用于抗幽门螺杆菌的组合物及其应用

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN111544451A(43)申请公布日2020.08.18(21)申请号202010351972.0A61K31/4439(2006.01)(22)申请日2020.04.28(71)申请人南京医科大学地址211166江苏省南京市江宁区龙眠大道101号(72)发明人毕洪凯　黄衍强　杭旭东　贾佳　曾利平　(74)专利代理机构南京经纬专利商标代理有限公司32200代理人唐循文(51)Int.Cl.A61K33/30(2006.01)A61P1/04(2006.01)A61P31/04(2006.01)A61K31/202(2006.01)权利要求书1页说明书5页附图4页(54)发明名称用于抗幽门螺杆菌的组合物及其应用(57)摘要用于抗幽门螺杆菌的组合物及其应用，包括亚麻酸胶囊、锌制剂（葡萄糖酸锌或聚普瑞锌）和质子泵抑制剂。联合使用在体内和体外均可抑制幽门螺杆菌，对治疗幽门螺杆菌感染的相关疾病胃炎等有良好的效果，特别是对耐药性幽门螺杆菌感染引起的难治性胃炎有良好的效果。该组合物能够在不使用抗生素的情况下治愈幽门螺杆菌感染，提高了治愈率，降低了对抗生素耐药的发生率。CN111544451ACN111544451A权　利　要　求　书1/1页1.一种用于抗幽门螺杆菌的组合物，其特征在于由亚麻酸胶囊、锌制剂和质子泵抑制剂组成，所述锌制剂为葡萄糖酸锌或聚普瑞锌，所述质子泵抑制剂为奥美拉唑，锌制剂与亚麻酸摩尔浓度比为（0.25-4）：1。2.权利要求1所述组合物在制备预防或治疗幽门螺杆菌感染导致的消化道疾病药物中的应用。3.一种抗幽门螺杆菌的药物，其特征在于有效成分为权利要求1所述的组合物和药学上可接受的辅料。4.根据权利要求3所述抗幽门螺杆菌的药物，其特征在于亚麻酸:葡萄糖酸锌:奥美拉唑的质量比为22.7:5.3:138.2，葡萄糖酸锌的用量以含锌量计。2CN111544451A说　明　书1/5页用于抗幽门螺杆菌的组合物及其应用技术领域[0001]本发明属于医药领域，具体涉及用于抗幽门螺杆菌的组合物及其应用。背景技术[0002]据报道目前世界上约有一半的人感染幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)。Hp感染能导致胃炎和胃、十二指肠溃疡及淋巴增生性胃淋巴瘤等疾病,并与胃癌等疾病有关。世界卫生组织于1994年将Hp归为I类致癌因子，它在胃癌等肿瘤的发生发展中起主导作用。目前，世界卫生组织推荐Hp感染的治疗是三联或四联疗法，即同时服用质子泵抑制剂(奥美拉唑等)加两种抗生素(克拉霉素、阿莫西林、四环素、甲硝唑等选二种)或铋剂(枸橼酸铋钾等)加质子泵抑制剂再加两种抗生素。但随着抗生素的长期使用，Hp对抗生素产生不同程度的耐药，导致三联或四联疗法的根治失败，急性胃炎演变成慢性胃炎或难治性胃炎等。因此，寻找具有高效、安全的治疗药物或治疗方案的替代已经成为一个非常重要和迫切的任务。[0003]对耐药性幽门螺杆菌感染的难治性胃炎、胃溃疡等，已经不适合再使用产生耐药的抗生素治疗，必须调整抗生素，但是对幽门螺杆菌有效的候选抗生素非常少，迫切需要探索新方案。