6种中药对鲫非特异性免疫效果的影响

第 39卷 　第 1期 Vol139 No11 淡 　水 　渔 　业Freshwater Fisheries 2009年 1月Jan12009 　　收稿日期 : 2008 - 07 - 25 资助项目 : 武汉市农科院院管项目 第一作者简介 : 艾春汉 (1953 - 　) , 男 , 高级工程师 通讯作者 : 邹金虎。E2mail: zoujinhu@1631com ·研究简报· 6种中药对鲫非特异性免疫效果的影响 艾春汉 1 , 邹金虎 2 , 喻运珍 1, 2 , 艾桃山 1, 2 (11武汉市水产科学研究所 , 武汉 　430070; 21武汉中博水产生物技术有限公司 , 武汉 　430070) 摘要 : 将白芍 (Radix Paeon iae A lba) , 五味子 ( Fructus Schisandrae) , 党参 (Radix Codonopsis) , 刺五加 (Radix A can2 thopanacis Sen ticosi) , 黄芪 (R adix A straga li) , 鱼腥草 (Herba Houttuyniae)的醇提取物用生理盐水配成浓度 2%的溶 液 , 胸腔注射鲫 (Carassius auratus)连续 5 d, 每次 012 mL, 探讨了 6种中药对鲫鱼非特异性免疫效果的影响。结 果显示 : 中药组鲫白细胞吞噬活性明显地高于空白组 ( P < 0105) , 几种中药组吞噬活性的高低顺序依次为刺五 加、黄芪、党参、五味子、白芍、鱼腥草、空白组。血清溶菌酶和抗菌活力与空白组比较差异显著 ( P < 0105) , 其活力高低次序为刺五加、黄芪、鱼腥草、党参。白芍、五味子组溶菌酶活力虽低于空白组 , 但经统计表明差 异不显著 ( P > 0105)。经嗜水气单胞菌攻毒后各中药组鲫的死亡率均低于空白组。 关键词 : 鲫 (Carassius aura tus) ; 白芍 ; 五味子 ; 党参 ; 刺五加 ; 黄芪 ; 鱼腥草 ; 非特异性免疫 中图分类号 : S9651117; S948　　　　　文献标识码 : A　　　　　文章编号 : 1000269072(2009) 0120076204 Effect of S ix K inds of Ch inese M ed ic ines on Non spec if ic Im m un ity of C a rass ius au ra tus A I Chun2han1 , ZOU J in2hu2 , YU Yun2zhen1, 2 , A I Tao2shan1, 2 (11W uhan F ishery Science Institu te, W uhan　430070; 21W uhan Chopper F ishery B io2technology com pany L im ited, W uhan　430070) Abstract: In order to study the effect of six kinds of Chinese medicines on nonspecific immunity of Carassius aura tus, A l2 cohol2extract of Radix Paeon iae A lba, F ructus Sch isandrae, R ad ix Codonopsis, Radix A canthopanacis Sen ticosi, Radix A s2 tragali, Herba Houttuyniae were p repared to be 2% concentrated solution in isotonic Na chloride. Then injected them to C1aura tus′s thoracic cavity 5 days successively, 012 mL each time. The result showed that the phagocytosis activity of C1aura tus white cell in blood in Chinese medicine group swere obviously stronger than that in blank group ( P < 0105). The order