重楼总皂苷对人肺癌细胞A549的增殖抑制作用及对细胞周期的影响
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重楼总皂苷对人肺癌细胞A549的增殖抑制作用及
对细胞周期的影响
陈志红龚先玲刘义
摘要 目的:研究重楼总皂苷对人肺癌细胞A549的增殖抑制作用及对细胞周期的影响。方法:用MrI-r
法测定重楼总皂苷对A549细胞的增殖抑制率;Hoechst.PI双染观察细胞形态学变化:流式细胞术测定重楼
总皂苷对A549细胞周期时相分布的影响。结果:重楼总皂苷能抑制A549细胞的增殖,其作用呈明显的时间
和剂量依赖性;Hoechst.PI双染显示细胞凋亡特征;重楼总皂苷使A549细胞被阻滞在...
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重楼总皂苷对人肺癌细胞A549的增殖抑制作用及
对细胞周期的影响
陈志红龚先玲刘义
摘要 目的:研究重楼总皂苷对人肺癌细胞A549的增殖抑制作用及对细胞周期的影响。方法:用MrI-r
法测定重楼总皂苷对A549细胞的增殖抑制率;Hoechst.PI双染观察细胞形态学变化:流式细胞术测定重楼
总皂苷对A549细胞周期时相分布的影响。结果:重楼总皂苷能抑制A549细胞的增殖,其作用呈明显的时间
和剂量依赖性;Hoechst.PI双染显示细胞凋亡特征;重楼总皂苷使A549细胞被阻滞在S期。结论:重楼总皂
苷对A549细胞的增殖有较强的抑制作用.明显影响细胞周期时相分布。
关键词肺肿瘤;重楼;皂苷类; 细胞增殖; 细胞周期
EffectofsteroidalsaponinsfromP.poiyphyUaonproliferationandcellcycleofA549cellsCHENghi—hong‘.
GONGXian—ling,LIUYi.幸AnalysisCenter,Guan#o昭MedicalCollege,Zhanjiang524023,China
【Abstract】ObjectiveTostudytheeffectofsteroidalsaponinsfromPpolyphyllaonproliferationandcell
cycleofA549cells.MethodsTheinhibitionrateofsteroidalsaponinsfromP.pobphylmforA549cellproliferation
wasdetectedbyM,rI'.ThemorphologicalchangesweredeterminedusingHoechst-PIstaining.Theeffectofsteroidal
saponinsfrom只polyphyllaonthecellcycleofA549Wagobservedbyfloweytometry.ResultsSteroidalsaponins
fromP.po切hyllainhibitedthecellproliferationofA549cellsinadose-andtime—dependentmanner.Hoechst-PI
stainingshowedthefeaturesofapoptosis.A549cellstreatedbysteroidalsaponinsfromPpolyphyllawereblockedin
Sphase.ConclusionsSteroidalsaponinsfromP.polyphyllaCallinhibitthegrowthofA549cellsbyinducingS
phasearrest.
【Keywords】Lungneoplasms;Por/spolyphyUa;Saponins;Ceilproliferation;Cellcycle
重楼为百合科植物云南重楼或七叶一枝花的
干燥根茎,具有清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊等功
效[川。现代药理研究表明:重楼具有抗肿瘤、消炎、抑
菌、镇静、镇痛、止血等作用。近年来,重楼的抗肿瘤
作用受到广泛关注【驯。季申等【2]研究表明,重楼的水
提物、甲醇提取物和乙醇提取物对人肺癌A.549、人
乳腺癌MCF-7、人结肠腺癌HT-29、人肾腺癌A-496、
人胰腺癌PACA,2、人前列腺癌PC.3等多种肿瘤细
胞均有抑制作用。甾体皂苷是其主要药效成分㈣。本
课题组前期研究发现:重楼总皂苷可抑制人鼻咽癌
CNE.2Z细胞的增殖,细胞被阻滞在S期。从而诱导
凋亡(另文发表)。在此研究基础上,本实验将探讨
重楼总皂苷对人肺癌细胞A549增殖的抑制作用
及对细胞周期的影响。
1材料与方法
1.1 仪器与试剂 NAPCOseries5400C02培养
doi:10.3969/j.issn.1006—5725.2010.15.003
基金项目:湛江市科技计划项目(编号:2008C03016)
作者单位:524023广东省湛江市,广东医学院分析中心(陈
志红),天然药物研究与开发重点实验室(龚先玲,刘义)
箱。Elx酶标仪(Bio—TEK.INSTUMEN"ISINC产品).
