rimary cancers and 89% in paired metastatic cancers. The
frequencies of allelic loss in the p rimary cancerswere 86% with D9S161, 67% with D9S171, 71% with IFNA, and 80% with TP53. The
frequencies of allelic loss in matched metastatic cancers were 100% with D9S161, 62% with D9S171, 71% with IFNA, and 80% with
TP53. An identical pattern of allelic imbalance ( allelic loss or retention) at multip le DNA loci was observed in matched p rimary and
metastatic carcinomas in 16 (88% ) cases. Two case showed allelic loss in the metastases, but not in the p rimary cancers. Conclusion
The patterns of allelic loss at chromosomes 9p21 (p16) and 17p13 (p53) are generally maintained during cancer p rogression to metastasis,
and identical allelic loss in p rimary cancers is conserved in paired metastatic carcinomas. These data suggest that these genetic changes
may be useful in establishing a diagnosis and determ ining tumor origins in difficult cases.
【KEY WO RD S】 bladder tumor; metastases; m icrodissection; tumor p rogression
膀胱癌是泌尿系统最常见的肿瘤 ,其发生率在男
性肿瘤中上升为第 4位 ,在女性肿瘤中居第 8位 ,多
数膀胱肿瘤是移行细胞癌 ,以浸润的方式生长 ,复发
率为 50% ~70% ,大部分肿瘤死因归结于转移灶的进
行性生长 [ 1, 2 ]。最近发展起来的组织显微切割技术使
得从石蜡包埋组织中选择性获取单一肿瘤群体用于
遗传学分析成为可能 [ 3, 4 ]。比较不同生物学特征的肿
瘤细胞亚群详细特征性和遗传改变可为了解肿瘤的
进展及克隆演变提供信息 [ 5, 6 ]。
有报道 [ 7, 8 ]原发性乳腺癌等位基因缺失模式在肿
瘤进展至转移过程中保持不变 ,且转移灶的等位基因
缺失和原发癌保持一致 ,提示大多数等位基因失衡
(A I)可能在转移前就已发生。但对于膀胱肿瘤的转
移是否存在等位基因缺失以及在原发癌中等位基因
的失衡是否与其相应的转移灶保持一致所知甚少 ,本
研究利用显微切割及 PCR扩增技术对原发膀胱癌及
其转移灶中的细胞进行了显微切割 ,分析了等位基因
的缺失模式。
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首 都 医 科 大 学 学 报 第 29卷
1 资料和方法
1. 1 资料
18例膀胱癌病例均来自山西省肿瘤医院 2002年
1月至 2003年 12月经膀胱癌根治术和双侧淋巴结清
扫手术切除标本 ,所有患者手术时均发现有局部淋巴
结转移 ,患者年龄 51岁 ~86岁 (平均年龄 66岁 ) ,按
照 1998年 WHO膀胱肿瘤组织学分类第 2版标准对
膀胱癌进行分级和分期 [ 9 ] ,分级均为高级别的移行细
胞癌。
1. 2 激光显微切割和 DNA提取
对正常淋巴细胞和肿瘤细胞进行显微切割 ,具体
方法如文献 [ 3, 10 ]所述。激光显微切割仪 (Laser cap2
ture m icrodissection, LCM )为 Pixcell Ⅱ 100 (A rcturus
Engineering公司 ,美国 ) ,切割下的细胞立即悬浮于 50
μL显微切割消化液中 ;消化液包含 0. 01 mol/L Tri2
HCl, 1 mmol/L MEDTA, 1% Tween220, 0. 05 g/L蛋白
酶 K; pH8. 0, 37 ℃孵化 48 h,混合液 95 ℃ 10 m in,灭
活蛋白酶 K 2μL作为 DNA
用于 PCR反应。
1. 3 杂合性缺失 (LO H)分析
1) PCR扩增及凝胶电泳方法同前 [ 11, 12 ] :微卫星
引物包括 : 9p21的 D9S161, D9S171, IFNA; 17p13的
TP53。微卫星引物均购自美国 Research Genetic公
司。在 10μL PCR反应体系中加入基因组 DNA (肿
瘤或正常细胞 ) 2μL (约含 DNA 100ng) , 1μL 10 ×
PCR缓冲液 Ⅰ, 1. 0μL 1. 25 mmol/L dNTP,一对引物
各 0. 4 μL, gold Amp li Taq DNA 聚合酶 0. 1 μL,
1μL Ci[α32 2P ] dCTP,加水至 10μL,后 加入 10μL矿
物油覆盖反应液 , 95 ℃变性 10 m in,循环条件为 : 95
