维族药斯亚旦有效成分研究

维族药斯亚旦有效成分研究 分类号:中图分类号 密级: 学科分类号. 天津理工大学研究生学位论文 维族药斯亚旦有效成分研究 申请硕士学位 学科专业:药物化学 研究方伺:民族药研究 作者姓名:冯羽 指导教师:雷英杰刘玉明副教授 年月 ’. ,独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取 得的研究成果,除了文中特别加以标注和致谢之处外,论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得 或 叁盗堡兰太鲎 其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研 究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 签字日期:沙’年 弓月乒日 学位论文作者签名:写日习 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解 墨盗墨墨盘望有关保留、使用学位论文 可以将学位论文的全部或部分内容编入 的规定。特授权墨盗垄苎盘鲎 有关数据库进行检索,并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编, 以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复本和电子 文件。 保密的学位论文在解密后适用本授权说明 学位论文作者签名:弓司司 导师签名:墙蒿盘 翻嚷.目哆 签字日期:砂年’月垆日 签字日期:矽乡年弓月产日摘要 斯亚旦,新疆维吾尔族药材,为毛莨科黑种草属植物,种子为其药用部位,具 有活 血利尿、通经解毒、补肾健脑、镇痛、抗肿瘤等药用价值显著的作用,现今 主要种植于 中国新疆吐鲁番,目前国内外对斯亚旦的研究主要局限于其脂溶性成分的药 理活性,忽 略了中强极性化学成分的研究。 苯酞类天然化合物在自然界的分布很少,但其却以丰富的生物多样性而闻名,并具 有扩张血管、增加冠脉血流量、强心和镇痛等功效,所以对自然界中天然存在的苯酞类 化合物的提取与探究是很有必要的。 本课通过应用现代色谱技术对斯亚旦中的有效成分进行提取与分离,并根据理化 性质和现代波谱技术对分离所得的个化合物进行结构鉴定,分别为对羟基苯甲酸, 胡萝卜苷,甘油,.亚油酸甘油酯,丙氨酸,黑种草酞苷,异株五加甲苷 。其中化合物为新的天然苯酞类化合物,化合物和为首次从该植物中提取得 到。经活性测试,化合物对前列腺癌细胞株一的值为.,并通过运用 现代液相色谱技术对异株五加甲苷进行了含量测定研究,而.型大孔树脂能够成功 提取分离出异株五加甲苷,用其对异株五加甲苷进行正交纯化试验优化,最终制定了一 套完整的质量控制标准以及工艺纯化优选。 关键词: 斯亚旦苯酞类天然化合物黑种草酞苷工艺纯化 , , , , . ,, . , . , , , ,. . , , ,, ,,,. , , ., . 一 , ,, .一一 ,. : ,,, 目 录 第一章文献综述??. .斯亚旦概述?.. ..前言.. ..形态特征?. ..国内外发展前景? ..斯亚旦化学成分分类.苯酞类成分概述??.. ..简介 ..苯酞类化合物的分类及来源..苯酞类化合物的药用价值和用途以及国内 外研究进展 ..苯酞类成分小结? 第二章斯亚旦有效成分研究 .实验仪器及药品..实验仪器. ..实验药品。 .斯亚旦浸膏的提取与提取工艺??. .斯亚旦有效成分的分离步骤及方法 .斯亚旦有效成分结构解析? ..对羟基苯甲酸 ..胡萝苷..甘油。 .. .亚油酸一甘油酯..丙氨酸 ..黑种草酞苷? ..异株五加甲苷 .结构鉴定数据 .细胞毒活性成分筛选 .本章小结??. 第三章异株五加甲苷的含量测定?.实验仪器与药品试剂 ..实验仪器. ..试剂及药品??. .色谱条件.样品分析..对照品溶液的制备??. ..标准曲线的绘制. ..样品处理. ..