已有报道表明亚麻酸和二价锌对幽门螺杆菌有一定的抑制作用，而本发明亚麻酸和锌制剂联用给药方法，未见有相同给药方法和相关医疗作用的报道。该方法安全、有效、成本低、副反应少，对耐药性幽门螺杆菌感染的急性胃炎有较好的治疗作用，其用途属于首次公开；而且亚麻酸(亚麻酸胶囊等)和锌制剂(葡萄糖酸锌或聚普瑞锌)已经商品化和市场化，除了聚普瑞锌，其它的市场价格都比较低，一般的药店都有，患者可以自行购买使用，该医药用途的发现能最快的替代标准疗法，为患者带来福音。发明内容[0004]解决的技术问：本发明为了提高治疗难治性性胃炎的效果，研究了一种药物组合治疗新方法，即“奥美拉唑+锌制剂+亚麻酸胶囊”联合治疗，该方法对耐药性和敏感性幽门螺杆菌均有较好的抑制作用。[0005]技术方案：一种用于抗幽门螺杆菌的组合物，由亚麻酸胶囊、锌制剂和质子泵抑制剂组成，所述锌制剂为葡萄糖酸锌或聚普瑞锌，所述质子泵抑制剂为奥美拉唑，锌制剂与亚麻酸摩尔浓度比为(0.25-4)：1。[0006]上述组合物在制备预防或治疗幽门螺杆菌感染导致的消化道疾病药物中的应用。[0007]一种抗幽门螺杆菌的药物，有效成分为上述组合物和药学上可接受的辅料。[0008]优选的，上述抗幽门螺杆菌的药物，亚麻酸:葡萄糖酸锌:奥美拉唑的质量比为22.7:5.3:138.2，葡萄糖酸锌的用量以含锌量计。[0009]有益效果：本发明的治疗方法可用于治疗耐药性或敏感性幽门螺杆菌感染导致的急、慢性胃炎、胃、十二脂肠溃疡等疾病，而且毒副作用小、医疗费用低，能有效缓解幽门螺杆菌耐药性问题，对胃反酸、肠道便秘也有一定的疗效。3CN111544451A说　明　书2/5页附图说明[0010]图1为葡萄糖酸锌口服液、亚麻酸胶囊和奥美拉唑联用在体内对耐药幽门螺杆菌的抑制作用。[0011]图2为聚普瑞锌、亚麻酸胶囊和奥美拉唑联用在体内对耐药幽门螺杆菌的抑制作用。[0012]图3为葡萄糖酸锌口服液、亚麻酸胶囊和奥美拉唑联用对耐药幽门螺杆菌感染的小鼠胃粘膜的修复作用(HE染色)。A为未感染Hp组，B为感染Hp用PBS组，C为感染Hp用标准三联治疗组，D为用奥美拉唑加亚麻酸加葡萄糖酸锌(摩尔比1：4)组，E为用奥美拉唑加亚麻酸加葡萄糖酸锌(摩尔比1：1)组，F为用奥美拉唑加亚麻酸加葡萄糖酸锌(摩尔比4：1)组，放大倍数均为100倍。[0013]图4为葡萄糖酸锌口服液、亚麻酸胶囊和奥美拉唑联用对耐药幽门螺杆菌感染的小鼠胃粘膜的修复作用(TUNEL染色)。[0014]图5为葡萄糖酸锌口服液、亚麻酸胶囊和奥美拉唑联用对耐药幽门螺杆菌感染的小鼠炎症因子调控作用。[0015]图6为按照“亚麻酸：葡萄糖酸锌(摩尔比1:1)”治疗剂量10倍给药对小鼠脏器损伤作用。A、B、C、D分别为PBS给药小鼠的胃、肝、脾、肾，E、F、G、H分别为10倍治疗剂量给药小鼠的胃、肝、脾、肾，放大倍数均为100倍。[0016]图7为按照“亚麻酸：葡萄糖酸锌(摩尔比摩尔比1:1)”治疗剂量10倍给药对小鼠体重的影响。具体实施方式[0017]实施例1[0018]第一，体外抑菌：锌与亚麻酸按照摩尔浓度比4:1联合使用，葡萄糖酸锌口服液与亚麻酸胶囊联合使用对耐药性和敏感性幽门螺杆菌的最低抑菌浓度为16-32μg/mL，聚普瑞锌与亚麻酸胶囊联用则为16～64μg/mL。