10基因诊断

nullnull王学锋nullFVIII (Xq28)FIX (Xq27)qp染色体 X血友病A、B血友病血友病替代治疗 疾病传播，费用昂贵 基因治疗没有突破 携带者及产前检查杜绝患儿出生、根治疾病血友病A为例说明 基因诊断的临床应用血友病A为例说明 基因诊断的临床应用血友病携带者和产前诊断血友病携带者和产前诊断流程 PCR扩增外周血DNA抽提（携带者）直接核酸测序间接联锁分析明确诊断长链PCR检测内含子1,22倒位血友病A ①、 ② 、③羊水DNA抽提（胎儿）①③②nullFVIII (Xq28)FIX (Xq27)qpX染色体血友病A、Bnull内含子22倒位结果（1）结果（1） 内含子22 倒位检测结果 内含子1倒位机制内含子1倒位机制内含子1倒位检测方法内含子1倒位检测方法间接基因诊断间接基因诊断血友病Anull 第一代标志 (参照国外） F8基因内的BclⅠRFLP F8基因内两个STR位点 F8基因外的St14 VNTR null 家系15 Bcl I RFLP位点多态性连锁分析null家系13 st14位点VNTR多态的基因连锁分析null内含子13中STR多态位点用于家系12基因连锁分析147/147/147145/147149/147/149147/149145/147147/间接诊断——血友病A新位点的探索国外：4个位点 2个STR （CA13、CA22），2个SNPs （BcI I、Hind Ⅲ） 诊断率约为80％(Hemophilia. Chapman & Hall, London , 63-74) 中国人：用上述4个位点 信息量仅为27%(Clin Chem Lab Med 2001;39(12):1204－1208 )间接诊断——血友病A新位点的探索第二代标志（自主开发）第二代标志（自主开发）6个与F8 紧密连锁的STR位点： DXS15、DXS9901、G6PD、DXS1073和DXS1108 距F8 1.5Mb内 1个F8 内的STR位点(F8Civs13) 性别位点为牙釉蛋白基因（Amelogenin gene） 终产物 X染色体102bp，Y染色体 108bp 遗传连锁分析的多态性位点的相对位置遗传连锁分析的多态性位点的相对位置null 所用STR位点在正常人群中检测的结果 nullnullnull第三代标志（自主开发）对象：69名正常女性、31个HA家系（120名成员） 方法：人类基因组数据库中选择了位于F8基因两端0.5CM内的3个STR位点（5_226、5_147及3_486），F8基因内的1个STR位点（INTRON25）及距离F8基因2CM内的DXS8069位点，以多重荧光PCR法检测5个微卫星位点的多态性nullF8CA22DXS1073G6PDDXS9901DXS15DXS1108ST14F8Civs13F8Intron25DXS10735-226F8Civs133-4865-147DXS8069null联合5个STR位点可对所有做携带者及产前诊断的血友病A家系提供遗传连锁分析结果且与F8基因直接检测结果相符 结果与讨论null7重荧光PCR技术 降低重组发生率 未见漏诊和误诊 诊断率和准确率100％null特殊血友病A家系的基因诊断 null先证者自幼皮肤、头颅撞伤后及拔牙及手术后有出血难止，曾发生过颅内出血 BT、PT正常 APTT延长，FVIII:C 2% 输注全血或抗血友病球蛋白治疗有效 先证者已故家系1null家系2FⅧ:C 2%直接基因测序直接基因测序结果： 携带者外周血DNA直接测序未检测出突变 原因： 据文献报道FVIII直接基因测序有1%-10%的患者查不到基因突变 （ Hum Mutat. 2002 Oct;20(4):267-74） 存在大的缺失? 内含子突变？ 携带者诊断结果携带者诊断结果携带者及待检者F8内含子22,1倒位均为阴性 null间接诊断结果 BclI酶切图 间接诊断结果 BclI酶切图 III-1表姐： -/- II-2舅妈： -/- II-3母亲： +/- II-4父亲： +/+ III-2待检者：+/+ M BclI酶切图测序图BclI酶切图测序图BclI酶切识别位点 T/GATCA 图a 待检者测序图， 含BclI酶切位点 图b 表姐测序图，不 含BclI酶切位点ab间接诊断结果 ca13 基因扫描间接诊断结果 ca13 基因扫描III-1 表姐：144/144 III-2待检者：142/142 II-3母亲：142/144 II-2舅妈：140/144 II-4父亲：142/- 间接诊断结果 ca22基因扫描间接诊断结果 ca22基因扫描III-1 表姐：79/79 III-2待检者：79/83 II-3母亲：83/79 II-2舅妈：79/79 II-4父亲：79/-血友病A携带者间接诊断结果分析血友病A携带者间接诊断结果分析表姐舅妈父亲母亲待检者综合A13、CA22及Bcl I 信息，待检者与其表姐有不同的X染色体舅舅女性血友病A的基因及产前诊断女性血友病A的基因及产前诊断标本来源标本来源 先证者（II-1），女，21岁，汉族，自幼有踝关节及膝关节有自发出血，临床诊断为血友病A，冷沉淀及浓缩FVIII输注有效，因怀孕要求作基因诊断及产前诊断 ？？