供试液的制备?. ..精密度实验??.. ..重现性实验??. ..稳定性实验??. ..加样回收率实验. ..含量测定. .本章小结第四章异株五加甲昔的工艺纯化?. .概述? ..基本工艺原理?. ..大孔树脂型号的选择?. .实验的前期准备..大孔树脂预处理. ..薄层色谱分析的准备工作??. .预饱和实验? ..上样溶液的制备.. .. .型大孔树脂吸附样液??. .数据和图像的记录与处理? ..泄露曲线. ..比上柱量,比吸附量的计算?. ..不同浓度乙醇洗脱曲线及数据分析?. .正交实验..设计原则. ..操作步骤. .方差分析??. ..正交实验的结果方差分析??...验证实验. .本章小结第五章结论?. 参考文献. 发表论文和科研情况说明?。 要 谢? 附 图?第一章文献综述 第一章文献综述 .斯亚旦概述 ..前言 ,新疆维吾尔 斯亚旦,又名瘤果黑种草,拉丁名为族药材,最早引进于巴基斯坦,现今主要 种植于中国的新疆吐鲁番和云南西双版纳。目 前,斯亚旦已作为药材收入了中华人民共和国 药典【’】。 在新疆,斯亚旦在食品方面上常用作调味 剂,是做馕的必备品,能够提升馕的香味,并 富含丰富的营养。在医疗上面,斯亚旦常用于 生发和治疗白癜风,具有活血健脑,补。肾利尿, 通经解毒之功效【击】。 斯亚旦不仅含有丰富的具有药效的有机成 分之外,还富含丰富的微量元素,其同样具有 不可估量的药理作用。目前,在我国探究发现 新药的过程中,从天然植物当中提取有效成分也成为了一种重要的手段,而 斯亚旦中富 含的天然成分结构还有待进一步研究,为我国的医药工作者提供很大的的研 究空间。 ..形态特征 斯亚旦,为毛莨科黑种草属一年生草本植物,株高.厘米,茎直立成圆柱状, 中上部位多成分枝状,上部叶较大,下部叶较 小并伴有褐色短茸毛,蓝色花瓣交互而生,同 时长有绿色和淡黄色的短柄叶,花瓣较小,长 ,成两性,雄蕊比例较大,长约, 种子黑色富有光泽【‘】,花期一般为?月, 果期个月。此外,不同地区种植的黑种草子 略有不同,主要的区别在于花期不同和种子大 小的不同。目前,在新疆,斯亚旦多在私家的 庭院早种植,栽培时与其余观赏花卉相同,不 用作其他特殊精致细腻的处理。伴随着我国中草药事业的迅速发展,斯亚但 的对外贸易 量也在不断扩大,现己进行了大范围种植以及扩大地域进行种植,发展前景 被广泛看好。第一章文献综述 .国内外发展前景 在我国自主研发一类药的进程中,研发手段分为化学合成、半化学合成和天然化学 成分的发掘,所以我国中草药事业的发展对于研究一类新药具有不可忽视的作用。斯亚 旦用于食品方面的实例也是数不胜数,多用于调味剂,在药用方面更可以用于治疗关节 痛和风湿性关节炎以及白癜风等【。但是,斯亚旦中还有很多未知的化学成分没有被发 现,我国对其具体化学成分的探究还少之又少。在国外,对其化学成分研究也是停滞不 前,如果进一步研究其化学成分的种类以及具体结构,可以对未来发现有药用活性的成 分提供实际参考依据,并具有重大意义。 ..斯亚旦化学成分分类 目前,国内外对斯亚旦的研究主要存在几个问题,主要是还未具体确定其化学成分, 以及每种成分的生物活性及药理活性,只是简要报道了很少的几大类成分【,具体如下: 、苯酚类,目前,文献报道了该类化合物有四个,结构均比较简单; 、皂昔类,据文献报道,斯亚旦中所含的皂苷提取物经水解后,得到常春藤皂 苷 元,再经水解可得鼠李糖,葡萄糖,木糖和阿拉伯糖,可见其中的皂苷类成分 大多是皂苷元与各种糖类的连接; 、甾醇类,目前,从斯亚旦中分离出的甾醇类成分有一个: 、烯烃类,目前,从斯亚旦中分离出的烯烃类成分有一个; 、二糖类,目前,从斯亚旦中分离出的二糖类成分有一个; 、三糖类,目前,从斯亚旦中分离出的三糖类有一个为黑种草三糖; 、黄酮类,目前,从斯亚旦中分离出的黄酮类成分有三个; 、生物碱类,目前,从斯亚旦中分离出的生物碱类成分有三个。 .苯酞类成分概述 ..简介 苯酞类化合物广泛存在于植物,真菌,苔类和海洋当中。