EclipeET2000一E荧光倒置显微镜(Nikon公司生
产),EPICSXL流式细胞仪(美国COULTER公司生
产)。胰蛋白酶、5一氟尿嘧啶(5.ru)、甲基噻唑蓝
(MTr)(美国Sigma公司),小牛血清(杭州四季青
生物材料有限公司)。RPMI.1640培养基(Gibco公
司)。
1.2药材重楼药材购于广东湛江天马大药房.
由广东药学院滕希峰博士鉴定为重楼的干燥根茎。
符合《中国药典>(2005版一部)的规定。
1.3细胞株人肺癌细胞A549由广东医学院天
然药物研究与开发重点实验室传代培养。
1。4方法
1.4.1 重楼总皂苷的制备取干燥的重楼块根,粉
碎,称40.00g样品,加70%的乙醇400mL回流2
次,每次3h。过滤,合并滤液,减压浓缩除去乙醇。加
水悬浮.依次用石油醚、乙酸乙酯除去亲脂性的成
分,再用正丁醇萃取,正丁醇部分浓缩至于,干粉为
重楼总皂苷。
1.4.2细胞培养A549细胞培养于含lO%dx牛血
清、100kU/L青霉素和100哪/L链霉素的RPMI.
万方数据
2686
1640培养液中,37℃、5%CO:饱和湿度细胞培养箱培养.取
对数生长期细胞用于实验。
1.4.3 MrI,11法测定重楼总皂苷对A549细胞的生
长抑制作用 取对数生长期的人肺癌细胞A549.
用O.25%的胰蛋白酶消化,含10%新生小牛血清
的RPMI.1640培养液调制成4X104个/mL的细胞
悬液,接种于96孔板中,每孔接种100斗L。在
370C、5%CO:条件下培养过夜后,吸出培养液,加入
新鲜培养液180斗L及药液20“L。待测样品用
DMSO溶解(DMSO终体积分数≤0.1%),化合物终
浓度分别为60、90、120、150、180P,g/mL.每个浓
度平行6孔.同时设置空白对照组和5-Fu的阳性
对照组,空白对照组每孑L加入20恤L的RPMI.1640
培养液,阳性对照组则加入浓度为20斗g/mL的5.Fu
20皿。分别培养培养24、48、72h后,每孑L加入5
mg/mL的M,ITI'20斗L,37℃5%C02条件下温育
4—6h,弃去上清液,每孔加入150IxLDMSO,在微
型振荡器上摇匀15rain,结晶溶解后,立即比色,在
酶标仪主波长为570nm。参比波长为630nm处测
量OD值,比色以空白孑L调零。计算药物对肿瘤细
胞的增殖抑制率。增殖抑制率=(1一实验组OD值
平均值/对照组OD值平均值)x100%。
1.4.4荧光显微镜观察细胞形态取对数生长期
的A549细胞,调整细胞浓度为3.0×105个/mL,接
种于24孔板中,每孔接种500斗L。在37℃、5%C02
条件下培养过夜后。吸出培养液.加入新鲜培养液
450pL及药液50斗L,使其终浓度为60、90、120
I山g/mL,同时设置阴性对照,阴性对照加50此
RPMI.1640培养液。继续培养24h后。用预冷的
PBS洗涤2次,加入浓度为10斗g/mLHoechst
3334237℃染色15min,PBS洗涤2次。再加入浓
度为50扯g/mL的PI染色液于冰上染色15min,
PBS洗涤2次,于荧光显微镜下观察并拍照。
1.4.5 流式细胞仪分析重楼总皂苷对人肺癌细胞
A549周期的影响取对数生长期的人肺癌细胞
A549,PBS洗2遍后,0.25%胰蛋白酶液消化,用含
10%dx牛血清的RPMI.1640培养基制备成浓度为
3.0X104个/mL的细胞悬液.接种于50mL的小培
养瓶中,每瓶接种6mL。在370C、5%CO:条件下培
养过夜后。吸出培养液,加入新鲜培养液及重楼总
