非人灵长类动物体外受精－胚胎移植经验中的饲养管理

非人灵长类动物体外受精－胚胎移植经验中的饲养管理 　　　　非人灵长类动物和人在生殖生物学方面有着众多相似之处，目前已被广泛应用于生殖医学的研究，如配子成熟和受精、着床前后胚胎的发育、胚胎 － 母体间的交换及黄体调节等多个方面。非人灵长类的体外受精 － 胚胎移植技术为保护珍稀濒危灵长类和提高实验灵长类动物的质量提供了一条新途径。为确保资源的合理化应用以及实验的顺利开展，制定体外受精 － 胚胎移植实验用猴相应的管理措施十分必要。根据本中心对非人灵长类动物 ( 恒河猴、食蟹猴) 开展体外受精 － 胚胎移植研究的经验，对动物饲养环境条件、日常饲喂管理、实验中管理及术后治疗方面的措施进行了探讨，将为相关科研工作者提供参考依据。 　　1 饲养环境条件 　　非人灵长类动物如恒河猴 ( macaca mulatta) 具有明显的繁殖季节性，在开展非人灵长类动物生殖实验前有地把有季节性要求的动物实验时间安排在繁殖季节，从而便于实验的顺利开展。在实验中通过腹部切口施行取卵手术、胚胎移植手术，为使动物在术前及术后得到合理及人性化照顾，非人灵长类动物饲养室需设置在具备送排风空调系统的普通环境中，饲养室应控制好温度 ( 16 ～ 26 ℃) 、相对湿度( 40% ～70%) 等环境因素，针对开展生殖实验的特殊性和本中心工作实践经验，动物饲养室环境温度在达到要求的基础上可将饲养室温度升至 ( 20 ～ 26℃ ) ，则可有效保证动物在手术后的保温及体能的恢复。非人灵长类动物实验中采用不锈钢笼具单只饲养，笼具在保证动物舒适和卫生前提下，也要便于实验人员开展采血、给药及抓取等实验操作。 　　2 日常饲喂管理 　　对不同生长时期及不同生理阶段的实验猴应制定不同的饲养管理规程，对于体外受精 － 胚胎移植实验用猴，除了提供合格的饲料和饮水以外，还需要针对开展生殖实验的特殊性，根据实验进程制订适宜的饲养管理规程。首先，个别动物在注射促排卵药物后会出现轻微的胃肠道不适，如腹泻、食欲减退等情况，同时为减轻动物手术损伤的不良反应、增强动物体质、提高胚胎移植的成功率，需对动物饮食结构进行调整。每日补充青饲料，如苹果、青枣及香蕉等新鲜水果，饲喂量为每天 30 ～ 40 g/只。其次，调整饲喂次数及时间，把每日三餐改为每日四餐，早点饲喂时间 8: 00 ～8: 30、午餐蒸糕饲喂时间 11: 00 ～11:30、青饲料饲喂时间 13: 30 ～ 14: 00、晚餐饲喂时间16: 30 ～ 17: 00。蒸糕和熟料均由全价配合饲料混合制作而成，是在保证饲料营养成分的前提下改善饲料的适口性。可把午餐由颗粒饲料改为蒸糕，晚餐改为熟料。在把全价混合粉料加水蒸制过程中便于鲜鸡蛋或其它营养成分的补充，可按照 1 kg 混合粉料添加60 ～ 80 g 鸡蛋的量进行补充，达到为实验猴提供充分营养保障的目的。 　　3 实验中对动物的管理 　　3. 1 对动物的要求 除具备相应的级别及合格证以外，雌猴还需具备繁殖能力。选用已生产过、具有完整个体档案资料的母猴，其资料包括年龄、怀孕次数、生产胎次、哺乳情况、健康状况，资料越详尽越好。雄猴需采精观察其精子的数量和活力，确认其具备繁殖能力后选用。 　　3. 2 月经观察及记录 促性腺激素释放激素激动剂( GnRH － a) 、尿促性素 ( HMG) 等促排卵药物的注射时间、注射剂量与月经周期的开始时间及周期长短密切关联，并且促排卵的选择及胚胎移植时间点的选取也需要参考详细的月经周期资料。因此，对体外受精 － 胚胎移植实验用猴月经的观察和记录也是实验中的重点。据报道，在单笼养条件下，恒河猴全年行经，其月经周期及月经期随季节变化明显，月经周期长短不一，出血量也有不同表现。所以，不同的非人灵长类动物个体具有不同月经周期表现。在实验中需要准确观察和记录月经周期，建立 《实验猴个体月经记录》，内容包括实验猴编号、观察到月经的日期、持续天数等。在注射促排卵药物或胚胎移植前需要有两个完整的月经周期记录，这些资料的获得有助于对动物生理周期的长短、是否规律及差异等信息进行详细了解，对后期实验方案有积极指导作用。 　　3. 3 月经观察方法 通常情况实验猴月经可方便观察到，在每天早上动物饲养室还没有用水清洁前仔细观察粪尿盘上排泄物情况，可看到较为清晰的血迹。 　　看到血迹后需要对是否是月经进行确认，以防止是局部外伤如手指、脚趾的出血引起的混淆。但对于有些月经量较少不宜观察的动物，可使用棉签进行观察。 　　先用生理盐水把高压灭菌处理过的医用棉签湿润，用止血钳夹住木棒一端，把棉签轻轻插入阴道后取出，观察月经情况。如果棉签上附着鲜红或暗红色血迹则判断为月经，并把观察到的日期作为月经周期的第 1天。