全世界已在使用的传统草 药、民族医药、营养保健品和食品调味料中有很多成分都是苯酞类成分。在自然界中, 大概有多种天然苯酞类化合物起源于植物和海洋当中。这些天然苯酞类成分的生物 活性和药理作用有以下几个方面:、保护中枢神经系统;、抗血小板聚集和抗血栓形 成;、调节心脏和抗心绞痛;、抑制肌细胞增殖;、对脑缺血进行保护;、使平滑 肌放松。 ..苯酞类化合物的分类及来源 到目前为止,已分离出的天然苯酞类化合物约种。这些物种属于科,为石蒜第一章文献综述 科,夹竹桃科,马兜铃科,菊科,小檗科,紫葳科,豆科,龙胆科,禾本科,唇形科, 马钱科,金虎尾科,兰科, 禾本科,蓼科,毛茛科,鼠李科,蔷薇科,芸香科,伞形 科植物伞形科等。大多数所标识的具有生物活性的天然苯酞类,是从伞形科中两个属 的川芎和当归中分离出来的,这些大多数被用作中药【。例如,中草药川芎,一个最 中国常用中药材用于治疗脑心血管疾病,是来自川芎根茎。著名的中医草药也记载,当 归中的天然苯酞类成分用于治疗女性的月经不调。此外,很多苯酞类化合物已确定是是 从经常食用的芹菜属伞形科中分离出来的。基于化学结构的不同,天然苯酞类成分的可 分为四类:、位取代的苯酞类衍生物;、非位取代的苯酞类衍生物;、苯酞类二 聚体;、苯酞类异喹啉。 其中,非位取代的苯衍生物酞类进一步分为两种类型,即非生物碱类苯酞和和生 物碱类苯酞。此外,几个从未确定的天然苯酞类化合物在近几年被归类为苯酞异喹啉衍 生物,虽然这些天然化合物中的不再有完整的呋喃酮和异喹啉的核心结构,然而,他们 却包含相关的呋喃酮和异喹啉的结构,如减少羰基组中的苯并呋喃酮或打开在异喹啉中 成环的部分。这些苯酞类化合物均是其立体化学结构的异构体或对映体。 四种类型的天然苯酞类成分在自然界的分布情况不均,大部分的天然苯酞类化合物 属于位取代的苯酞类衍生物,占约总体的%。非位取代的苯酞类衍生物占总体的 %,苯酞类二聚体和苯酞类异喹啉分别占%和%。天然存在的苯酞类化合物,和非 生物碱类苯酞构成最重要的苯酞类化合物,不仅是由于他们丰富的自然属性,而且都被 广泛报道的其具有药理活性和生物活性。 ..苯酞类化合物的药用价值和用途以及国内外研究进展 自古以来,苯酞类成分已被用于全球草药、传统医药、民间用药以及膳食补充剂和 食品调味料等方面【 。而在我国,苯酞类成分中有一部分是最常用的天然药物。其中两 个最有名的和最常用的苯酞类成分都用于中药外敷,为川芎和当归,用于治 疗脑和心脑 血管疾病超过两千年】。目前越来越多的国内外学者致力于中医药的研究,最近的研 究集中在了中医药的起源上,在天然苯酞类化合物中,如丁烯酰和丁基苯酞多作为研究 对象,这些天然苯酞类的药理活性广泛,范围从局部抑制平滑肌收缩到中央抗惊厥药。 除了一般使用具有生物活性的苯酞类化合物作为药物以外,近年来,一些一直以来被孤 立的苯酞类化合物正在开发作为纯剂型药物来治疗脑血管和心血管疾病。 随着越来越多的经济利润在全球的天然产品和草药当中产生,国内外对具有生物活 性的天然存在的苯酞类成分的认识也在不断增加。在国外,对天然药物的研究过程中已 经分离出天然苯酞类成分,尽管大多数临床上常用的天然苯酞类化合物多为其衍生物, 但这不影响其对全球药物发展所做的贡献。 在我国,专注于用三种常用的苯酞成分作为医疗用途,用其进行中药外敷。在“我 国药典”记载中,当归和川芎,主要是用于“血滞综合征”引起的疼痛,体现了天然苯 酞类化合物的镇痛作用。根据中医理论,其关系到促进血液循环、清除血液 淤滞。在 民问,当归中的苯酞类成分主要是用于治疗妇科疾病如月经不调、闭经、痛经等。川芎 中的苯酞类成分通常是用于治疗偏头痛和头痛。这两种草药也用于治疗哮喘、中风和心第一章文献综述 绞痛,其中川芎中的苯酞类成分作为一个头痛止痛药的标准被广泛应用。 在混合草药或原料中草药材的提取中,早期的工作主要集中在提取苯酞的异喹啉类 衍生物。其中,自然产生的苯酞类异喹啉荷包牡丹碱和白毛茛碱的药理作用备受关注, 已被广泛使用为受体拮抗剂并作为药理学工具,那可汀是一个临床上常用 的著名止咳剂,虽然其作用机制知之甚少,但被认为是对.