皂苷药液,使其终浓度为60、90、120斗g/mL,同时设
置阴性对照。阴性对照加相同体积的培养液。分别
在给药后24h,用胰酶消化细胞,离心收集细胞,
PBS洗2次,细胞沉淀用70%乙醇悬浮,在-200C
冰箱固定24h以上。PBS离心洗去乙醇后加PI染
液(含50mg/LPI,10mg/LRnaseA。0.1%TritonX一
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100。0.1%柠檬酸钠和0.5%NaCl),室温下避光染
色30min,400目筛网过滤,用流式细胞仪
DNA含量,分析细胞周期(激发波长488nm,发射
波长630nm)。
1.5统计学方法实验数据用五±s表示,应用
SPSSl3.0统计软件进行单因素方差分析,组间比较
用玲D法。以P<0.05为差异有显著的统计学意义。
2结果
2.1 重楼总皂苷对A549细胞增殖的抑制作用
重楼总皂苷对A549细胞增殖的抑制作用结果见
表1。从表1可以看出:不同浓度药物处理组分别
培养24、48、72h。重楼总皂苷对A549细胞的增殖
具有抑制作用,且其抑制作用具有时间和浓度依赖
性。随着作用时间的延长和药物浓度的增加.细胞
抑制效果越来越明显,重楼总皂苷对A549细胞的
生长有量一效、时一效关系。
表l重楼总皂苷对A549CNE-2Z细胞增殖的抑制作用(厅巧)
i±s.%
2.2荧光显微镜观察重楼总皂苷对A549细胞的
影响 在荧光显微镜下观察经Hoechst.PI双染的
A549细胞,对照组细胞呈现弥散均匀蓝色荧光,细
胞边缘整齐,偶见个别坏死细胞(图1a)。而经重楼
总皂苷处理24h后的A549细胞.细胞体积变小。
染色质固缩。细胞核呈亮蓝色及明显的核形态变
化,并可见染色质边集及凋亡小体(图lb、lc、ld)。
2.3 流式细胞仪分析重楼总皂苷对人肺癌细胞
A549细胞周期的影响重楼总皂苷对人肺癌细胞
A549作用24、48h后对细胞周期各时相DNA含
量的影响见表2。重楼总皂苷对人肺癌细胞A549
作用24h时,随着重楼总皂苷作用浓度的增加.
Gl/Go期DNA含量降低IF=5.86,,如(3.1I)=3.59;P
<0.05],S期DNA含量明显增加[F=30.54,Rm(3.
11)=6.22;P<0.01],G2/M期DNA含量降低『F=
336.00,F00l(3'11)=6.22;P<0.01]。重楼总皂苷对人
肺癌细胞A549作用48h时,随着重楼总皂苷作用
浓度的增加,G。/G0期DNA含量降低fF=32.87,
R.01(3.11)=6.22;P<0.01],S期DNA含量明显增加[F
=172.56,,kl(3’11)=6.22;P<0.01],G/M期DNA含
万方数据
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注:a,x,/N.b,60ttg/mL重楼总皂苷作用A549细胞24h;e,90trg/mL重楼总皂苷作用A549细胞24h;d,120ttg/mL重楼总皂苷作
用A549细胞24h
图1荧光倒置显微镜观察重楼总皂苷诱导的A549细胞形态学变化(x200)
表2重楼总皂苷处理A549细胞不同时相DNA含量的影响(n=3) i-1-s
注:与0鹇/mL比较,·P<0.05,十}P<0.0l
量降低[F=10.52,Fo.01(3.⋯=6.22;P
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