细胞传感器及纳米
生物相容性研究
湖南大学
博士学位论文
细胞传感器及纳米材料生物相容性研究
姓名:肖锡林
申请学位级别:博士
专业:分析化学
指导教师:姚守拙;蔡青云
20100101
博士学位论文
摘 要
本论文开展了细胞传感新方法和纳米材料生物相容性的研究。纳米生物材料
是纳米材料和生物材料交叉而成的一个全新领域。纳米尺度的特殊生物效应使得
纳米生物材料具有广泛的应用前景。细胞体外分析对细胞生理学行为的研究以及
药物的体外筛选都具有重要意义。纳米生物材料细胞相容性界面的构建对促进细
胞传感器的研制、组织工程的发展和组织工程材料的临床应用都起着重要的作
用。磁弹性传感器是近几年迅速发展起来的无线无源传感器,在活体、在体及无
损检测等领域具有广泛的应用前景,特别适用于需无菌操作 如细胞检测 的科
学实验中。另外,细胞的新陈代谢、呼吸作用、光合作用、信息传递、物质的跨
膜运输等活动都涉及到细胞荷电粒子或电活性粒子的定向有序传递、传导或转
移,即涉及到细胞物质有序、专一、特异的氧化和还原。电化学方法具有简单、
快速、方便等优点。因此,可用电化学手段研究细胞的生理行为或评估药物与细
胞的相互作用等。基于上述描述,本论文主要进行了以下几方面的研究工作:
1(乳腺癌细胞 MCF(7 无线磁弹性传感器制各及应用。本工作应用无线
传感器原位监测了MCF(7细胞的正常生长及抗癌药物作用下的生长过程,评价
了5(氟尿嘧啶和顺铂对MCF(7细胞生长的抑制效果。无线传感器是由非
晶态金
属铁合金磁条带切割而成的矩形磁振片,表面涂一层聚氨酯膜保护磁振片不被氧
化腐蚀,提供一个细胞相容性好的细胞生长附着面。传感器在一定频率范围内的
激发磁场中振动,振动产生的电磁流可以通过感应线圈远距离遥感检测,而传感
器与检测系统无需任何物理连接,这一特性有利于实现生物实验过程的无菌操
作,特别是细胞培养过程。MCF(7细胞贴附在传感器表面生长,可引起传感器
共振振辐减小,并且共振振幅的减少与细胞的初始接种浓度成线性关系,线性范
围为5×l04,l×106cells cells
mL一,检出限为1(2×104mL,。本工作中通过
增大激发共振振辐来评价细胞贴壁的生长能力,并用磁传感器评价了5(氟尿嘧
啶和顺铂这两种抗癌药物对MCF(7细胞生长的抑制作用。当MCF(7细胞生长到
20
2(西幽P,(记^砌cD,f
0157:H7 EcD,f
0157:H7 无线磁弹性传感器制备及应
用。以预聚合了聚氨酯膜的磁性膜片为敏感元件,制备了无线磁弹性微生物传感
器;研究了微生物生长导致培养基性质 如黏度、密度等 改变对传感器共振频
率的影响,考察了细菌在传感器表面吸附对传感器响应的贡献;研究了庆大霉素
注射液对E(cD,f
0157:H7生长的抑制作用,依据庆大霉素注射液对细菌的抑制作
cD,f
用可以进行抗生素的药效评测。E
0157:H7的生长和繁殖导致溶液黏度减
小,从而引起磁弹性传感器共振频率增大;细菌生长过程中在传感器表面有一定
吸附,从而引起传感器共振频率减小,溶液性质变化和细菌吸附程度共同影响共
细胞传感器及纳米材料生物相容性研究
co,f
cells
振频率的变化。该传感器可测定的E 0157:H7浓度为2×102,3×106
02cells
mL一,检测限为1 mL,。基于此,建立了可用于细菌早期诊断和快速分析
的无线磁弹性传感检测新方法。
3(支原体无线磁弹性传感器制备及应用。支原体是最小、最简单、能够自
我复制的无细胞壁致病微生物。本文应用无线磁弹性传感器实时监测了生殖支原
体的正常生长及抗生素抑制生长过程,评价了四环素和左氧氟沙星对生殖支原体
的抑制效果。无线传感器是由28um厚的带状非晶态铁磁合金2826MB
Fe40Ni38M04Bl8 切割而成的矩形磁振片,表面涂一层聚氨基甲酸酯膜保护磁
振片不被氧化腐蚀,为生殖支原体提供了一个生长附着面。传感器在一定频率范
围内的激发磁场中纵向振动,振动产生的磁通量可以通过感应线圈远距离遥感检
测,而传感器与检测系统无需任何物理连接,这一特性有利于实现生殖支原体培
养过程的无菌操作。生殖支原体黏附在传感器表面生长使传感器共振频率下降,
共振频率下降值与生殖支原体的接种浓度存在线性关系,通过细菌生长抑制实验
h时,四
环
评价了两种抗生素的抑制效果。由实验得到,当细菌生长时间为120
mL,。
素的平均抑制浓度 MIC50 为1(5mL,,左氧氟沙星的MIC50为0(5
pg pg
4(大肠杆菌碳纳米管方波伏安传感器制备及应用。采用循环伏安和方波伏
安技术研究了多壁碳纳米管 MWCNTS 修饰玻碳电极上大肠杆菌细胞的电化
学行为。与裸玻碳电极相比,修饰电极对细胞悬浮液中电化学活性物质的氧化有
催化作用。在细胞生长过程中,各个时期的细胞活性与方波伏安分析信号趋势一
致。利用该技术评估了抗生素庆大霉素对大肠杆菌细胞的活性抑制作用,同时用
形态学技术进行了验证。
Ti片阳极氧化技术制得管径大约为100nm,且易于被酒精分散或从Ti片基底上
分离的良好的Ti02NTS。为了探索此种纳米结构的细胞相容性及组织工程应用
的可能,通过使用荧光显微镜,研究和比较了不同的癌细胞以及正常细胞在此种
材料表面生长的情况。实验结果表明此种新的生物材料能够维持细胞的生长,并
且不需要被覆细胞外基质 Extracellularmatrix,ECM 。相继研究了纳米管中顺
铂药物的释放动力学及对成骨肉瘤细胞 human
cm×l
的影响。表面积为O(75 cm的二氧化钛基底上实验载药量分别为75“g、
药Ti02NTs能够有效地减少MG(63细胞在纳米管表面的贴附。这些研究发现表
明,Ti02NTs是一种良好的潜在载药材料,并且有希望在移植工程 尤其是肿瘤
切除病例 中发挥巨大的作用。
