Aβ25-35致PC12细胞核酸、蛋白质氧化损伤及依达拉奉的保护作用

Aβ25-35致PC12细胞核酸、蛋白质氧化损伤及依达拉奉的保护作用 Aβ25-35致PC12细胞核酸、蛋白质氧化损 伤及依达拉奉的保护作用 --—— 1438?--—— 文章编号:1007—4~(2oo6)12—1438—03 AI325—35致PC12细胞核酸, 蛋白质氧化损伤及依达拉奉的保护作用 周小平.,陈加俊,于明,邬英全2 (1.江苏大学附属人民医院,江苏镇江212000;2.吉林大学中日联谊医院神经内科) 摘要:目的研究依达拉奉对淀粉样p蛋白25—35(A一)诱导的PC12细胞核酸,蛋白质氧化损伤的保护作用. 方法实验对象分为三组:依达拉奉保护组(依达拉奉20/m~ol/L.A一30m~d/L),25—35干预组(A.30 V.,not/L)和正常对照组.采用MTr法测定细胞生存率;慧星法测定DNA单链损伤;ErJgA法测定羰基蛋白含量;比色法 测定羟自由基(.OH)并计算,oH清除率.结果与正常对照组相比,A一干预组细胞生存率降低.DNA单链损伤明 显加重,细胞内羰基蛋白含最升高(|P均<O.001).依达拉奉保护组与A一干预组相比,细胞生存率明显升高,DNA 单链损伤明显减轻,细胞内羰基蛋白含量减低(P(O.001或P(0.01),但 都未达到正常水平.依达拉奉对.OH的有 效清除率可高达79.98%.结论依达拉奉能够通过清除.OH来减轻 DNA损伤.并能减少细胞内蛋白质氧化产物的 生成,具有神经保护作用. 关键词:依达拉奉;淀粉样蛋白;PC12细胞;氧化性应激 中囤分类号:I订42.89文献标识码:A Nudeieaddandp-喇 noxidativedamageofPCl2cellshtduealA.35andmmroprot~veeffectofEI|a髓 呲ZHOU p孵.删.na-~,lq./埘岵,再.(删 Ne,theinterventionp(.30~mol/L)andthenormalgroup.Surdvalmte P’:l2oellswdetectedbyM1TaS~ly8,asaeaamemofDNAda啪萨 bycometassay,8确thecontentproteinead~ylandhydroxy radical(.OH)byehlmmtomeUy,andtheclearancerateof.OHwascalculated. ResullsThecontentffintmeellularpl~ancm’hot~l intheinterventiongroupwithA一 35higherthanthoseintheIltOlmS!group,andDNAdaII1日 gewassignificantlyiw..,eased,? didsurvivalrate0fPCI2cell(尸 <O.001,al1).c0withtheinterventiongroupwithA.35tthecontentintracdlda rpro- teincahx~linthepm-treaUnentgroupwithEdaIav0IIew啪lowered8rIdDNAda删|gewassig,atlcantlylessened,butsurvivalr’ateof PC12cellswas0b(P(O.001,饼尸 <O.01).TheeffectivedearanecmteofEiJl~-,coneto.OHreael~upto79. 98%.cI删出 Isi?Ed~vo1.1eischaracteristicneuropmtoctiveeffectwhichitcarlreduceDN Ainjmyandthecontentofprotein0口【- idativepl砌IlclintheP’:l2cellsinducedbyAtlmmghleaIliIlgupdIDxyradica1. Keyw0”ls:edaravone;myloldbetaprotein;PC12cdls;~idmivestress 阿尔茨海默病(Ai~eimer’sDisease,AD)是特发 于老年人群的原发性退行性脑病,其具体的发病机 制尚不清楚,但由于具有清除自由基作用的褪黑素, 银杏叶提取物有减慢AD的病变过程,使得自由基 损害假说受到越来越多的关注….Vamdamjan等用 邶(1-42)制成AD动物模型,在脑组织中加入N-tea- butyl-phenylnitrone(PBN)作为捕获物,通过电子顺磁 共振实验检测出邶产生的羟自由基(.OH)信号,证 明邶可以诱导.OH的产生,产生的.OH又可以攻 -通讯作者 (C2ffaJLab嘶,2OO6,10:1438) 击细胞内的成分如核酸,蛋白质,引起广泛的氧化损 伤【2】.