[0019]第二，体内治疗：药物组合为亚麻酸胶囊、锌制剂和奥美拉唑，用幽门螺杆菌感染小鼠构建急性胃炎模型，每天灌胃给药胃炎小鼠1次，连续给药5天，其中锌与亚麻酸按照摩尔浓度比4:1使用。每天给药量包括奥美拉唑138.2mg/kg、葡萄糖酸锌口服液或聚普瑞锌13.5mg/kg(以含锌量计算)、亚麻酸胶囊14.5mg/kg(以亚麻酸含量计算)。幽门螺杆菌在小鼠体内定植量下降102CFU/g以上，炎症因子水平降低，但胃粘膜炎症细胞只是稍有减少，恢复不明显，其它脏器未见有损伤。[0020]实施例2[0021]第一，体外抑菌：锌与亚麻酸按照摩尔浓度比1:1联合使用，葡萄糖酸锌口服液与亚麻酸胶囊联用对耐药性和敏感性幽门螺杆菌的最低抑菌浓度为8-16μg/mL，聚普瑞锌与亚麻酸胶囊联用则为16～64μg/mL。[0022]第二，体内治疗：药物组合为亚麻酸胶囊、锌制剂和奥美拉唑，用幽门螺杆菌感染小鼠构建急性胃炎模型，每天灌胃给药胃炎小鼠1次，连续给药5天，其中锌与亚麻酸按照摩尔浓度比1:1使用。每天给药量包括奥美拉唑138.2mg/kg、葡萄糖酸锌口服液或聚普瑞锌5.3mg/kg(以含锌量计算)、亚麻酸胶囊22.7mg/kg(以亚麻酸含量计算)。幽门螺杆菌在小鼠4CN111544451A说　明　书3/5页体内定植量下降102CFU/g以上，胃粘膜损伤明显好转，炎症因子水平明显降低，其它脏器未见有损伤。[0023]实施例3[0024]第一，体外抑菌：锌与亚麻酸按照摩尔浓度比1:4联合使用，葡萄糖酸锌口服液(或聚普瑞锌)与亚麻酸胶囊联用对耐药性和敏感性幽门螺杆菌的最低抑菌浓度均为16-64μg/mL。[0025]第二，体内治疗：药物组合为亚麻酸胶囊、锌制剂和奥美拉唑，用幽门螺杆菌感染小鼠构建急性胃炎模型，每天灌胃给药胃炎小鼠1次，连续给药5天，其中锌与亚麻酸按照摩尔浓度比1:4使用。每天给药量包括奥美拉唑138.2mg/kg、葡萄糖酸锌口服液或聚普瑞锌1.6mg/kg(以含锌量计算)、亚麻酸胶囊26.4mg/kg(以亚麻酸含量计算)。幽门螺杆菌在小鼠体内定植量下降102CFU/g以上，炎症因子水平降低，但胃粘膜炎症细胞只是稍有减少，恢复不明显，其它脏器未见有损伤。[0026]本发明“奥美拉唑+锌制剂+亚麻酸胶囊”联合对幽门螺杆菌的抑制作用通过如下具体操作进一步详细的说明。[0027]1.材料[0028]1.1药品[0029]奥美拉唑肠溶胶囊(广东逸舒制药股份有限公司，产品批号20180433)，葡萄糖酸锌口服液(江西川奇药业有限公司，产品批号180402)，利诺龙牌α-亚麻酸软胶囊(威海百合生物技术股份有限公司，产品批号431627060)，聚普瑞锌(博大伟业制药，批号25-190201)[0030]1.2菌株[0031]标准菌株26695、菌株NSH57、G27；临床克拉霉素和甲硝唑耐药菌株(HP285和HP287)、左氧氟沙星和克拉霉素及甲硝唑多重耐药菌株(HP159，HP286，HP289和HP290)(由本实验室从临床患者胃粘膜样本分离培养获得)。[0032]1.3培养基和主要试剂[0033]哥伦比亚培养基、脑心浸液培养基、选择性抗生素(万古霉素、多粘菌素B、甲氧苄氨嘧啶)、血清、奥美拉唑、阿莫西林、克拉霉素、革兰氏染色液、细菌基因组DNA提取试剂盒、幽门螺杆菌16SrRNA特异性引物。