此种方法简单易行并且直观，可根据动物阴道分泌物情况采取隔日观察或连续观察的方式。在月经周期不同阶段，某些性激素水平、阴道涂片等也发生规律性变化，也可借助阴道涂片或测定性激素水平等方法来观察月经周期。 　　3. 4 促排卵药物的注射 在猴生殖实验中能够获得大量胚胎来源的方法仍为超数排卵，超数排卵一次可得到多个质量较好的卵，有效执行超数排卵方案依然是胚胎移植成功的先决条件。非人灵长类动物多选用人类辅助生殖技术中所使用的药物，常用药物有促性腺激素释放激素激动剂 ( GnRH － a) 、人绒毛膜促性腺激素 ( hCG) 、注射用尿促性素 ( HMG) 等。实验中根据需要好促排卵方案后，安排专人负责落实，负责药物的配制、注射。如 HCG、FSH 多为冻干粉剂，在稀释过程中严格遵循配制要求，保证达到所需浓度。因每瓶药物的使用单位较大，在稀释配制药物过程中需要把已稀释好剩余的药液放入专用药品保存箱内保存，下次使用前遵循先配先用的原则使用。 　　方案执行人严格遵循促排卵方案中药物注射时间点、注射剂量的控制，并把动物注射后出现的不良反应或异常情况及时反馈给实验负责人，以便对动物采取针对性治疗措施。 　　4 护理及治疗 　　4. 1 由于促排卵是一个非生理过程，给动物带来一定的副反应，实验雌猴在促排卵过程中主要表现为胃肠道不适如腹泻、食欲减退，除了多补充新鲜水果外，还可口服乳酶生、乳酸菌素片等药物改善其不适状况。雄猴通过电刺激采精仪，用直肠刺激的方法进行精液的采集。为减少动物直肠粘膜的损伤，在采精后 2 周内也要多补充新鲜水果，防止直肠脱出等并发症的发生。 　　4. 2 在实验中通过腹部切口进行手术取卵或胚胎移植，麻醉药种类及剂量需要重点关注。使用速眠新 II( 0. 08 ml/kg) 肌内注射作为首次麻醉，根据手术过程中动物反应追加注射氯胺酮 ( 0. 1 ml/次) ，追加总量不超过 0. 1 ml/kg，在手术中取得了较好的麻醉效果。每次手术前需给猴称体重，根据体重调整使用剂量，对每只猴每次使用的药量进行详细记录。麻醉前实验猴要禁食 12 h，使胃排空。实验结束后实验人员将实验猴侧放回笼，确保其呼吸道畅通，注意观察实验用猴的呼吸状态，待其清醒后方可离开。 　　4. 3 术后抗感染治疗。腹部手术创面缝合后需要在缝合创口涂抹消炎止痛药膏，以减轻动物局部创口的不适，避免动物苏醒后撕咬伤口。术后治疗周期中需要密切观察伤口愈合情况及动物精神状况，可使用青霉素钠肌肉注射，一天 2 次，连续注射 3 ～5 d，同时可补充维生素 C 注射液，通常 7 d 后可以对手术创口进行拆线。术后实验猴抗感染或并发症治疗的常用药物见表 1，使用中根据其体重和异常生理状况对药物用量进行增减和选择。对于胚胎移植的实验猴，治疗应在减少对动物干扰的前提下进行。移植后密切观察动物是否出现阴道出血、腹痛等不适。【表1】 　　5 小 结 　　非人灵长类动物为人类医学基础研究、揭示人类生命现象的本质和疾病机理提供了理想的动物模型，其体外受精 － 胚胎移植实验的开展对下一步转基因动物模型的开发起到积极的推动作用。随着非人灵长类动物在医学研究中的广泛应用，合理化管理实验用猴及实施动物福利越来越重要。在此前提下，实验人员和饲养人员应最大程度地给予体外授精 － 胚胎移植实验用猴关爱，采取正确和有效的管理措施，从环境条件、日常饲喂管理、实验中及术后对动物的护理几个方面加强对动物的照顾，把每个环节的工作做好做细，并严格实施相关 SOP ，达到既能保障实验顺利进行，又能提高实验猴管理质量的目的。目前本中心已开展的实验表明，在体外受精 － 胚胎移植实验中环境条件及饲喂管理是基础，手术中对动物的照顾及术后的预防性治疗是重点。采取合理治疗措施，避免并发症的发生，对促排卵实验猴可达到快速恢复生理周期的目的，对后续实验的开展起到积极和有效的促进作用。 　　参 考 文 献 　　［1］ 季维智，邹如金，商恩缘，等 . 非人灵长类在生物医学研究中的应用及其保护 ［J］ . 动物学研究，1996，17 ( 4) : 511 －5l3. 　　［2］ 季维智，杨上川，陈建春，等 . 非人灵长类的体外受精和胚胎移植 ［J］ . 动物学研究，1993，14 ( 3) : 283 －284. 　　［3］ 魏泓 . 医学实验动物学 ［M］ . 成都: 四川科学技术出版社，1998: 202 － 203. 　　［4］ 中国医学科学院医学实验动物研究所，中国质检出版社第一编辑室 . 实验动物汇编 ［M］ . 北京: 中国标准出版社，2011:330 － 387. 　　［5］ 杜永洪，陈迅，赵卫华，等 . 笼养恒河猴的月经生理研究 ［J］ .重庆医科大学学报，1998，23 ( 1) : 27 －29.