阿片受体拮抗作用最强的天 然药物,那可汀其他潜在的治疗用途汀还有有治疗中风和癌症。 苯酞类化合物虽然在自然界中分布很少,但其以丰富的生物多样性而闻名,下面主 要介绍年之后在自然界中发现的天然苯酞类成分,其名称、化学结构、分子量、分 子式以及来源如表.及图.。 表.自然界中已发现的天然苯酞类有效成分 .【】 “翻 彳矗 口?们 篙?三泓触??增, ,,,, . 】 ,’’, 【】 , 灿‘纰 ?咀 . 】 】【】 】 , 曼洒姗够竺,.. 三幽嬲麟胁/ :】 泓打倒,;;.“二。悟第一章文献综述 觎 咯~?“??~?学 够署 他灿弘州,一叫,矾;如 。,主笼:如“口砒;//.. 一,,,? , ’一, ,,,一, 一,,,一一 却胁 】 一 】】 】 【】 【】】】】 一. 】【】】 】 】】【】 【】 】 一 . 【】?川 凰 【】 ,甾穿胁抛 一.第一章文献综述 /“\/ : 、、:?兰一/: 卫 % ? 对 ..第一章文献综述 ‰。 矗 爷 \ ~ 铲 一 啦 羚 蓼 ..第一章文献综述 、.念。厂叫 多 图.苯酞类化合物 .. ..苯酞类成分小结 目前,国内外研究工作者对自然界中的苯酞类化合物的药理作用产生了越来 越大的 兴趣,而丁基苯酞已经作为药物在中国上市。但从现代医学的角度来看,含有 苯酞类成 分的草药仍然处于研究阶段,它们之间的相似之处虽有,但不同苯酞类成分 的药理作用 和它们的潜在疗效仍是未来研究工作者研究的重点。天然苯酞类成分结构简单,生物活 性却不同于其他类天然化合物,同时苯酞也可以成为一个理想化合物的化学修饰,以提 高药物的药理活性,所以对苯酞类成分的相关研究是具有重大意义的。第二章斯亚旦有效化学成分研究 第二章斯亚旦有效成分研究 .实验仪器及药品 ..实验仪器 实验仪器及规格如表.所示 表.实验设备 . 第二章斯亚旦有效化学成分研究 ..实验药品 实验药品及规格如表.所。 表.原料与试剂 . .斯亚旦浸膏的提取与提取工艺 取榨过油的黑种草子饼,经%回流提取次,%回流提取 次,水回流提取次,每次小时,回收溶剂,低温干燥,得总浸膏。加适量水温热溶 解,依此用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取,回收溶剂得部分浸膏,剩余水层浓缩得 浸膏。取这部分药膏进行薄层层析分析,粗略确定每部分药膏存在的有效成分个数, 石油醚,乙酸乙酯,正丁醇萃取物经大型硅胶柱层,几个值相近的化合物为一组, 分离出数组,然后把这些组分反复硅胶柱层析或反相硅胶柱,凝胶柱,制备柱等一系列 方法得化合物,然后把分离出的化合物分别确定其构型,具体分离流程如图.所示。第二章斯亚旦有效化学成分研究 一 圈囝囝圉 图.斯亚旦有效化学成分的提取与初步分离流程图 .. 印 .斯亚旦有效成分的分离步骤及方法 、化合物: 取石油醚浸膏部分,用二氯甲烷:甲醇:?:进行梯度洗脱经.目硅 胶柱层析分离,回收溶剂,低温干燥,得不同组分的洗脱浸膏,取用二氯甲烷:甲醇 :部分洗脱下来的浸膏在洗脱剂不变的条件下继续反复进行柱层析分离,经检 测,相同的组分合并,回收溶剂,低温干燥得化合物。 、化合物: 取石油醚浸膏部分,用二氯甲烷:甲醇::和纯甲醇进行梯度洗脱经 .目硅胶柱层析分离,回收溶剂,低温干燥,得个组分的洗脱浸膏,取用二氯 甲烷:甲醇:部分洗脱下来的浸膏在洗脱剂不变的条件下继续反复进行柱层 析分 离,经检测,厂相同的组分合并,回收溶剂,低温干燥得化合物。 、化合物: 取正丁醇浸膏部分,用洗脱剂二氯甲烷:甲醇:水::.洗脱经.目硅 胶柱反复层析分离,经检测,相同的组分合并,回收溶剂,低温干燥得化合物 。 、化合物: 取石油醚浸膏部分经梯度洗脱过后的第部分浸膏,用二氯甲烷:甲醇:进第二 章斯亚旦有效化学成分研究 行反复柱层析分离,经检测,,相同的组分合并,回收溶剂,低温干燥得化合物 。 、化合物: 取水浸膏部分用洗脱剂二氯甲烷:甲醇:水::.?::.进行梯度洗脱, ,值相近成分合并得部分浸膏,取第部分浸膏用洗脱剂二氯甲烷:甲醇:水;: .