of phagocytosis activity from high to low among six kinds of Chinese medicine group s was R1A canthopanacis Sen ticosi, R1A straga li, R1Codonopsis, F1Schisandrae, R1Paeon iae A lba, H1Houttuyniae and blank group. Compared with the blank group, significant discrepancy was observed on lysozyme activity and antibiosis activity of serum ( P < 0105). The order from high to low was R1A canthopanacis Senticosi, R1A stragali, H1Houttuyn iae, R1Codonopsis. A lthough lysozyme activity in R1Paeon iae A lba and F1Schisandrae group s were lower than that in blank group, there was no significant differ2 ence between them through statistics analysis( P < 0105). After conteracting toxic, the mortality of Chinese herbal medi2 cine group s was lower than blank group obviously. Key words: Carassius aura tus; R adix Paeon iae A lba; Fructus Schisandrae; Radix Codonopsis; Rad ix A canthopanacis Senticosi; Radix A straga li; Herba Houttuyn iae; nonspecific immunity 　　近年来 , 用于防治疾病的抗生素带来的负面影 响越来越突出 , 一些学者开始从免疫学角度对水产 动物病害防治进行研究。在鱼类病害防治的方法 中 , 在饲料中添加免疫增强剂是增强鱼类免疫功能 的一种有效、实用的方法。 中药具有高效、低毒、低残留等优点 , 其中许 多种类还是很好的免疫增强剂 , 可以提高机体的免 疫水平 [ 1 ]。国外已有的研究发现免疫增强剂均可 提高实验鱼的非特异性免疫能力 [ 226 ]。国内也有研 究表明免疫多糖能提高水产动物免疫水平和增强抗 病能力 [ 7～12 ]。陈孝煊等 [ 13 ]将大黄、穿心莲、板蓝 根和金银花水提取物添加到饲料投喂异育银鲫 , 结 果显示 , 这几种中药能显著提高血液白细胞的吞噬 活性和血清溶菌酶的活性。白芍、五味子、党参、 刺五加、黄芪、鱼腥草是常见的几种中药 , 在人体 中运用较多 , 都具有增强机体免疫力的作用 , 但是 在水产养殖中运用并不多见。本研究用以上几种中 草药醇提取物通过胸腔注射给药的方法 , 分析鲫 (Ca rassius aura tus)机体非特异性免疫指标 , 研究 其提高鲫的免疫力作用机理 , 旨在为鱼类的病害防 治和鱼药的开发提供一些科学资料。 1　材料与方法 111　试验材料 鲫来自于武汉市水产科学研究所养殖基地 , 体 质健壮 , 无病无伤 , 体质量 ( 56 ±315) g, 共 140 尾。试验药物 , 白芍、五味子、党参、刺五加、黄 芪和鱼腥草的醇提取物为湖北中医学院提供。试验 所用的菌种均为武汉市水产科学研究所水产动物疾 病室保存。 112　饲养方法 试验鱼放在水族箱 ( 60 cm ×30 cm ×50cm )中 用充分曝气的自来水饲养 , 每天投喂配合饲料 , 驯 养 7 d后开始试验。实验期间日投喂量为鱼体质量 的 2% ～3% , 每天上下午各喂一次饲料。管理按 常规方法 , 充气饲养 , 保持水中溶氧 510 mg/L以 上 , 水温 (25 ±1) ℃。 113　试验方法 试验分为 6个中药组和 1个空白组 , 共 7组 , 每组设 20个平行 , 每个平行 10尾鲫。