关键词:生物相容性;Ti02纳米管阵列;磁致弹性传感器;细胞;微生物;方
波伏安;碳纳米管
III
stract
Ab
of
the
devotedto biocompatibility
is study
Thisdissertation
mainly
isa
methodforcell
thenewsensor
nanobiomaterialsand
and
whichcombinesnanomaterialsbiological
newfield
sizeeflfecton
totheir bio。
systems??In
due
have special
manypotentialapplications
for
areof manyaspects
culturedcells studying
vitro greatsignmcance
assaysusing
ofcellular
Theconstruction compatible
cell and
of drugscreening(
biology
of
roleforthefabrication
a
nanomaterials
of key
plays
cytocompatible interface
of。
tlssue
the
could deVelopment
undoubtedlypromote
cell(basedbiosensors,and
and
sensors
sensorsarewireless deVeloped
passiVe
engineering(Magnetoelastic
lta
sensormakes
natureofthe
wireless magnetoelastic
inrecent
rapidly years(The
for
insituandinvivo
approprlate
candidatefor analysis,particularly
powerf(uI
metabolism,
ascell
asepticoperations such
andsubstance
communication
respiration,photosynthesis,message
orelectroactlVe
toelectron
specles
cellsareallrelated
of
betweenmembranes
living
is
slmple,
manner(ElectrochemicalVery
orderand technique
in
transfering specinc
cell
ot
be usedto aspects
can studymany
and easily
rapid cheap(Therefore,it
dissenation1s
aboVe
onthe
and description,this
drugscreening(Based
biology
the
sensorsand
cell
thewireless
devotedto
magnetoelastic,electrochemical
as
workaresummarlzed
detailsof
nanotube
of arrays(The
Ti02
cytocompatibility
foUows:
cancer
humanbreast
fabricationofwireless
1(The magnetoelastic
thef
靠??slf甜
fbr
was
deVice
wireless deVeloped
sensorandits sensing
application(A
ofthe
ofthe
MCF(7cellsandeValuationcytotoxiclty
ofthe of
monitoringgro州h
a
f(abricated
sensoris coatlng
and by
fluorouraciI
anticancer cisplatin(The
drugs
the
that
witha of protects
sensor
ribbon―like layefpolyurethane
magnetoelastic
surface(Inresponse
and a
f(romoxidation cell―compatible
iron(richsensor
provides
Vibrates,
sensor
longitudinaUy
a
to magneticfield,themagnetoelastic
time(varying
coil(No
detecteda
thatcanbe physical
flux by pick-up
remotely
emittingmagnetic
wireless
are
thedetection
thesensorand required(The
between system
connections
as
culture
incell
facilitates operation,especially
bi0109ical
property aseptic
resultslna
onthesensorsurf(ace
adhesionofcells
inthiswork(The
illustrated
IV
细胞传感器及纳米材料生物相容件研究
decreaseoftheresonance is
tothecellconcentration(
anlplitude,which
proponional
Alinear was
obtainedincellconcentrationsof5×l04,1×106