洗脱,相同的组分合并,回收溶剂,低温干燥得化合物。 、化合物: 取乙酸乙酯浸膏部分用洗脱剂二氯甲烷:甲醇::进行梯度洗脱,得 部分浸膏,取第部分浸膏用洗脱剂二氯甲烷:甲醇:洗脱,反复柱层析分离, 经检测, 相同的组分合并,回收溶剂,低温干燥得化合物。 、化合物: 取乙酸乙酯浸膏部分经梯度洗脱后的第部分用洗脱机二氯甲烷:甲醇:水:: .洗脱,反复柱层析分离,经检测,,相同的组分合并,回收溶剂,低温干燥得 化合物。 .斯亚旦有效成分结构解析 ..对羟基苯甲酸 ~。。~:,,,,,。 白色粉末, 得知化合物中含有羧基和苯环。 /%:十,,,。 :.,,乒.,一,,.,,./.,一,。得 知是化合物为对称系统,含有对称的存在。.谱图中, .出现一个单峰, .出现的 为化合物羰基峰, .出现一个单峰,为羟基与苯环相连上的峰, .的单峰为与羰基 单峰为苯环,位的, .出现的单峰为苯环,为的, 。 相连的,故鉴定此化合物为对羟基苯甲酸 见表 闩 ?氐分一 表.化合物的核磁数据 . , 第二章斯亚旦有效化学成分研究 ..胡萝卜苷 。。反应阳性,/曼应阳性。 白色粉末, :,,,,。 比%:,, ,, ,,,。与已知胡萝卜苷对照品【删对照, 彤值相同,混合熔点不下降。由以上结果确定该化合物为胡萝卜苷。 ..甘油 .。。:,,,,。得知该化合 无色液体, 物存在羟基。..,,.,.,一,, ., ,,., .,.。,。,得知该化合物具有对称性,含有对称的存在,并根据 化学位移推断出这个都是亚甲基上的。:.,,.】.,推断出该是次 甲基上的。.:..,,...根据积分比推断出该化合物含 .出现的单峰为次甲基 有个,且在 .出现的单峰为个亚甲基上的,在 上的,通过以上结论推断化合物为甘油。见表. 广 表.化合物的核磁数据 . ,第二章斯亚旦有效化学成分研究 .. 一亚油酸.甘油酯 . 淡黄色固状物,在中, .出现一个三重峰,为甲基上的个, 出现一个宽单峰,为亚甲基上的个,并根据积分比得出一共有个,从而推断出 有个亚甲基, .出现了一个多重峰,根据其化学位移特点推断它是碳碳双键上的 .出 ,并根据积分比得出一共有个,从而推断出该化合物含有个碳碳双键, 现了一个多重峰推断是亚甲基上的,由于受到碳碳双键的影响而使其化学位移增大移向 低场, .出现一个三重峰也是亚甲基上的由于受到碳碳双键的影响而使其化学位 移增大移向低场, .出现一个多重峰, .出现一个三重峰和 .出现一个双 峰从化学位移上推断都应是亚甲基上的,而它们化学位移的增大都应是受某一个化学 基团的影响而移向低场,根据 .所出现的三重峰推断其旁边应有一个亚甲基与之相 连,根据 .所出现一个双峰推断其旁边应有一个次甲基与之相连, .出现一 个 .和 .均出现了一个双峰,且他们的耦合常数不 多重峰,应是次甲基上的, 同,推断它们都是亚甲基上的峰只是因为磁不等价导致了化学位移的不同。 .。存在 在中,低场区给出个呈现羰基特征信号分别为 个碳碳双键的特征信号为.,.,.,.。存在亚甲基的特征信号为 ., .。 ., ..., ., ., ., .并且推断它们之间有 .,此外,信号;., 相互连接的可能,高场区给出个呈现单峰的甲基特征信号为 ., .应是与羰基有相关的亚甲基和次甲基,从而导致了化学位移的增大。 综上所述,推断化合物为.亚油酸.甘油酯。见表. 表.化合物的核磁数据 .,第二章斯亚旦有效化学成分研究 ????????????一一 .,,., .,.,,,., . . ., . .,,,. . ’ . ‖ .,,,. . ., . ‖ .,. . ‖ .,. . ‖ .,. . ‖ .,. . ‖ ., . 旷 ., . ., . ? .,,,. . 屹 .? . ., . ., . .,. . 怕 .,. . .,. . ’ .,,乒. . ..丙氨酸 白色结晶,。,~:,,,,,,。 推断化合物中含有羧基和氨基。在,甲基的特征信号为 .,次甲基 的特征信号为 .,羧基的特征信号为 .。