℃ 1 m in, 55 ℃~60 ℃ 1 m in, 72 ℃ 1 m in, 35个循环
后 72 ℃延伸 10 m in。
2)聚丙烯酰胺凝胶电泳 : PCR产物用甲酰胺变性
示踪液稀释 2倍 , 95 ℃变性 10 m in,加样 4μL于 6%
变性聚丙烯酰胺凝胶 , 1 600 V电泳 1. 5~2. 5 h,将凝
胶转至滤纸上 ,真空干燥 , Kodak B io Max MR胶片室
温 37 ℃ 24~48 h后观察结果。
3) LOH的判定 :杂和性缺失的判定标准 :相对于
正常淋巴细胞 DNA的一条带密度减少 90%以上时可
判为丢失。微卫星位点的纯合子病例 (即该位点正常
体细胞只显示一个基因条带 )判为无信息病例。有信
息的杂合子病例 (该位点正常显示 2个条带 )分为 2
种情况 ,一种为放射自显影显示 2个密度相似条带 ,
未保留或未丢失 ,另一种则为一个条带丢失即等位基
因 LOH。
1. 4 统计学分析
所有统计学分析采用 SAS软件进行检验和 Mc2
Nemar检验。P < 0. 05为差异有统计学意义。
2 结果
18例膀胱癌均为移行细胞癌。在原发癌和转移
灶中总的等位基因缺失频率均为 89% (16 /18) (表 1,
图 1 )。在原发癌中 D9S161 的缺失频率为 86% ,
D9S171为 67% , IFNA为 71% , TP53为 80% ;在转移
灶中各位点缺失频率分别为 100% (D9S161 ) , 62%
(D9S171) , 71% ( IFNA )和 80% ( TP53)。在原发癌
和转移灶中各位点等位基因缺失频率差异均无统计
学意义 ( P > 0. 05)。没有证据表明在分析的各位点
中存在同源基因缺失现象。相同的等位基因失衡模
式 (等位基因缺失或保留 )存在于 16例病人 ( 89% )
的原发癌和相应转移灶中 ,提示二者有相同的克隆来
源。在余下的 2例 (11% )中 ,一个或多个位点存在不
一致的等位基因丢失模式。如第 1例中 D9S161在原
发癌中没有发生等位基因缺失 ,而在转移灶中发生了
缺失。
图 1 膀胱癌 LO H电泳条带型图
F ig. 1 A lle lic Lo ss p a tte rn o f p ro s ta te ca nce r
A: case 5; B: case 9; N: normal; P: p rimary tumor; M: me2
tastases tumor. A rrow shows A llelic Loss.
3 讨论
肿瘤细胞染色体中某些杂合性位点的等位基因
丢失称为 LOH。一般认为 LOH是肿瘤抑制基因变异
的重要分子特征 ,也是某些正常细胞性质发生转化的
重要标志。不同病理类型的肿瘤 ,在其发生过程中变
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第 1期 李 光等 :膀胱癌等位基因缺失研究
表 1 膀胱原发癌与转移癌等位基因丢失模式的比较
Ta b. 1 Com p a riso n o f a lle lic lo s s p a tte rn in m a rche d p rim a ry a nd m e ta s ta tic b lade r ca nce r
Case No Tumor Age / Sex Grade Stage D9S161 D9S171 IFNA TP53
1 P 52 /M H igh PT3 NL NL NL NL
M 1 NL NL NL
2 P 51 /M H igh PT3 2 1 2 N I
M 2 1 2 N I
3 P 72 /M H igh PT2b 1 NL NL 1
M 1 NL NL 1
4 P 65 /M H igh PT2b 1 1 1 2
M 1 1 1 2
5 P 86 /F H igh PT3 2 2 2 1
M 2 2 2 1
6 P 57 /M H igh PT3 N I 1 2 N I
M N I 1 2 N I
7 P 77 /F H igh PT2b 2 2 N I N I
M 2 2 N I N I
8 P 68 /M H igh PT3 N I NL N I N I
M N I NL N I N I
9 P 57 /M H igh PT3 2 2 2 2
M 2 2 2 2
10 P 54 /M H igh PT3 2 2 2 2
M 2 2 2 2
11 P 66 /M H igh PT3 N I NL N I N I
M N I NL N I N I
12 P 76 /F H igh PT2b 2 2 N I N I
M 2 2 N I N I
13 P 54 /M H igh PT3 N I 1 2 N I
M N I 1 2 N I
14 P 77 /M H igh PT3 2 2 2 1
M 2 2 2 1
15 P 66 /M H igh PT2b 1 1 1 2
M 1 1 1 2
16 P 71 /M H igh PT2b 1 NL NL 1
M 1 NL NL 1
17 P 52 /M H igh PT3 2 1 2 N I
M 2 1 2 N I
18 P 53 /M H igh PT3 NL NL NL NL
M 1 NL NL NL
P: p rimary tumor; M: metastases tumor; N I: no informative; NL: no loss of alleles; 1: loss an upper allele; 2: loss a lower allele.