cells
response mL一1,
withadetectionlimitof1(2×104cellsn1L一1(Theadhesion
ofcellsonthe
strength
sensoris eValuated
the ofthe
qualitatiVely
byincreasingamplitudemagnetic
excitationfield(Andthe
oftheanticancernuorouraciland
cytotoxicity drugs
is
eValuatedthe biosensor(Thecurve
isrelated
cisplatin by magnetoelastic cytostatic
withthe of
ceils
quantitycytostatic
drug(TheLC50 LethalConcentration for
incubatedinthe of for20his
calculatedtobe19(9
for
presencedrugs
pM
nuorouracilandl for
3(1
pMcisplatin(
2(Thefabricationofwireless EcD,fOl
57:
H7sensorandits
magnetoelastic
The
sensoris fabricated a
application(
microorganism by coating
witha film(Bacteria
consume
magnetoelastic-ribbonpolyurethane
protecting
nutrientsfromtheculture
mediumand smallmoleculesthe
produce duringgrowing
a in of
process, culturemedium(The
causingcorrespondingchangeviscosity
resonant ofa
sensor duetothe
flrequencymagnetoelasticchanges
propenieschanges
ofa culturemediumand
theadhesionofbacteriatothesensorsurf(ace(The
liquid
ef诧ctof
sulf乱e
thebacteriawas
of
gent锄ycininjection GSI onproliferation
canbeusedtoevaluatethe
medicamentef亿
ctofantibiotic(The
inVestigated,which
and of
EcD,fOl57:H7decreasesthesolution
in
growth
reproduction viscosity,
and
turnthe
resonance ofthe
sensor
bacteria
flrequencymagnetoelasticincreases,the
adhesion resultsinthedecrease
oftheresonance
of
reVersely
f(requency,change
solution and
bacteriaadhesionaff(ecttheresonance
properties
f(requencytogether(
thedescribedsensorweareableto
E(cD,fO157:H7
Using
directlyquantif-y
concentrationsover
the of2×10z,3×106
cells adetectionlimit
range mL―l,with
of1OzcellsmL,(
awireless is
Thus, sensor
magnetoleasticmicroorganism
fbrthe
and detectionofbacteria(
deVelopedearlydiagnosisrapid
3(Thefabricationof
wireless
magnetoelastic^秒c9p,口J厅zdgP甩f,口,fzf脚 』垤
sensorandits the
smalIestand
bacte“a
application(^匆is
simplestself:replicating
of wall
cell andisahuman Variousdiseases(This
lacking
pathogen
causing
paper
describesthe
and ofthe
real―time,long―termf聆-sff“monitoring
growthof^彳
窖and
eValuationoftheeffbct
oftheantibiotics
andlevofloxacinonthe
tetracycline growth
a
wireless
sensor(Thesensorisfab“cated
a
using magnetoelastic
bycoating
with
a
the
which
magnetoelasticstrip polyurethaneprotectingnlm,
protects
iron-“ch
sensorfromoxidationand
surface(In
proVides
an朋窖一compatibleresponse
toa sensor
vibratesataresonance
time―Varyingmagnetic疗eld,the
longitudinally
V
博’l:学位论文