将白芍、五 味子、党参、刺五加、黄芪和鱼腥草的醇提取物用 生理盐水配成浓度 2%的溶液 , 每次胸腔注射 012 mL, 空白组注射等剂量无菌生理盐水 , 连续 注射 5 d。试验期间 , 各组鱼按常规方法饲养管理。 114　采血 停止注射后的第 3天 , 从各组中随机取出 5尾 鲫 , 用尾动脉采血法采血。然后将每组所采取的血 液分为 2份 , 其中一份以肝素抗凝 , 制备抗凝血 ; 另一份待其在室温下凝固后 , 制备血清 , 均置于 4 ℃冰箱中备用。 115　白细胞吞噬活性的测定 在 015 mL抗凝血中加人 012 mL金黄色葡萄球 菌 ( Stapylococcus aureu) (含菌量 310 ×108 cfu /mL ) 置于 25 ℃恒温培养箱中振荡培养 1 h, 3 000 r/m in 离心 15 m in, 取沉淀底层物抹片 , 甲醇固定 , 姬母 萨氏染色 , 镜检 , 计数并计算白细胞的吞噬百分比 (phagocytosis percentage, PP)与吞噬指数 ( phago2 cytic index, P I)。 吞噬百分比 = 100个白细胞参与吞噬的细菌100 × 100% 吞噬指数 =被吞噬的细菌总数吞噬细菌的细胞数 ×100% 116　血清活溶菌酶活力的测定 用 01067mol/L的磷酸缓冲液 ( PBS, pH = 614) 将溶壁微球菌 (M icrococcus lysoleikticus) 配制成 012 mg/mL 的菌悬液。取 3 mL该悬液与 50μL待 测血清于试管中混匀 , 测其在 540 nm 处的光密度 值 (A0 ) , 然后置于 37℃水浴保温 30 m in, 取出后 立刻置于冰浴中 10 m in 以终止反应 , 测其在 540 nm 处的光密度值 (A )。杀菌活力按下式计算 : Uk = (A0 - A ) /A0 117　血清抗菌活力的测定 采用 Hultmark 等的方法稍加以改进。用 011 moL /L pH 614的磷酸盐缓冲液从固体培养基 上将荧光假单胞菌 ( Pseudomonas fluorescens)洗下 作为底物并配成 012 mg/mL的菌悬液。取 3 mL该 悬液与 50μL待测血清于试管中混匀 , 测 O1D570 值 A0。然后在 37 ℃温水浴中 30 m in, 取出后放入 冰箱 (4 ℃) 10 m in终止反应 , 测定 O1D570值 A , 抗菌活力按下列公式计算 : Ua = (A0 - A ) /A0 118　攻毒 试验结束后 ,每组鲫胸腔注射浓度 5 ×l08 cfu /mL 嗜水气单胞菌 (Aerom onas hydrophila)活菌液 012 mL。 继续饲养观察 2周 , 随时记录发病症状及死亡情 况 , 对死亡鱼体进行解剖检查、分离细菌 , 确认死 因 , 计算死亡率。 119　数据分析 所得数据采用 sp ss1110统计分析软件进行单 77第 1期 邹金虎等 : 6种中药对鲫非特异性免疫效果的影响 因素方差分析和 Duncan′s多重比较进行统计分析。 2　结果 211　中药对鲫白细胞吞噬活性的影响 6种中药对鲫白细胞吞噬活性的影响见表 1。 结果显示 : 中药组鲫血液白细胞的吞噬活性明显地 高于空白组 , 其中吞噬百分比和空白组比较差异极 显著 ( P < 0101 ) , 且吞噬指数差异显著 ( P < 0105) , 6种中药吞噬活性的高低顺序依次为刺五 加、黄芪、党参、五味子、白芍、鱼腥草、空白 组 , 但各中药组之间无明显差异。 表 1　鲫血液白细胞的吞噬活性 Tab. 1　Phagocytic activ ity of leucocytes in the blood of C1au ra tus % 组 　别 吞噬活性 吞噬百分比 ( PP) 吞噬指数 ( P I) 中 药 组 黄 　芪 5818 ±2112 3178 ±0131 白 　芍 4517 ±1157 2136 ±0126 五味子 5214 ±2114 3158 ±0135 刺五加 6114 ±2164 4173 ±0143 党 　参 5712 ±3121 3106 ±0146 鱼腥草 4216 ±2153 3111 ±0152 空白组 2418 ±1135 2167 ±0121 212　中药对鲫血清溶菌酶活性和抗菌活力的影响 6种中药对鲫血清溶菌酶活性和抗菌活力的影 响见表 2。