依达拉奉是一种特异性清除.OH的神经保 护剂,其通过强烈的自由基清除作用对AD的防治 是否有效国内外尚未见报道.本文通过对依达拉奉 对淀粉样p蛋白25—35(A/~s35)诱导的PC12细胞 核酸,蛋白质氧化损伤机制进行研究,以期为临床防 治AD提供理论依据. 1材料和方法 1.1材料?细胞株鼠嗜铬细胞瘤株PCI2细胞 由吉林大学第一医院神经内科胡林森教授惠赠.? 2OO6年l2月第l0卷第l2 药品和主要试剂:(首都医科大学宣武医院多 肽室);依达拉奉(商品名毕存,南京先声东元制药有 限公司,批准文号:国药准字H20031342);DMEM,胎 牛血清(美国Gibico公司);牛血清白蛋白,胰蛋白 酶,羊抗兔,小鼠tgE抗DNP单克隆抗体,DMSO, 四唑盐,邻苯二胺OPD(Sigma公司);与辣根过氧化 物酶偶联的大鼠抗小鼠IgE抗体(美国SBA公司); TMB酶底物(美国Bio—Rad公司);慧星法试剂盒(美 国vigen公司);羟自由基测试盒(南京建成生物 工程研究所). 1.2细胞培养将PC12细胞培养在含10%胎牛血 清,2mn~l/L谷氨酰胺,100U/ml青霉素及100U/ml 链霉索的DMEM培养基中,于37?,5%Co:的孵箱 中培养.3,4d传代1次,隔天换液1次. 1.3细胞干预处理及分组慨-35用高压灭菌的 三蒸水配成浓度为1mmol/L,分装置于一20?冰箱 中保存,临用前调整为三种终浓度:2o,30,4ottmol/ Lo依达拉奉用PBS配成浓度为2Hd,置于4c【= 冰箱内保存,临用前调整终浓度为10,2o,30I~nol/ L.最初将细胞分为3大组,l0小组:依达拉奉保护 组(6小组:依达拉奉分别为10,20,30gmol/L,各预 处理1h和12h后,再分别加入-3530pmol/L), -35干预组(3小组:一3520,30,40pmol/L)和 正常对照组,进行rr实验(见下),结果显示:随着 一 35浓度的增加,细胞活力下降,ICs0大约为30 pmol/L;依达拉奉在预处理12h且浓度为20tunol/L 时发挥着强大的神经保护作用.故我们再次将细胞 分为3组:依达拉奉保护组(依达拉奉20gmol/L, 一 3530wnol/L),如一35干预组(.30wnol/ L)和正常对照组,来进行氧化指标的检测. 1.4四唑盐比色实验(MTT)将对数期生长的 PC12细胞消化,计数,以1×104/weU密度接种予96 孔培养板上,共设1O组,每小组6复孑L,使各孔细胞 数基本相同.孵育24h后,弃去原培养液,正常对 照组加入含2.5%胎牛血清的DMEM维持液,另两 大组按分组情况加入干预因索.继续孵育24h后, 弃培养液,每孔加入MTr10,孵育4h.弃上清 液,每孔加入DMSO100,振荡10min使结晶充分 溶解.酶联免疫仪570nna波长检测各孔吸光度(A 值). 1.5DNA单链损伤的检测采用慧星法(亦称单 个细胞凝胶电泳法)【3l.细胞悬浮液(1xl(~/m1)与 低溶点琼脂糖混合后直接加到载玻片上,4?放置 10min,然后将载玻片浸入裂解液中,4?放置6o ?--—— 1439’-_—— rnin.再将载玻片浸入新鲜配制的碱性裂解液(1 mmol/LEDTA.Na2,300mn~l/LNaOH,pH>12.0)中, 室温放置20min.用1×TIlE缓冲液冲洗2次,每次 5rain.将载玻片放入电泳槽中.用相同的缓冲液 电泳10min,电压为1V/era.完毕后将载玻片浸入 酒精中5min,取出后空气干燥.干燥后的载玻片用 SYBRGreen染色,5Otd/孔.单细胞DNA损伤用荧 光显微镜观察,随机至少100个细胞.根据慧 星尾巴长度,DNA损伤的程度被分成5级(0—4)【4J, 全部损伤记分为0,100,200,300和400. 1.6羰基蛋白的测定采用ELISA方法【5J.首先以 氧化的牛血清白蛋白(BSA)作为羰基蛋白的. 用Cu2/H2O2(50Ommol/L;5retooL/L)氧化BSA产生 羰基蛋白,通过比色法测定其含量.细胞干预处理 后,收获并裂解各组细胞与10nunol/LDNPH(溶于 2NHCI)在室温反应1h.