nuxthatcanbe detecteda coil(
remotely
frequency,emittingmagnetic by pick―up
the are
No connectionsbetweensensorandthedetection
systemrequired(
physical
of the
The flacilitates adhesion sensor
wireless
propeny asepticoperation(The j魄on
inadecreaseintheresonance is tothe
surfaceresults
f equency,whichproportional
of curVesshowsthat
concentrationshifttheresonance
frequency―time
of^但(The
routinecultureconditionthe curVe ofthree
under
growthof^纭iscomposedphases
and the ofthe
whichare
lag,logarithmicstationaryphase,respectiVely(Inpresence
inthe inhibitioncurVesis and
antibiotics,thelagphase growth prolongedobViously
is inhibition
the substitutedadecline
stationaryphase by phase(Thegro、?th of
尥is
theconcentrationoftheantibiotics(The
relatedto
MIC50 MinimalInhibitory
50,of
Concentrationtoinhibitthe of
required growtb
theantibioticsforl20hiscalculatedtobe1(5and0(5 mL
一1f’0r
inthe of
pg
presence
andleVofloxacin
tetracycline respectiVely(
4(Thefabricationof
nanotubessensor
square??wavevoltammetry SWV carbon
for andits
TheelectrochemicalbehaViorofEcDZfcell
EcD,f
application(
carbon
onmuIti-walledcarbon
suspension nanotube MWCNT mod讯edglassy
with
electrodewasstudied
byusingcyclicvoltammetfy CV andSWV(Compared
theMWCNTs-modifiedelectrodeshows
bare carbon
eIectrode,
glassy
inthecell
totheoxidationofelectroactiVe
species
electrocatalyticproperty
baseline-correctedSWV isf(0undtoberelatedtothe
suspension(The signal Viability
cellsandthe wasusedfor the ofEcDZfcells(The
of
growth
technique monitoring
ef(fectofantibioticsGSIonthe ofEco,jcellswasalso
inVestigatedby
drug growth
SWVand methods(
microscopy
haVe
5(The of nanotubeandits
Ti02
cytocompartibility arrays application(We
anodicoxidationofa
well―controlled
Ti02 pure
developed nanotubes N1’s arrayby
the
titaniumsheetinan solution sodiumnuoride(To
explore
electrolytecontaining
of the ofdiff(erent
thisnoVelnanostructured
surface,
cytocompatibility gro、vth
normalcellsonthe fluofescence
cancerand NTssubstratewas
Ti02 inVestigatedby
and
theaimtoevaluateN1’sfilmsassubstratesforcell-based
microscopy,with
newbiomaterial
tissue―based 0urresults thatthis
applications( stronglysuggest
ECM
normal andadhesionofcellswithnoneedfor with
supports growth coating
75
haveloadedthese nanotube cm×1
Ti02 substrates O(75cm withpg,
protein(We
and225 of releasekineticsfromthesenanotubes
1
cisplatin(The
50“g pg cisplatin
onMG一63cell was resultsindicatethatwe
anditsef托ct adhesion
inVestigated(Our
