循环肿瘤细胞的临床研究

循环肿瘤细胞的临床研究 循环肿瘤细胞的检测有助于早期发现肿瘤患者的微转移灶，确定临床分期，监测术后复发与转移，评估预后。循环肿瘤细胞的检测方法有了很大的进步；但找到特异度高的循环肿瘤细胞（Circulating tumor Cell，CTC）标记物，提高检测手段的敏感度和特异度还有更多的工作要做。 本文探讨实体瘤患者循环肿瘤细胞检测方法和结果，并讨论当前面临的问。 1CTCs的检测方法 1.1细胞计数法 细胞计数法是最早应用于检测外周血CTCs的方法，是当前鉴定骨髓中微转移的方法。由于敏感性低，随着细胞自动成像和细胞富集方法产生以及数字显微镜能自动扫描以核特征和细胞表面特征为基础的血标本，操作者只需确定分选的细胞即可。新近应用的上皮肿瘤细胞容量分离法（isolation by site of epithelial tumor Cells，ISET），不仅能计数肿瘤细胞，还可进行免疫形态学和分子特征的分析。FCM能鉴定特定标本中细胞抗原性和形态学特征，还能使富集的目的细胞维持细胞形态并保持细胞活力，进一步扩大在体外的功能研究。 1.2PCR方法 PCR方法是检测CTCs最普遍的一种方法，该方法通过设计获得与目的基因特异性互补的寡核苷酸引物而具有较高的特异性。应用PCR方法可在106~107 正常细胞中检测出1个肿瘤细胞，相当于1~10ml血中可发现1个肿瘤细胞，与光学显微镜检测（102~103 个正常细胞中发现1个肿瘤细胞）和免疫组化学方法（104~105 个正常细胞中发现1个肿瘤细胞）相比较具有更高的敏感性。由于高度敏感性，极易产生假阳性。 以mRNA作为进行RT-PCR也是CTCs检测的一种方法。首先将mRNA反转录为cRNA，随后用特异性的引物扩增获得目的基因。 1.3细胞富集方法 密度梯度离心法是目前常用的一种收集肿瘤细胞的方法，该方法缺乏特异性。新近发展起来的免疫磁性细胞富集法则具有较高的特异性和富集率。其基本原理即采用均匀、球形具有超顺磁性及保护壳的纳米微粒制成免疫磁珠，使成为既能被磁铁吸引又能结和抗体的载体。磁珠上的抗体与含有特异性抗原物质的细胞结合后，形成细胞-抗原-磁珠免疫复合物，在磁力作用下发生力学移动，使复合物与其他物质分离，达到分离特异细胞的目的。这种方法比一般分离方法提高102~104 倍。但此法对缺乏细胞表面标记物的非上皮起源的肉瘤不能应用。 2临床应用 2.1乳腺癌 由于应用抗上皮细胞抗体的免疫磁性细胞富集检测方法的出现，采用细胞计数法研究外周血中乳腺癌CTCs的放法引起广泛关注。CTCs阳性与临床结果相关，在转移癌患者中，其清除率与标准化疗和分子靶向治疗的效果密切相关。因此CTCs的检测可提示肿瘤对特定治疗方案的敏感性。有报告乳腺癌骨转移患者的CTCs检出率高。 2.2结直肠癌 结直肠癌患者CTCs检测的结论具有争议性，单变量分析方法所得结论不一致，多变量分析方法所得的结论证明CTCs的检测可独立预测患者的生存期。其原因可能是因为肝作为了泵发性结肠癌细胞脱落并释放进入门脉系统的过滤器。通过直肠癌肝转移患者的多变量分析的阳性结果显示，这些CTCs能够被递送进入体循环，避免肝过滤。 2.3前列腺癌 大多数研究者采用PCR方法已证明CTCs的预后价值。术前和术后CTCs的检测与分期和生存率相关，术后检测证明在多变量分析中有预后意义。但PAS水平的检测预后意义与CTCs相比，其结果并不一致。 3问题与展望 引物设计不合理导致的假基因获得使PCR假阳性率高，低质量样品可降低CTCs的检出率。细胞计数法可快速获得结果，但获得资料有限且重复性和敏感性均不及PCR方法。至今缺乏大规模的对照研究，使CTCs研究设计成为个人试验的主张，很难对比不同结论。解决生物学问题比技术问题更重要；CTCs间断脱落键入血流和肿瘤细胞的基因组但不稳定性都能导致假阴性结果。最新生物技术进展能够检测不仅来自细胞极少的标本而且来自单个细胞整个基因或者蛋白序列，适宜对不同转移潜能的CTCs进行研究。在基因水平上对单个CTCs特征进行分析被认为是一种最具有前途的靶向抗肿瘤的治疗方法。在CTCs检测成为临床常规检测手段之前，有些问题尚需解决：①合理的实验设计，最新的技术来提高CTCs的检出率，②进行大规模临床试验，以证明其检测对预后的意义，③如何应用最新技术来全面阐述其分子特征，④应用生物学鉴定方法来确定是那些具有高度转移潜能的CTCs分子序列，以确定一种理想的标志物来检测CTCs，以便设计获得更有效的抗肿瘤药物。未来进展可能需要在严格控制临床试验的基础上去评价基于CTCs的治疗方案对患者生存的影响。