用7%三氯乙酸沉淀蛋白 后.用BCA法测定蛋白.用于ELISA的标准曲线由 氧化的BSA与未氧化的BSA按一定比例混合(0— 40%)测定.检测样品与标准均每孔100l加到96 孔酶标板中4?过夜.用含0.1%Tween20的PBS 冲洗后,样品孔中加入一抗(小鼠抗一DNP抗 体),37~C放置4h后加入二抗(酶标抗体),最后加 入TMB酶底物溶液反应3min,用稀硫酸终止反应. 用酶标仪450nrtl处读取数据. 1.7羟自由基清除率的测定采用南京建成生物 工程研究所活性氧试剂盒. 1.8统计学分析应用SPSS13.0软件,结果采用均数 ?标准差(i?s),进行t检验(5次独立实验的结果). 2结果 2.1依达拉奉清除?OH的效果 依达拉奉对?OH的清除效果与依达拉奉的含 量有一定的关系,当依达拉奉浓度为1tunol/L时, 对?OH的清除率为58.74%;随着依达拉奉浓度的 增加,?OH清除率逐渐增加,当依达拉奉的浓度为 20wnol/L时,?OH清除率可高达79.98%;当依达拉 奉的浓度超过20wnol/L以上,随着依达拉奉浓度 的增加,?OH清除率又逐渐降低.这提示依达拉奉 对?OH有较好的清除效果,但却存在着量效关系. 2.23组细胞生存率,DNA单链损伤程度及羰基蛋 白比较见1. 3讨论 由于中枢神经系统具有高的耗氧量,含有丰富 的多种不饱和脂肪酸,且抗氧化酶相对缺乏,因此, 神经系统非常容易受到自由基的攻击.由于作为最 一 l440, 表13组细胞生存率,DNA单链损伤 程度及羰基蛋白比较 依达拉奉预处理组与正常对照组比较,P值均大于0.晒;A 干预组与正常对照组比较,P值均小于O.001;依达拉奉预处理组与 A一干预组比较,?P<O.001.?表示P(O.01 活泼的活性氧自由基可以与任何生物分子以极快的 反应速率发生反应致使细胞组成成分受到破坏而备 受关注,特别是作为生物体危害最大的氧自由基一? OH显得尤为突出.?OH不仅对蛋白质,脂质,糖类 等可引起不同程度的损伤,其对DNA的氧化损伤也 越来越得到科学界广泛地认可l6J.大量证据表明, AD患者脑内老年斑和神经纤维缠结中的DNA,蛋 白质等氧化产物显着增加,提示自由基所介导的氧 化损伤反应参与了AD患者特征性病理结构的形成 过程[71.研究证实,氧应激或衰老时细胞羰基蛋白 含量增加,蛋白功能受损;且可以用羰基蛋白作为活 性氧介导的蛋白质氧化的标志.AD患者脑中以 NETs积聚的聚合是通过蛋白质氧化形成的,脑 中蛋白羰基含量明显增加,且羰基含量与NVrs积聚 成正比8.近年来研究还发现AD患者脑内存在着 DNA损伤,甚至在AD发病的早期就可以出现l9J. 这一切都提示了蛋白质和DNA氧化损伤在AD的发 病过程中起着重要作用. 在本实验中,应用MTT法观察不同浓度A一35 (2o,3o,40/m~oVL)的毒性作用,发现随着A浓 度的增加,细胞活性下降,IC50大约为30tmlol/L;而 应用不同浓度的依达拉奉(1O,20,30pmol/L)可以拮 抗A一35的毒性,在20~noVL以下随着A一35浓 度的增加,其保护作用增强,但浓度高于20maoVL, 依达拉奉药物自身的毒性作用增加而保护作用反而 __ ChinJl丑bDi,December,2O06,,瑚1O.No.12 减弱.所以我们将如一35和依达拉奉的浓度分别 定为30t~mol/L,20/~oVL进行试验研究.本研究 结果显示:与正常对照组相比,A一35干预组DNA 单链损伤明显加重,细胞内羰基蛋白含量升高;而经 过依达拉奉保护后,DNA单链损伤明显减轻,细胞 内羰基蛋白含量减低,细胞生存率也有所提高,这表 明依达拉奉能够通过抑制核酸和蛋白质氧化来发挥 神经保护作用. 综上所述,我们认为氧化应激在AD的发生,发 展过程中起着重要作用;依达拉奉作为一种新型的 自由基清除剂,可以通过清除.OH,抑制核酸和蛋白 质氧化作用而发挥抗氧化作用,从而在防治AD方 面起着一定的积极作用. 作者简介:周小平(1957一),男,副主任医师,神经内科主任. 主要研究方向为痴呆发病机制及药物治疗. 参考文献: [1]G订?卜sIY,Mdm~edE.OffmD.Ad唧哇雠曲n眦inAl=丘’8 dise~e:删gt咖[J].JMdNeumsd.201~;21(1):1. 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