andthe
can fillthenanotubeswiththe
drug drugeluting
effectively antineoplastic
VI
细胞传感器及纳米材料生物相容性研究
reduceMG-63adhesiononthe
nanotubes surface(These
significantly findings
that nanotubeisa candidatefora of
Vehicle
Ti02 potential
suggest deliVery
in
therapeuticagentsimplantabledrugdeliVeryapplications(
nanotube
sensor;
KeyWords:Biocompatibi?ty;Ti02arrays;Magnetoelastic
Cell;Microorganism;Square―waVe
nanotubes
VlI
博卜学位论文
第1章绪论
1(1无线磁弹性传感器
当铁磁体或亚铁磁体在磁场中被磁化时,将伴随发生长度、体积或形状的变
具有的特性。所谓磁致伸缩效应,即铁磁性材料受磁场作用时,它的尺寸大小、
形状会发生变化的效应,其中长度的变化是1847年由焦耳 Joule 发现,统称
为焦耳效应或线性磁致伸缩效应。反过来,几乎所有的磁致伸缩材料受到应力作
用时都会产生磁化状态的变化,这种现象就是所谓的逆磁致伸缩效应。磁致伸缩
的逆效应是应变影响磁化状态,又称为铁磁体的压磁性现象或维拉里效应
E(Villari ,表明磁体的形变与磁化有密切的关系【1-51。
磁致伸缩效应与压电效应相似,但实现有些困难,应用发展较缓慢。无线磁
弹性传感技术是近10年发展起来的新兴传感技术,它是基于磁致伸缩原理设计,
极大的兴趣【_7-10】,并且逐渐形成了传感器领域的一个新兴分支――磁弹性传感
器。磁弹性传感器又称压磁式传感器,是利用铁磁材料的磁弹性效应而工作的传
感器。这种传感器具有输出功率大、抗干扰性能好、负载能力强、在恶劣环境中
能长期可靠地运行等优点。近年来出版的有关化学,生物传感器的专著,已将磁
弹性传感技术作为独立的章节列出„,12】。
无线磁弹性传感器由敏感元件及检测电路两部分构成。敏感元件为无定形非
2605SC 合金带材。几种常用
Metglas
2826MB 和Fe8lBl3(5Si3(5C2 Metglas
无定形非晶薄膜合金带材的性质列于表1(1。非晶薄膜合金的非晶结构使其具磁
各向同性,且易被磁化。在外加交变磁场中,磁性膜片受磁场激发产生磁矩,并
产生沿长度方向的伸缩振动 磁致伸缩 。由于磁性膜片本身是磁性的,其伸缩
振动产生磁通,产生的磁通可被检测线圈检测,其信号经放大可由外部仪器测定。
目前,磁弹性传感器的测定手段主要采用信号发生器、锁相放大器等进行频
谱分
析或采用网络分析仪测定反馈信号。
磁弹性传感器中信号的激发与传送通过磁场进行,传感器与检测仪器之间不
需任何物理连接,也不需提供内部电源,属于完全的无线无源传感器。磁弹性传
感器无线无源特征
了它在许多领域,如密闭不透明容器中的无损测定、活体
分析和在线分析中具有其它传感器所无法比拟的优势Il引。
细胞传感器及纳米材料生物相容性研究
表1(1几种无定形合金片的性能比较
Metglas
MetglasMetglas
MetglasMetglas
Productname
2714A
2605SC2605S2
2826MB2605CO
n 氏
氏
B
豫 担
Composition
S ,巩州胁
M
批? ?吣吣h 耻锄
8(06
18(8
15(6
19(3 22(1
CoerciVity A,m
SaturatedfIux
1(28 O(5l
1(52 1(34
O(84
density,T
Residualflux
O(06 0(04
1(14 0(08
O(04
densitv,T
Inltlal
5(64×10―35(64×lU。
5(64×10―35(64×10一。 5(08×lO一35(08×lO。
2(15×10―32(15×10一’ 6(34×10一36(34×10一’
permeability
1×10一6
30×10一6 27×10―6
12×10一6 35×10―6
Magnetostriction
1(1(1无线磁弹性物理传感器
随着近年的物理研究发展以及其它相关学科的发展,国内外磁致伸缩
效应的
研究和应用开始活跃起来。目前对磁致伸缩效应在物理方面的应用主要有:利用
一牲|I lv
xuIlu参叮p_?_Il嚣,暑比
P咒ssure PSI
图1(1共振频率与气体压力的关系
超磁致伸缩薄膜组成智能性滤波器,用于电视、录像的接收回路中滤去信号中的
杂音;利用磁致伸缩材料制成声纳装置;利用磁致伸缩效应制成位移、速度、加
速度计等。
(2(
博一t(学位论文
例如大气压力和密度是线性相关的,当大气压力直接作用在磁弹性传感器上
时,相当于传感器表面的有效质量负载增加,可引起传感器共振频率的变化,从
而测定大气压力【14-1引。图1(1给出了30
pm厚2826MB和18pm厚2605SC基材构建
的磁弹性传感器共振频率与压力的关系曲线,图中0点表示1个大气压。传感器越
薄、质量越小,压力响应灵敏度越高。如图1(1中两种厚度不同的磁弹性压力传
Hz Hz
感器所对应的灵敏度分别为一8(25
psi一1和一4(88psi,。因为传感器的共振频
移与气体密度导致的质量负载成正比,而气体的密度与其压力成线性关系,所以
传感器的频移与气体压力成正比。
1(1(2无线磁弹性化学传感器
通过在传感器表面修饰对不同气体敏感的化学响应层,可构建用于测定不同