在中,甲基的特征信 号为 .,次甲基的特征信号为 .,羧基的特征信号为 .。综上所述,推断 该化合物为丙氨酸。见表. ..第二章斯亚旦有效化学成分研究 ?? 表.化合物的核磁数据 . , . ., . ., ..黑种草酞苷 ~?,化合物水解,得到一个葡萄糖,推断化合物中有葡萄 棕黄色粉末, 糖的存在。根据. / .【,计算出分子式为 .,根据? / .。,? / .,推断化合物分子量,质谱中. ...】 ,/ 一应是源于葡萄糖的水解,由此可证实该化合物的确含有葡萄糖。 通过】俎在有伸缩振动峰推断化合物中有羟基的存在,在 处有吸收峰推断化合物中存在不饱和双键和内酯,在谢, 。的吸收峰是 苯环的伸缩振动峰,说明化合物中含有苯环。下,最大吸收波长为, ,姗。 在和中,可以推断出该化合物含有个,在高场出现的个甲 ., 基的特征信号为 .。在 中可以看出,甲基和次甲基的个数总和 个,亚甲基的个数为个。在 中可以看出,次甲基的个数为个。且次甲基 ., ., ., 的特征信号为 .,根据化学位移推断这个应是葡萄上 的,为。 ., ., .则可能是苯环上的或者是受其他基团影响而 使其化学位移增大的不饱和双键上的或者是葡萄糖上与其他化学基团相连 的。 .为羰基的特征信号。 .和 .是不饱和双键的特征信号。推断该化合 物含有环内酯和不饱和双键。 在.中,高场区的个呈现单峰的甲基特征信号为 ., .,通过积 分比进一步断定化合物还有个甲基。 .为苯环上的特征信号, .出现的 ., ., ., ., ., ., 重峰则是不饱和双键上的,而出现在 .则是葡萄糖次甲基上的,而 .上的化学位移相较于其他的化学位移偏 大应是与其他基团相连所导致。 .对应的有相关性, 在中, 对应的的与 .对应的与 . .对应的有相关性, .对应的与 .对应的有相关性,同时,第二章斯亚旦有效 化学成分研究 对应的与 ., ., .对应的相关,根据 .对应的的相关性推 断该化合物的环内酯与苯环并连。 在中, .对应的与 .对应的有相关性,由此可证明羰基 . .和葡萄糖上的分列在苯环上 .的两边,并根据 .对应的与 对应的相关推断含有个甲基的不饱和双键链与环内酯位置相近,相连于与苯 环上。 综上所述,根据 .,,和谱推断出了该化合 物的结构,并将其命名为黑种草酞苷。见图.,表. 对推断出该化合物最关键的相关峰如下所示。图. 图.化合物结构左与相关图右 .. ?表.化合物核磁数据 .,第二章斯亚旦有效化学成分研究 ..异株五加甲苷 白色粉末,。,:,,,,,, 。推断出化合物中含有羰基、羟基和不饱和双键。.反应阳性, 反应阳性,薄层酸水解后,显示有葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和鼠李糖进一步 推断该化合物可能为皂苷类化合物。 ., ., ., ., ., 在,个甲基的特征信号为 .。在低场区 .出现的单峰为不饱和双键的特征信号,而出现在 ., ., ., ., .,.的信号为个糖的端基信号。 ., 在?中, .为个杂化碳信号,与文献数据【】 对比得知,该化合物是以常春藤皂苷元为基本结构骨架, .为葡萄糖端基碳 成酯的 ., 信号,而 .对应的与文献中出现了化学位移上的偏差推断这个上 分别与糖相连。在加上葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和鼠李糖特定的化学信号见 下节数据 图,化合物的化学结构。表.第二章斯亚旦有效化学成分研究 表.化合物的核磁数据 ., . . . .. . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . .. 小 . ,,. .,,. . . . . . . . ’ . ’ . . 一?第二章斯亚旦有效化学成分研究 . . . , .,,./. . . . .,,.. . . . . . . 旧 . .,,.. ., ‖矿‖苟? . . . . .,,. 。 . . . ‰?”