[0034]1.4实验动物：C57BL/6小鼠。[0035]1.5主要仪器：二氧化碳培养箱、离心机、组织破碎仪、电子天平、灌胃针、剪刀等。[0036]1.6耗材：EP管、Tip头、离心管等。[0037]2.方法与结果[0038]2.1体外抑菌，微量肉汤稀释法检测葡萄糖酸锌口服液或聚普瑞锌与亚麻酸胶囊联用对幽门螺杆菌的最低抑菌浓度(MIC，100μL体系)[0039](1)分别按照摩尔浓度比4:1、1:1、1:4联合配备亚麻酸胶囊和葡萄糖酸锌口服液或聚普瑞锌。[0040](2)MIC板制备第一孔先加培养基167.2μL，再加12.8μL混合液，倍比稀释至第7孔；第8孔不加药，保留90μL培养基，作为加菌不加药对照。[0041](3)菌液制备取固体平板上对数期生长的幽门螺杆菌用BHI培养基制作成菌悬液，87调整浓度OD600为0.3(1×10CFU/mL)，稀释10倍，为1×10CFU/mL，备用。5CN111544451A说　明　书4/5页[0042](4)接种菌液取10μL加至第1-8孔(每孔菌液浓度约为1.0×106CFU/mL)。培养72h判断结果。第1孔至第6孔药物浓度分别为128、64、32、16、8、4、2μg/mL。[0043](5)结果判断以在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。当阳性对照孔第7孔(即不含抗生素)内细菌明显生长和第8孔(无菌)不生长试验才有意义。当在微量稀释法出现单一的跳孔时，应抑制细菌生长的最高药物浓度。如出现多处跳孔，则不应报告结果，需重复试验。每个药物重复3次试验。[0044](6)结果：结果见表1。[0045]表1锌制剂与亚麻酸胶囊联用对幽门螺杆菌的最低抑菌浓度(MIC,μg/mL)[0046][0047]2.2体内治疗，构建动物模型体内检测锌制剂、亚麻酸胶囊和奥美拉唑联用对幽门螺杆菌的抑制效果[0048]2.2.1药物：葡萄糖酸锌口服液、聚普瑞锌、亚麻酸胶囊(去胶囊外膜后称重内含物)、奥美拉唑、阿莫西林、克拉霉素均溶解稀释为10mg/mL。[0049]2.2.2菌株：临床分离的对左氧氟沙星和克拉霉素及甲硝唑多重耐药的菌株BHKS159，经本实验室驯化5次，确定能定植在小鼠胃粘膜。[0050]2.2.3动物造模：小鼠模型构建参考文章(Huang Y,Hang X,Jiang X,Zeng L,Jia J,Xie Y,Li F,Bi H.In Vitro and In Vivo Activities of Zinc Linolenate,a Selective Antibacterial Agent against Helicobacter pylori.Antimicrob Agents Chemother[J].2019May 24；63(6))。[0051]模型构建判断：取10％小鼠胃组织检测幽门螺杆菌定植，定植量范围为1×105～1×106CFU/g方认为定植成功，检测结果均有幽门螺杆菌定植。[0052]2.2.4组合物治疗效果观察：[0053](1)动物分组：第一次实验组将造模成功的感染组平均分成5组，分别为PBS治疗组、标准三联用药治疗组(奥美拉唑+阿莫西林+克拉霉素)、葡萄糖酸锌与亚麻酸摩尔比4:1+奥美拉唑组、葡萄糖酸锌与亚麻酸摩尔比1:1+奥美拉唑组、葡萄糖酸锌与亚麻酸摩尔比1:4+奥美拉唑组，每组8只；未感染幽门螺杆菌的8只小鼠胃阴性对照组。