气体的磁弹性化学传感器【19―241,如C02【191、NH3【201传感器等。
图1(2实验操作示意图
cm×4(5cm×6(5
度成正比关系120】。将传感器放到装有气体控制阀的检测池 1(5
cm 里,施加1 Oe的脉冲于直径为10cm的线圈 20匝 上,该线圈对传
6?s、3
测气体,用流量计来控制流速,实验中所需要氮气的湿度由二次蒸馏水经喷气式
鼓泡器来提供,湿度用数字式湿度计来检测。放出一部分检测气体以保证检测池
mL
中气体流速恒为200 min,,所有实验均在室温24士1oC下进行。未修饰的传
细胞传感器及纳米材料生物相容性研究
感器作为参比传感器,来消除压力、温度、液体流速等外界环境对响应的影响。
接着研究了聚合物组分、膜厚度和相对湿度对响应的影响,修饰了聚丙烯酸一异
辛基丙烯酸酯的无线磁弹性NH3传感器可以应用于检测NH3,在NH3浓度小于0(8
vol,。
vol,时成良好的线性关系,大于O(8vol,时成对数关系,检测下限为0(02
在在线、在体、无线检测NH3方面有很好的应用前景。基于类似的原理,可以设
计检测C02的磁弹性化学传感器。丙烯酰胺与异辛基丙烯酸酯发生反应生成聚丙
饰在磁性膜片上制备成检测C02的传感器【l引。
贪
邑
入
乞
a
o
奢
置
?
量
、__,
九
U
盘
o
,
曩
?
图1(3磁弹性传感器共振频率与pH值的关系图
博j:学位论文
磁弹性pH化学传感器是以对溶液pH具有质量响应的pH敏感聚合物或凝胶
为敏感层【25―2引,如以丙烯酸和异辛基丙烯酸酯聚合得到的pH聚合物为敏感膜构
建的磁弹性pH传感器【251。响应pH变化的是聚合物膜,当传感器浸入液
体中,受
溶液pH的影响,在碱性溶液中,聚合物中的羧基发生解离,离子水化及渗透压
增加导致聚合物膨胀,传感器质量负载增加,共振频率减小:相反,在酸性溶液
中,聚合物发生收缩,传感器质量负载减小,共振频率增加。磁弹性pH传感器
5。。当聚合物中丙烯酸和异辛基丙烯酸酯
共振频率与溶液pH的关系如图1(3所示12
单体的摩尔分数分别为20,和80,时,pH传感器在pH 5,9的范围内具有线性
Hz
响应关系,大约是285 pH_1或O(6,pH,。
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图1(4磁弹性葡萄糖传感器对不同浓度葡萄糖溶液的实时响应曲线
基于上述方法构建的磁弹性pH传感器有一个共同的缺点:传感器的响应不
仅与溶液pH有关,还受溶液中离子浓度的影响。要避免离子浓度的干扰,必须
在离子浓度恒定的环境下测定。为了消除溶液中离子浓度的影响,进而设计了磁
弹性传感器阵列【26’2引。例如,在两个传感器上分别涂覆丙烯酸(异辛基丙烯酸酯
共聚物和甲基丙烯酸(3(磺基丙酯(异辛基丙烯酸酯共聚物【2
6。,前者为对溶液
pH
和离子强度皆敏感的聚合物,后者为强的电解质聚合胶,其膨胀只与离子强度有
关而与pH无关。故将两个敏感元件联合起来使用,就可消除离子强度对溶液pH
测定的影响,得到只与pH有关的传感器频移信息,其线性范围为pH5(4一pH7(2,
Hz
灵敏度为310
pH(1 相当于0(6,厂,pH-1 。另外,也可直接在传感器表面涂一
层只对溶液pH敏感而对盐浓度无响应的聚合物,如氯甲基苯乙烯(2,4,5一三氯苯
基丙烯酸酯共聚物,直接测定溶液的pH。
基于pH敏感聚合物随溶液pH变化而膨胀或收缩特性,进一步在其上修饰
某些底物的氧化酶,使得底物在酶的催化作用下分解,pH发生改变,导致pH
聚合物质量发生改变,基于此可间接检测相应酶底物,如葡萄糖‘29―321、乳糖【”】、
细胞传感器及纳米材料生物相容性研究
有机磷【321等。磁弹性葡萄糖传感器的制备‘291,首先在传感器表面涂一层pH敏
感聚合物,再通过共价交联法固定葡萄糖氧化酶。葡萄糖氧化酶催化氧化葡萄糖
生成葡萄糖酸,使pH敏感聚合物收缩,传感器表面质量负载减小,共振频率增
加。传感器对溶液中葡萄糖的响应曲线如图1(4所示。同样,以pH敏感聚
合物
为响应层构建的葡萄糖传感器也受溶液中盐离子浓度的影响,在生理盐浓度下,
传感器的线性范围为l,lOmM,检测限为O(6mM。
类似葡萄糖传感器的制备,在pH敏感聚合物上固定有机磷水解酶可构成用
于有机磷农药检测的酶传感器【32】,对两种有机磷农药:磷酸二乙基对硝基苯基
基于质量响应原理,利用对葡萄糖敏感的聚合物作为响应层,可构建另一种磁弹
性葡萄糖传感器133,341。此外,也可利用亲和素吸附构建可检测抗生物素蛋白
AVidin 的磁弹性传感器【351,传感器质量响应经放大后对抗生物素蛋白的检测
下限约为200mL,。基于粘度效应 凝胶化反应 构建内毒素磁弹性传感器【36】,
ng
EU
传感器对内毒素的响应灵敏度为O(06EUmL,,检测限为0(0105mL,。
此外,基于磁弹性传感器共振频移与表面质量负载的关系,磁弹性传感器还
可用于电化学沉积过程【371、化学反应中沉淀生成的监测【38J及化学物质之间相互
作用动力学的研究p91。
1(1(3无线磁弹性生物传感器
生物传感器 Biosensor 是利用生物特异性识别过程来实现检测的传感器件。
生物敏感元件包括生物体、组织、细胞、细胞器、细胞膜、酶、抗体、核酸等,
而生物传感器是利用这些从微观到宏观多个层次相关物质的特异性识别能力的
器件的总称。无线磁弹性生物传感器是近几年发展起来的一种无线检测技术,主
要是在传感器表面进行化学或生物修饰,修饰后的传感器在化学和生物反应过程
中传感器表面负载质量减小或增加,引起传感器共振频率发生相应变化,通过记
录传感器共振频率的变化来对反应过程进行监测或对目标物进行定量分析。
磁弹性传感器还可用作酶的浓度及活性分析【40-44】。磁弹性传感器酶法分析