‖科‰””””轳. . .结构鉴定数据 、对羟基苯甲酸: 白色粉末, ~。。~:,,,,,。 : .,,,.,.,,.,,.,.,,。 ..,..,, ..,,.,. 。 、甘油: 无色液体, .。。一:,,,,。: .,,,., .,一,,.,,,., .,,, .,,.。: ..,,..。 、.亚油酸甘油酯: 淡黄色固状物,:.,,,.,’.,., .,’ ’, ‘ 。,.,,’,.,,一’ 一’, .,,.,’,.,,., ’,.,,,., 一,.,,,.,,,.,.,,.,,,., . .,?,.,,一’,一’,一’ 一’。”: 一’, ,.一,.,.,.一.,.’,.?.一’,. .’ 一’,.,.,. .一’,’, ’,.一’,?’,.’,.’。 一.第二章斯亚旦有效化学成分研究 、丙氨酸: 白色结晶,。,一:,,,,,,。 : .,,.,,.,。: .., ., .一。 、黑种草酞苷: ??; 棕色固体粉末, . .,。 .,.,.。~:,,,,, , ,,】。 / .【。;?。 一.’,,以.【?一一; 删 .【, . ,一.【/ .【,.【】;. . / ; .【 。,: .,,’,.,,, .,,.,. ,一’,.,,,.,. ,”,.,, 一”,.,,.,. ,”,.,,.,. ,?”, ,一”,., .,,,.,. ,”,.,,’,. ,,. ,,,.,。一,.,, ,一”,.,,.,. 。?,:.,.?,.一,.一, .?,.,.一,.,.?,,.’,.,, .,.一’,.”,.”,.”,.一”,.一”, .”。 、异株五加甲苷: 白色粉末, .。,~:,,,,,, 。?..., 。?反应阳性,反应阳性, ., 薄层酸水解后显示有葡莓糖、阿拉伯糖、木糖和鼠李糖。.:.,.,.,.,. 各,,,.,,., ,.,.,,., 一 , , ,,. ?,.,,./. .,.,,./.,,. ,.,.,,.,, , 。’ ,,/. ,.,,一 ? .一,.?,.一,.,.,. : ?,. ,.一,. ?,. 一, ,..,.一,. ,.,. ,.,. .,.?,.一,. ,. ,. ,. 一? 一? ,.,.,. ,. ? 一, .,.. 一? ,.,.一,. 一.第二章斯亚旦有效化学成分研究 .一,.,.,.,.一,.,., .,.,.一,.一,.,.一,.?, .一,.一,.,.一,.,.,., .一,.?,.一,.一,.,., ., ., ., .。 .细胞毒活性成分筛选 一、实验方法 .材料:人体前列腺癌细胞株.,得自美国 。 胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司。四氮唑溴一,一 ...,. 为公司产品。酶标仪为美国 公司产品。 .细胞培养:.用培养基加%胎牛血清常规培养传代。接种细胞到 孔板,接种密度为/孔。%培养箱。培养小时后,按常规加药药物最后 浓度为,,,,,对照组加等容积的。继续在%和培养箱 中培养小时。加浓度为/ ./孔。%培养箱孵育小 时后,加入的后震摇分钟溶解沉淀,用酶标仪在测定吸光度值。 最后计算值。 二、筛选结果 用法检测了化合物对羟基苯甲酸和异株五加甲苷对.前列腺癌细胞 株和.乳腺癌细胞株的细胞毒性。化合物对一乳腺癌细胞株的作用不 明显,测不出值大于止,但化合物对一前列腺癌细胞株的值为 .?,说明异株五加甲苷为斯亚旦中在体外对前列腺癌有较好抑制活性的成 分之 .本章小结 通过应用现代色谱技术进行分离,根据理化性质和现代波谱技术对分离所得 的个 化合物进行结构鉴定,分别为对羟基苯甲酸,胡萝卜苷,甘油,亚油酸甘油 酯,丙氨酸,黑种草酞苷,异株五加甲苷,其中化合物为新的天然苯酞类 化合物,化合物为首次从该植物中提取得到。表.列出了从斯亚旦中提取分离 纯化得到的有效成分的名称,化学结构,及鉴定方法。第二章斯亚旦有效化学 成分研究 表.斯亚旦中有效成分名称,化学结构及鉴定方法 . 编号 名称 化学结构 鉴定方法 对羟基苯甲酸 ?如。 胡萝卜苷. 