三引物法鉴定T

三引物法鉴定T-DNA插入突变体：三引物法的原理下图所示，即采用三引物(LP、RP、BP)进行PCR扩增。野生型植株目的基因的两条染色体上均未发生T-DNA插入，所以其PCR产物仅有1种，分子量约1100 bp (即从LP到RP)；纯合突变体植株目的基因的两条染色体上均发生T-DNA插入，T-DNA本身的长度约为25 kb，过长的模板会阻止目的基因特异扩增产物的形成，所以也只能得到1种以BP与LP或RP为引物进行扩增的产物，分子量约为560-860bp；杂合突变体植株只在目的基因的一条染色体上发生了T-DNA插入，所以PCR扩增后可同时得到两种产物。上述3种情况的电泳结果差异明显，能有效区分不同基因型的植株。此法优点是可同时鉴定出纯合突变体并确证T-DNA的插入情况。双引物法的基本原理与三引物法相似，只是需要急性两轮PCR扩增。一组以基因组DNA特异引物LP和RP扩增目的基因片段；另一组以T-DNA 的特异引物BP与LP或RP组成一对引物，扩增目的基因T-DNA插入片段。此法的不足之处是完成最终鉴定需进行两轮PCR扩增。由于三引物法容易导致PCR反应体系的引物浓度过高，形成引物二聚体或形成非特异性扩增，导致结果不理想，所以采用二引物法进行实验。