结果显示 : 其中 6种中药能提高鲫血清 溶菌酶的活力和空白组比较差异显著 ( P < 0105) , 其溶菌酶活力高低次序为刺五加、黄芪、鱼腥草、 党参、白芍、五味子组溶菌酶活力虽低于空白组 , 但经统计表明差异不显著 ( P > 0105)。另外 , 6种 中药能提高鲫血清抗菌活力 , 刺五加、黄芪、鱼腥 草、党参组的抗菌活力和空白组比较差异显著 ( P < 0105) , 白芍、五味子组与空白组之间差异不显 著 ( P > 0105)。 表 2　鲫血清溶菌酶活力和抗菌活力 Tab12　 L ysozym e activ ity and an tib iosis activ ity in the serum of C1au ra tus U /mL 组 　别 溶菌酶活力 抗菌活力 中 药 组 黄 　芪 011022 ±010032 010568 ±010025 白 　芍 010639 ±010026 010414 ±010032 五味子 010698 ±010017 010428 ±010027 刺五加 011024 ±010054 010594 ±010031 党 　参 010816 ±010047 010480 ±010028 鱼腥草 010891 ±010051 010490 ±010017 空白组 010703 ±010043 010410 ±010035 214　攻毒后鲫的死亡率 攻毒后 6种中药对鲫的影响见表 3。结果显示 攻毒后各中药组的死亡率低于空白组 , 刺五加组死 亡率最低 , 依次为刺五加、黄芪、鱼腥草、白芍、 党参、五味子、空白组。由此可见 , 6种中药能提 高鲫抵抗病的能力。 表 3　攻毒后各组鲫的死亡率 Tab13　The m orta lity of C1au ra tus after coun teracting tox ic % 组 　别 死亡率 中 药 组 黄 　芪 21 白 　芍 34 五味子 43 刺五加 18 党 　参 36 鱼腥草 24 空白组 57 3　讨论 中草药中有效活性成分主要是多糖、皂甙、生 物碱、蒽类、挥发油和有机酸等 , 其与动物免疫功 能密切相关 , 均能提高机体组织、器官的屏障防御 能力 [ 14 ]。检测具有吞噬功能细胞的吞噬能力和血 清溶菌酶的活力 , 可评测鱼类非特异性免疫的能 力。动物体内的吞噬细胞可吞噬进入体内的异物 , 在动物体的非特异性免疫中发挥重要作用 , 吞噬细 胞在消化病原生物的同时 , 可保留有关的抗原信息 并将其传递给有关的淋巴细胞 , 从而激发机体的体 液免疫和细胞免疫。因此 , 吞噬细胞的吞噬活性直 接与动物的免疫机能有关。本研究表明中药组鲫白 细胞的吞噬活性明显地高于空白组 , 其中刺五加组 的吞噬活性表现出最高。很多学者研究表明微生物 多糖和中草药多糖能提高吞噬细胞的吞噬能 力 [ 7, 9211, 16 ]。刺五加、黄芪、党参、五味子的主要 活性成分都含有多糖 , 本次试验结果可能是这几种 中药不同成分的多糖发挥了功效。白芍和鱼腥草组 和其他几种中药组比较白细胞吞噬活力较差的原因 可能是白芍的主要活性成分是白芍总甙 , 鱼腥草的 主药用成分为鱼腥草素 , 而这些物质对提高吞噬细 胞的活力不是很明显。 溶菌酶主要针对革兰氏阳性菌发挥作用 , 对一 些革兰氏阴性菌如嗜水气单胞菌也有作用 , 溶菌酶 的活性是决定吞噬细胞对所吞噬的致病菌能否被杀 灭的物质基础之一 [ 17 ]。本次试验表明这几种中药 87 淡 　水 　渔 　业 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2009年 能提高鲫血清溶菌酶的活力和抗菌活力 , 白芍、五 味子表现的效果较差。出现这种结果的原因 , 可能 是由于这两种中药的醇提物的活性成分含量高反而 对溶菌酶活性起到了一定的抑制作用。 攻毒试验表明这 6种中草药可提高鲫抵抗嗜水 气单胞菌的感染 , 能降低死亡率。由此可见其中 6 种中药能显著提高鲫免疫力 , 增强抗病能力 , 但是 在作为水产添加剂时 , 提取工艺、合适的添加量以 及投喂的时间频率要待进一步的研究。 参考文献 : [ 1 ] 谢仲权 , 牛淑琦. 天然植物饲料添加剂生产技术与质量标准 [M ]. 北京 : 中国农业科学技术出版社 , 2005: 23228. 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