腺病毒扩增
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在 293细胞中大量扩增腺病毒
一旦重组病毒已被纯化和鉴定,即可在 293 细胞中进行大量扩增。本手册提供了递增培养规模和腺病毒
感染周期的基本方法,按这一方法最终得到的病毒量约为 3×1011~3×1012。由于一个细胞中所含的病毒颗粒
为 1000~10000,因此 1L培养细胞可得到约 5×1012病毒颗粒。如果要把病毒用氯化铯梯度离心纯化,则必
须至少 3×108的细胞,这样才能正确分辨出病毒带。对于蛋白表达,则根据需要可在任何一步扩增步骤中停
止,离心沉淀细胞后按照适当的操作方法进行蛋白抽提(根据蛋白类型的不同抽提上清或细胞沉淀)。为优化
时间进程,每个感染周期必须与下一次细胞扩增培养同步。如果由于各种原因不能同步,则必须将病毒冻存,
直至下一次细胞培养开始后再融化病毒。注意每次扩增都将会剩下一些病毒,这些病毒先不必丢弃,以便下
一步扩增失败时备用。每次扩增最好都用最低代的病毒颗粒,这样产生突变型病毒的可能性会大大降低。
操作步骤:
1. 在 100mm培养皿或 75cm2培养瓶中加入 10ml DMEM5%培养 5×106 293细胞。
2. 取 0.5ul首次扩增的病毒保存液,加入 DMEM5%至 1ml,混匀,这样稀释得到的 MOI 值约为 5。
3. 移去培养液,小心加入病毒混合液,切勿破坏细胞单层,十字形慢慢晃动 3次,37℃ CO2孵箱中培养 90
分钟。
4. 加入 9ml DMEM5%。
5. 再培养 72小时,这时在 10ml溶液中大约有 5×109~5×1010个病毒颗粒,进行 MOI 测定以估计病毒颗粒。
注:如果此时得到的病毒量已足够,可立即进行病毒滴度测定。收集细胞,600×g离心 5分钟沉淀细胞,
去上清后加入最小体积(一般为原始体积的 1/10即 1ml)病毒保存溶液重悬细胞。-200C /370C冻融 3
次,台式离心机上以最大速率离心去除细胞碎片,收集上清,然后进行病毒滴定。
6. -20℃/37℃冻融 3次。
7. 转入 15ml无菌离心管中,台式离心机上以最大速率离心 10分钟,收集上清冻存于-20℃或-80℃。
8. 3个 175cm2培养瓶中各加入 107 293细胞进行培养。
9. 将 3ml细胞裂解液上清加入 12ml DMEM5%中,混匀。移去细胞培养液,每瓶小心加入 5ml混合液,十字
形慢慢晃动混匀 3次,370C 5%CO2孵箱中培养 90分钟。此时 MOI值约为 25。
10. 加入 DMEM5%至 30ml。
11. 再培养 48~72小时。此时 10ml培养液病毒量约为 3×1010~3×1011。若需要,进行 MOI 测定以估计病毒
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滴度。
注:如果此时病毒量已可以满足实验所需,则可立即进入病毒滴定步骤。600×g离心 5分钟收集细胞,
弃上清,加入 1/10原始体积的溶液重悬细胞。-200C /370C冻融 3次,台式离心机上以最大速率沉淀
细胞碎片,收集上清,进行病毒滴定。
12. 移入 50ml离心管中,台式离心机上最大速率离心 10分钟,取出上清保存。
13. 30瓶 175 cm2培养瓶中每瓶各加入 107 293细胞。
14. 将 45ml细胞裂解液上清加入 105ml DMEM5%混匀,从培养瓶中移去培养液,加入 5ml混合液感染细胞,
十字形缓慢晃动 3次混匀,370C培养 90分钟。此时 MOI值约为 25。
15. 加入 DMEM5%至 30ml/瓶。
16. 再培养 48-72小时,此时约有 3×1011~3×1012个病毒。若需要,进行 MOI测定估计病毒滴度。
如果要收集病毒颗粒,先收集被感染细胞,然后重悬在 5ml DMEM5%中。-200C /370C冻融 3次,离
心沉淀细胞碎片。此时 5ml DMEM5%中 3×1011~3×1012个病毒颗粒,浓度为 6×1010~6×1011vp/ml。然
后测定病毒滴度,或者用标准的氯化铯密度梯度离心法纯化病毒。
在 109细胞中扩增病毒可获得大量病毒保存液,而在 1010细胞中扩增则有一定技术性。切勿将扩增
后的病毒保存液再用来感染细胞,因这会大大增加 RCA产生量。有时不得不使用纯化空斑以最大可能降
低 RCA产量。如果已没有纯化的空斑,那么就不得不重新空斑纯化重组病毒,鉴定克隆后再进行扩增。
如果需要大于扩增 4轮后的病毒量,注意请用早期的病毒作为扩增源。比如,用第 2代病毒产生第 3代病
毒。如果没有第 2代病毒,那么必须用第 1代病毒来产生新的第 2代病毒。按这个原则进行扩增可使 RCA
水平尽可能低。
如果用于表达蛋白,则可以收集细胞后根据蛋白特点选择适当方法抽提蛋白。细胞沉淀中一般可提取
1-5mg蛋白,建议在小规模扩增后先测定感染后抽提蛋白的最佳时间,然后再大量扩增蛋白。
腺病毒扩增
第一代 第二代 第三代 第四代
每瓶细胞数 1×105 5×106 1×107 1×107
培养瓶大小
(cm2)
75 175 175
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培养瓶数 24孔板 1孔 1 3 30
感染来源 稀释的空斑
首次扩增后的病
毒保存液
第二代病毒 第三代病毒
每瓶接种量 0.1 mL
0.5 mL或
2.5×107
1 mL 1.5 mL
总培养体积 1 mL 10 mL 90 mL 900 mL
MOI 0.01 5 25 25
滴度(VP/mL) 1×108~9 5×108~9 3.3×108~9 3.3×108~9
总病毒量 1×108~9 5×109~10 3×1010~11 3×1011~12
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