中,通过将底物或酶固定在传感器表面,在特异酶的生物催化作用下,底物在传
感器表面溶解或在传感器表面生成沉淀,表面质量发生改变,传感器共振频率发
生变化。如0【(淀粉酶传感器【421,磁弹性传感器表面固定一层淀粉凝胶,当0【(淀粉
酶水解淀粉时,随着传感器表面淀粉消耗,传感器共振频率增加,传感器共振频
移的变化速率和幅度正比于仅(淀粉酶浓度。此外,基于有毒物质对酶活性的抑制,
可间接测定毒物的浓度。
基于抗体与抗原之间的专业一性结合,将抗体或抗原固定在传感器表面,构
建成磁弹性免疫传感器【4扣54】。但由于抗体(抗原结合时的质量效应较小,为了提
博Ij学位论文
高响应的灵敏度,一般需利用酶催化以放大质量效应【45-491。故磁弹性免疫传感
分析一般采用间接法测定目标抗原或抗体,即通过将标记物修饰到抗体或抗原
上,通过测定标记物实现对抗原或抗体浓度的测定。如对大肠杆菌的测定中【451,
在磁弹性传感器表面形成抗大肠杆菌抗体(大肠杆菌(碱性磷酸酯酶标记的抗大
肠杆菌抗体的三明治结构,碱性磷酸酯酶 ACP 使5(溴(4(氯(3(吲哚磷酸盐
BCIP 形成二聚体蓝色不溶物沉积在传感器表面,导致传感器共振频率发生
变化。BCIP及其二聚体的化学结构如图1(5所示。
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Bf
AP
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H H
图1(55(溴(4(氯(3(吲哚磷酸盐及其二聚体的化学结构图
磁弹性大肠杆菌0157:H7免疫传感器的制备过程如图1(6 A 所示。以表面
mM
2826MB非晶薄膜合金作为基材,首先将传感器浸在lO
镀金的Fe40Ni40P1486
的2(氨基乙基硫醇中,在传感器表面引入氨基。再将其浸入5,戊二醛lh,然
l
后在传感器表面滴加20 L-1的抗大肠杆菌0157:H7抗体,反应1h。传
pLmg
感器表面固定了抗大肠杆菌0157:H7抗体后,将200肛L含热灭活的大肠奸菌
0157:H7 浓度为102,10 7(2 分两次滴加在传感
7茵落mL_1 PBS溶液 pH
器表面,37oC培养lh。待大肠杆菌0157:H7抗体(抗原结合完全后,在传感器
h。这
样
表面滴加20“L碱性磷酸酯酶标记的抗大肠杆菌0157:H7抗体,反应1
就得到了磁弹性大肠杆菌0157:H7免疫传感器,其三明治结构的酶联免疫吸附
检测原理如图1(6 B 所示。通过将碱性磷酸酯酶连接到抗体上,放大了抗体(抗
原免疫反应的质量效应,提高了传感器检测的灵敏度。
磁弹性大肠杆菌0157:H7免疫传感器的实时响应曲线如图1(7所示。传感器
限为10z细菌mL,。
1(2细胞传感
细胞是组成有机体的形态和功能的基本单位,对细胞结构和活动的研究是生
命科学探索的重要基础。细胞传感以活细胞作为探测单元或传感元件,通过检测
活细胞的基本功能信息、细胞对化合物的响应等,实时、定量地确定细胞的生活
状态和被分析物的性质。活细胞传感对于研究细胞的结构和功能、生命活动的规
律和本质、疾病的诊断、抗癌抗衰老等药物的设计、环境监测等都具有十分重要
的意义。
细胞传感器及纳米材料生物相容性研究
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0157:H7免疫传感器及其检测原理
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图1(7磁弹性凰c^e,(f拍招cD,f0157:H7免疫传感器的实时
响应曲线
1(2(1传统细胞检测技术
常用于研究细胞活力和繁殖情况的生物学实验技术主要包括显微技术、分光
光度技术和流式细胞术等【551。用显微镜可对细胞生长过程中的形态进行观察,
用染料对细胞染色可观察细胞的健康情况,据此可判断细胞的繁殖情况,并定性
评估药物对细胞的作用。分光光度技术主要是指四甲基偶氮唑盐 MTT 比色
法【561,该法可定量检测细胞的活性,研究抗癌药物对肿瘤细胞的作用。此法简
便、快速,没有放射性污染,所需细胞数较少,便于大规模进行药物敏感实验,
加之人为误差较小而较精确,目前已广泛用于临床抗癌药物筛选研究,并已开始
用于新鲜肿瘤细胞的药物敏感性检测。流式细胞术是可对细胞或亚细胞结构进行
快速测量的新型分析技术和分选技术,其特点是测量速度快,可进行多参数测量。
随着对流式细胞术研究的日益深入,其价值已经从科学研究走入临床应用阶段,
在临床医学领域里有着广泛的应用。然而,这几种技术具有一个共同的不足之处,
就是均不能对细胞的生长过程及药物对细胞的作用进行实时监测,且流式细胞术
对仪器要求较高。因此,仍然非常有必要开发其它一些新的细胞传感技术用于研
究细胞的生理行为及癌细胞与药物或毒素的相互作用。
1(2(2压电细胞传感技术
压电生物传感技术采用由压电材料构成的声波器件实现信号传导,通过声波
的产生与传播及其与周围环境的相互作用,可测量质量、粘弹性和介电性等物理
量以及与之相关联的生物量。压电传感器由于其响应范围广、灵敏度高、结构简
单、价格便宜、易数字化等众多优点,已经在分析科学、生命科学、材料科学等
领域得到了深入的探讨和广泛的应用。压电传感响应的质量效应使石英谐振器作
细胞传感器及纳米材料生物相容件研究
为质量传感器即石英晶体微天平而得到了广泛的应用。近年来,除了质量效应外,
压电传感器还在更多的非质量效应方面有了发展,使其更为广泛地应用于生
物分
子粘弹性、细胞粘附、血液流变等生物医学研究领域【5刀。压电分析技术由于操
作简便、仪器廉价、可实现连续监测等优点,在哺乳动物细胞研究中也得到了较
好的应用。