甘油 /\/\ .亚油酸甘油酯 丙氨酸 黑种草酞苷 木 一.第二章斯亚旦有效化学成分研究 木为新的化合物,化合物和化合物为首次从该植物中提取得到 本章介绍了利用各种色谱分离纯化技术成功的从斯亚旦中分离纯化了个有效成 分,而由于苯酞类天然成分在自然界中分布稀有却生物多样和药理活性丰富的特点,我 们重点对斯皿旦中的苯酞类成分进行研究,并且成功分离纯化了一个结构骨架含罕有的 异戊烯基苯酞类的天然糖苷成分一黑种草酞苷,并且证明了它是首次在自然 界中发现的 天然成分,它的发现对植物分类学具有重大意义,说明了黑种草所在的毛莨科植物中也 存在天然苯酞类成分。黑种草酞苷的发现对促进国内外研究者对斯亚旦进行进一步研究 提供了物质基础。伴随着黑种草酞苷的发现,我们还从斯亚旦中分离纯化了个化合物, 其中作为油脂类的.亚油酸甘油酯是首次从斯亚旦中提取得到,由于斯亚旦中的油类成 分和油脂类成分被广泛应用于生发和白癫疯的治疗当中,所以.亚油酸甘油酯的发现对 于作为药用植物的斯亚旦来讲也是极其有意义的,同时得到了一个丙氨酸,而丙氨酸作 为人体的非必需氨基酸,有助于缓和低血糖,改善身体能量并对人体进行营养增补,具 有预防肾结石、协助葡萄糖的代谢的功能。在分离研究的过程中,发现在斯亚旦中丙氨 酸的含量很大,所以很有开发利用的价值,最后在分离的过程中纯化到一个皂苷类化合 物,结构比较复杂,研究表明其具有药理活性,所以在下一章中又对其做了进一步的研 究。第三章异株五加甲苷的标准曲线及含量测定 第三章异株五加甲苷的含量测定 .实验仪器与药品试剂 ..实验仪器 本实验所需仪器及规格如表.所示。 表.实验仪器第三章异株五加甲苷的标准曲线及含量测定 ..试剂及药品 本实验所需药品及试剂规格如表.所示。 表.试剂及药品 . .色谱条件 检测器:;色谱柱: 柱.,;检测波长为 ,灵敏度:.:流动相为甲醇一水::柱温为。;流速:./。 如图.所示,.峰为异株五加甲苷。 幽.异株五加甲茁样品色谱幽铲 .. 第三章异株五加甲苷的标准曲线及含量测定 .样品分析 ..对照品溶液的制备 用电子分析天平精确称取异株五加甲苷对照品置于容量瓶中,用甲醇: 水:溶解并定容至刻度,备用。 ..标准曲线的绘制 分别精密量取对照品溶液肛,.“,,./,。按上述条件测定,以甲 醇:水:为流动相,以峰面积积分值的对数为纵坐标,以异株五加甲苷的质量 的 . 对数为横坐标,绘制标准曲线,得方程: ..表明在 .范围内,峰面积的对数值与对照品质量的对数值成良好的线性关系。如图., .,表.所示。 . . . ??如 嘶妇硫 ; \ 皇 羞? 墨 . 窝 一 一:‰? 玷?? 玎七 、萋 如/\。~ 拍零 “ ?呻哺慨 .第三章异株五加甲苷的标准曲线及含量测定 咽 乏蟾 旦妇 “ & 皇 厂\ \ 雪 / 入 簋 高 一 ??矾岫 碟朗颤 ‘ “ 雩 八 里 ,冲\。 罨 圃伯 锚 ?自?曩 . 曲秘:日; 嘶呻 ‘ 八 等 \ ? ?? . , 争\ 嚣 璺 匝 圃 撕惟 图.异株五加甲苷对照晶色谱图~ .. 一?第三章异株五加甲苷的标准曲线及含量测定 表.标准曲线峰面积 . . . . 《 旦. . . . . . . . .图.标准曲线.. ..样品处理 取黑种草中药材,精密称定,置于圆底烧瓶中,用%乙醇,%乙醇 和甲醇回流,每种提取溶剂的回流次数均为次,次的提取时问分别为,,, 每次均加入提取溶剂,最后将提取液部分放入恒温水浴锅。热直至成膏 恒重,对比每种提取溶剂的提取量大小,结果发现%乙醇的提取量最大。 ..供试液的制备 以%乙醇为提取溶剂,按上述方法得水提取液浸膏样品,精密称取样品.,用 甲醇:水:溶解,并定容于容量瓶中,备用。 ..精密度实验 精密吸取序号为的对照品溶液,连续进样次测定,测定峰面积的第三章异株 五加甲苷的标准曲线及含量测定 相对标准偏差,表明仪器的的精密度良好,如表.,图.所示。 表.精密度数据 曲 .序号 峰面积 。耳一下 黼一啪 .% 样品序号 样品序号 啪瞻~ “ 腿 口 样品序号 样品序号 ..