异的肿瘤抑制基因类型也不尽相同。有的是在肿瘤
早期启动阶段起作用 ,有的则是在进展期恶性演进阶
段才起作用 ,有的还与肿瘤转移及预后有关。
本研究在 18例原发性膀胱癌中发现有 16例在
原发癌及转移灶中存在相同的等位基因缺失或保留
模式 , 2例在转移灶中存在等位基因缺失而在其对应
原发癌中并不发生 ,表明在膀胱癌进展及随后的转移
过程中可能存在相同的等位基因失衡模式 ,研究结果
还表明在肿瘤进展及转移过程中可能会产生额外的
等位基因缺失 ,而在不同位点具有相同的等位基因缺
失 ,表明它们可能来源于同一克隆 ,这一观点已被广
泛接受 [ 6, 13 ]。本研究结果与他人对原发性乳腺癌及
其相应转移灶的研究结果类似 , Bonsing等 [ 7 ]发现在
原发癌中 ,每个等位基因位点失衡均存在于相应的淋
巴结转移灶中 ,提示进展的原发性乳腺癌来源于一个
单克隆细胞并且在所有原发癌和转移灶中建立了足
量的等位基因失衡。Chen等 [ 8 ]在原发性乳腺癌及相
应转移灶中也有相同的报道。而另一研究 [ 12 ]的结果
表明在前列腺原发癌及相应的转移灶中存在高比例
的不一致等位基因缺失模式 (42% ) ,包括在原发癌及
转移灶中分别存在等位基因缺失和保留以及二者丢
失不同的等位基因 ,可能是由于转移灶并非来自所取
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首 都 医 科 大 学 学 报 第 29卷
的肿瘤细胞群体。另有研究 [ 4 - 6 ]表明 ,单独分离的肿
瘤具有不同的遗传组成 ,同个病例的多发性肿瘤可能
是独自产生的 ,但对膀胱癌多个散发灶的 LOH研究
表明它们的单克隆起源 [ 14 ]。等位基因缺失是肿瘤发
生过程中的重要事件 ,同时这些遗传变化将在以后的
分子演变过程中得以保留。M iyao等 [ 15 ]对 14例膀胱
癌及转移灶的研究发现 ,二者存在相同的遗传缺陷 ,
LOH频率 9p为 64% , 17p为 78% ,没有报道丢失保留
方式。因此猜测在膀胱癌进展的不同时期 ,可在染色
体 9p21区及 P53区检测到高度保守的等位基因缺失
模式 ,这将有助于了解膀胱癌转移进展的分子机制。
Hartmann等 [ 16 ]在对膀胱原发癌 ( carcinoma in si2
tu, C IS)和膀胱移行上皮中度非典型增生 (DⅡ)的研
究中发现 ,染色体 9p21区域及 17p13区均可检测到
LOH,其中在原发癌 9p21的 LOH为 86% ,染色体 17p
TP53位点为 84% ;在膀胱移行上皮中度非典型性 (D
Ⅱ)增生 9p21 区 LOH 为 75% , TP53 位点 LOH 为
53%。P53基因突变检出率 C IS为 72% , DⅡ为 67% ,
提示有肿瘤抑制基因 P16和 P53的失活 ,表明在未形
成病理的移行细胞癌之前 ,部分病例已出现了基因水
平的改变 ,提示这 2个区域的 LOH及 P53基因突变
是膀胱癌变过程的早期事件。
总之 ,本研究结果提示在膀胱癌进展及随后的转
移过程中可能存在相同的等位基因失衡模式。转移
癌可在原发癌的基础上进一步遗传演变。因此当转
移癌的原发癌未定来源时 ,这些位点的 LOH可以作
为膀胱移行癌的标志物。
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