基因检测结果基因检测结果 F8内含子22倒位 F8内含子1倒位 先证者 阳性（携带者） 阴性 胎儿 阴性 阴性 其他人 阴性 阴性 先证者F8基因所有外显子及其侧翼序列扩增测序 （-）遗传连锁分析遗传连锁分析发病机制发病机制 先证者来自母系的X染色体大部分被灭活，而来自父系的X染色体保留活性 家系其他成员及胎儿为X染色体随机灭活 发病机制 发病机制 先证者一条X染色体发生了F8基因内含子22倒位，而未检测到其它F8基因相关突变 遗传连锁分析发现该女性患者的两条X染色体分别遗传自其父母，排除其为单亲二倍体 先证者的X染色体灭活呈非随机性灭活，其遗传自父亲的X染色体大部分保留了活性 女性血友病 A(2) 女性血友病 A(2) 女性血友病： (FVIII:C 3.4%,FVIII:Ag 4.2% Leu1975Pro 和 3637-3638insA 父亲： (FVIII:C 6.9%, FVIII:Ag 7.4%), Leu1975Pro mutation J Thrombosis and haemostasis 20063637-3638insA突变是如何产生的?3637-3638insA突变是如何产生的?母亲外周血DNA的 F8 没有检测到基因突变 母亲不同组织DNA F8基因检测也没有检测到突变，不是体细胞的嵌和体 患者3637-3638insA自发突变（ de novo）框移突变(3637-3638insA)框移突变(3637-3638insA)定量 RT-PCR显示： 患者的FVIII mRNA减少 结论： 女性血友病A患者是其F8基因中来自父亲的Leu1975Pro突变和自发突变 3637-3638insA，双重杂合突变导致的null一个血友病家系，父亲为血友病A，儿子为血友病B同时存在HA和HB患者家系的基因诊断 HAHBnullFVIII (Xq28)FIX (Xq27)qp染色体 X血友病A、B＋nullResult of phynotype detection 基因诊断结果 基因诊断结果 F8INV 22： 父亲 （＋）其他成员（－） F8INV 1 ： 所有成员（－） F9测序:儿子 mutation(32772A→T，Ser365Cys), 母亲 同位置杂合子 阿姨、外公（－） 父亲 （－）null Result of linkage analysis ？？＋：FIX基因缺陷＋＋__null外周血细胞、组织细胞 外公 体细胞、生殖细胞嵌合体外公 阿姨Peripheral bloodbuccal cavity cells Enqomphesis rate :14.1%嵌合体检测 null凝血因子V和VIII联合缺陷；常染色体隐性遗传性疾病；发病率为1/100万，男女均可发病 致病基因并非F5，F8基因，而是与蛋白转运相关受体的编码基因突变导致：LMAN1（70%），MCFD2（30%） 分子发病机制研究 F5F8D家系基因诊断nullnullF5F8D家系基因诊断(1)先证者1：10岁女孩，口腔粘膜反复出血 患者母亲怀孕要求做产前诊断nullF5F8D家系基因诊断(2)先证者2：50岁女性，贫血，凝血功能不佳， 长期痔疮出血 先证者3：47岁女性，凝血功能不佳nullF5F8D家系基因诊断(4)先证者4：50岁男性，平时无明显的凝血功能异常现象，因痔疮出血难止于术前进行凝血功能筛查 nullF5F8D家系实验室检测结果nullF5F8D家系基因检测结果先证者1： LMAN1：Exon8 nt925-933insA 305frameshift 编码20个氨基酸后终止 LMAN1：Exon11 nt1387C>CT(X71661.1) 456Arg>Stop母亲父亲产前诊断：胎儿为女性，且携带了来自父亲的突变null先证者2、3： MCFD2：Exon4 nt501T>C，导致第136位氨基酸错义突变，136 Ile>Thr F5F8D家系基因检测结果nullF5F8D家系基因检测结果先证者4：LMAN1：Exon5 nt636C>T ，导致202R>Stop先证者4之子（杂合子）：LMAN1：Exon5 nt636C>CT null间接诊断中的基因重组HA家系情况HA家系情况先证者II-3为重型血友病A患者，F8C<1.0% II-5要求作携带者诊断?HA家系遗传连锁分析的结果HA家系遗传连锁分析的结果5A 154 203 203 124 156 80 86C 154 203 203 124 156 84 96B 154 195 195 128 156 80 86ⅠⅡ123B 154 195 195 128 156 80 86C 154 203 203128 156 80 86A 154 203 203 124 156 80 86？HA家系检测结果HA家系检测结果22倒位：均为阴性 1倒位：先证者（II-3）为阳性，女性（II-5）为携带者HA家系诊断结果HA家系诊断结果内含子1倒位是该家系HA发生的致病机制，II-5为内含子1倒位携带者 遗传连锁分析发现II-5在ST14，DXS15，DXS9901，G6PD与DXS1073，F8Civs13，CA22，DXS1108间发生染色体的同源重组结 论结 论 在应用间接诊断进行HA家系携带者及产前诊断时，不能仅使用单一的位点进行诊断，必须联合应用多个与F8相关的位点来进行遗传连锁分析，尤其是F8基因内的多态性位点 2009血友病基因诊断2009血友病基因诊断nullThank you