第二次实验组将造模成功的感染组平均分成5组，分别为PBS治疗组、标准三联用药治疗组、聚普瑞锌与亚麻酸摩尔比4:1+奥美拉唑组、聚普瑞锌与亚麻酸摩尔比1:1+奥美拉唑组、聚普瑞锌与亚麻酸摩尔比1:4+奥美拉唑组，每组6只；未感染幽门螺杆菌的6只小鼠胃阴性对照组。[0054](2)动物给药：实验组灌胃给药，先给予奥美拉唑，30min后再给其它药物，给完药6CN111544451A说　明　书5/5页物后禁食禁水2小时；每天给药1次，连续5天，小鼠体重按照平均20g/只计算；标准三联用药组给药量为奥美拉唑138.2mg/kg、阿莫西林28.5mg/kg、克拉霉素14.3mg/kg，锌与亚麻酸摩尔比4:1组为奥美拉唑138.2mg/kg、葡萄糖酸锌口服液或聚普瑞锌13.5mg/kg(以含锌量计算)、亚麻酸胶囊14.5mg/kg(以亚麻酸含量计算)，锌与亚麻酸摩尔比1:1组为奥美拉唑138.2mg/kg、葡萄糖酸锌口服液或聚普瑞锌5.3mg/kg(以含锌量计算)、亚麻酸胶囊22.7mg/kg(以亚麻酸含量计算)，锌与亚麻酸摩尔比1:4组为奥美拉唑138.2mg/kg、葡萄糖酸锌口服液或聚普瑞锌1.6mg/kg(以含锌量计算)、亚麻酸胶囊26.4mg/kg(以亚麻酸含量计算)；阴性对照组给PBS液，容量、次数同上。[0055](3)药效检测：停药后第2天感染组的小鼠称重并计算平均体重，眼球采血，行断颈处死，取胃组织，进行Hp的分离培养和鉴定，并对小鼠胃组织行病理切片染色。[0056](4)治疗效果：葡萄糖酸锌与亚麻酸摩尔比1:1+奥美拉唑组体内抗幽门螺杆菌能力明显优于标准三联治疗组(P<0.05)，其他处理组与标准三联治疗组相当，如图1和图2；葡萄糖酸锌与亚麻酸摩尔比1:1+奥美拉唑组胃粘膜的组织修复能力优于三联治疗组，如图3和图4；葡萄糖酸锌与亚麻酸摩尔比1:1+奥美拉唑组对炎症因子的调控优于三联治疗组，如图5。[0057]2.3“奥美拉唑+葡萄糖酸锌+亚麻酸胶囊”联用的动物毒性检测[0058](1)准备小鼠：16只8周龄C57BL/6小鼠，随机分为8只为给药组，8只为阴性对照组。[0059](2)灌胃给药：以葡萄糖酸锌与亚麻酸摩尔比1:1给药量的10倍量给药，即以奥美拉唑剂量1382mg/kg、萄糖酸锌口服液剂量53mg/kg(以含锌量计算)与亚麻酸胶囊剂量227mg/kg(以亚麻酸含量计算)给药，连续5天，每天给药1次；阴性对照组给PBS液，次数和量同给药组。[0060](3)称量体重：从给药第1天开始称小鼠体重，连续称量7天。[0061](4)药效检测：停药后第2天行脱臼断颈处死，取胃、肾、肝和脾组织，做病理切片并进行HE染色。[0062](5)结果：10倍剂量葡萄糖酸锌口服液与亚麻酸胶囊联合给药组和阴性对照组小鼠的胃、肾、肝和脾组织未见有损伤,如图6；两组小鼠体重未见有明显变化，如图7。7CN111544451A说　明　书　附　图1/4页图18CN111544451A说　明　书　附　图2/4页图2图39CN111544451A说　明　书　附　图3/4页图4图510CN111544451A说　明　书　附　图4/4页图6图711