细胞的体外培养可分为贴壁培养和悬浮培养。贴壁培养就是在细胞贴在培养
器皿壁上的生长。以压电石英晶体 Piezoelectricquartzcrystal,PQC 做细胞生
长基底。细胞在PQC表面的活动会引起PQC信号的改变,由此可实时监测细胞
的贴壁生长过程。由于细胞的典型直径约为10?m,比压电晶体表面声波的作用
距离大得多,所以只有一小部分的细胞体积参与晶体的振荡。另外,细胞的表面
不是均匀刚性膜,并且细胞含大量的细胞液,因此在细胞与晶体的作用中,粘弹
性的作用一般大于质量作用,PQC信号主要来自细胞贴壁所导致的表面粘、密
度变化,这种情况下,Sauerbrey方程不适用于描述石英晶体表面细胞的质量与
晶体谐振频率改变值之间的关系。在压电传感检测的方式上,除采用频率检测外,
还可以采用阻抗分析法测量与能量损耗有关的参数。
1993年,Ward小组【58】用石英晶体谐振技术实时监测了非洲绿猴肾细胞
Vero 在金表面的粘附和脱附行为,开拓了石英晶体谐振技术在哺乳动物细胞
贴壁研究中的应用,并且认为粘附在金表面的细胞不能看作是刚性质量,而应看
作是粘性膜。同年,Redepe皿ing等【59】采用石英晶体谐振技术监测了成骨细胞的
粘附,发现石英晶体谐振频率的改变值与石英晶体表面的细胞覆盖率之间呈线性
关系,谐振频率的降低主要与细胞的粘弹性有关。Calla等【60】采用该技术监测了
细胞的粘附,对不同哺乳动物细胞系进行了比较分析。MarX等【61,62】用石英晶体
微天平连续监测了内皮细胞的粘附、铺展和增殖过程,并用石英晶体微天平细胞
传感器研究了诺考达唑药物存在下活细胞中微管的变化16引,还研究了细胞一细胞
之间的协同效应对细胞粘附的作用164J。GalliMarXer在研究过程中发现了石英晶
体谐振频率上升的现象,并对造成这种现象的原因进行了解释【65l。Facci等166J
监测了与细胞周期有关的粘弹性,为研究影响细胞周期的药物提供了一种灵敏的
Sensor
Cell-based
方法。韦等167】构建了新型的压电细胞传感芯片 Piezoelectric
Chip,PCSC 技术平台,在理论和实验方面阐明肝癌细胞的压电传感响应特性,
利用该技术平台考察了阳性药物检测、药物筛选以及纳米粒子在细胞检测中的效
用等内容。
微生物的检测也是PQC液相生物传感中重要的方向之一,检测信号大多数
法并检测了白色念珠菌,随后研究者们将测定对象扩展到更多的细菌以及病毒。
博:l:学位论文
7
cell
利用培养液化学性质的改变对浓度范围为lO,10
mL-1的大肠杆菌进行了
检测,同时测定了细菌的生长速度。Bao等1(72】基于培养液的凝固提出了一种测定
3】利用检测培
细菌的新方法,测定了大肠杆菌和溶壁微球菌的生长过程。Yao等【7
养液中氨浓度测定了普通变形杆菌的生长过程,并建立了动力学模型,wu等【74】
用类似方法监测了枯草杆菌的生长过程。
1(2(3电化学细胞传感技术
细胞电化学是生物电化学的一个重要领域,它是基于电化学的基本原理和实
验方法与细胞、分子生物学技术的相互结合,从整体上对细胞进行分析和表征,
揭示细胞结构(功能关系和外源分子对细胞功能的影响。细胞的新陈代谢、呼吸
作用、光合作用、信息传递、物质的跨膜运输等都涉及到细胞荷电粒子或电
活性
粒子定向有序的传递、传导或转移,涉及到细胞物质有序、专一、特异的氧化还
原,且细胞的这些生化反应同电极上发生的电化学反应极其相似,可以认为细胞
的基本生命活动是以电化学反应为基础的。因此,电化学细胞传感器对研究细胞
的结构和功能、生命活动的规律和本质、疾病的诊断、抗癌抗衰老等药物的设计、
环境监测等都具有十分重要的意义【(75,76】。
大多数情况下,细胞不分泌氧化还原活性媒介体或电子传递蛋白,只有当细
菌细胞与电极直接接触时才能促进电子传递,由此产生了电极电荷和电位的变
化,并产生电流。将细胞内部的电子传递与外电路连起来,可以通过伏安法或其
它稳态电流测量方法研究细胞直接电化学,并确定细胞数量和活性【77,781,Hobson
等17州报道了使用不同电位技术及电极材料的用于检测细胞数量的安培法。
cP陀v鼢f口P 细胞固定在石墨电极上,研究了活细胞的伏
将酵母 勋cc』ll口,D删cPJ
安行为,处于同一生长期的细胞的峰电流与细胞浓度成线性关系。Matsunaga等
【821和Han等【83】用修饰电极研究了细胞的直接电化学。通过浓缩细胞悬浮液‘841
或测定前先将细胞吸附于电极表面,可观察到通过物理作用吸附于电极表面的细
分枝杆菌细胞转化为睡眠非生长状态的动态过程。Du等【86】利用金胶纳米粒子与
细胞的相互作用将AsPC(1胰腺癌细胞固定于金胶修饰碳糊电极表面,从而展开
AsPC(1胰腺癌细胞的电化学行为研究。
纳米材料的引入丰富了细胞电化学研究,利用纳米粒子构建电化学生物传感
器具有非常广阔的前景。国内的鞠煜先小组在此方面开展了大量工作【87。381。他
们基于金纳米粒子与细胞之间的相互作用将癌细胞固定在金纳米粒子修饰碳糊
电极表面,进行了不同种类癌细胞的电化学研究,并且评价了抗肿瘤药物的细胞
毒性及其它因素对细胞活性的影响。Jia等【89】通过制备羟基磷灰石碳纳
米管修饰
细胞传感器及纳米材料生物相容性研究
电极对成骨肉瘤细胞进行了电化学分析,并监测了细胞生长以及评估了细胞毒
性。研究结果表明,用碳纳米管对电极表面进行修饰可大幅度提高细胞的伏安响
应信号。本实验室【90】将碳纳米管修饰石墨电极用于研究人乳腺癌细胞 MCF-7
的电化学行为,并考察了抗癌药物5(氟尿嘧啶的细胞毒性作用。研究结果表明,
用碳纳米管对电极表面进行修饰可大幅度提高细胞的伏安响应信号和电位溶出
分析信号。
电化学阻抗方法是一种暂态电化学技术,用小幅度交流信号扰动电解