实时荧光定量PCR标准反应体系介绍

实时荧光定量PCR标准反应体系介绍 标准的PCR反应体系: 10×扩增缓冲液 10ul 4种dNTP混合物 各200umol/L 引物 各10,100pmol 模板DNA 0.1,2ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至 100ul PCR反应五要素: 参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ 引物: 引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。 设计引物应遵循以下原则: ?引物长度: 15-30bp，常用为20bp左右。 ?引物扩增跨度: 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。 ?引物碱基:G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶 核苷酸的成串排列。 ?避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。 ?引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。 ?引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处。 ?引物的特异性:引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量: 每条引物的浓度0.1,1umol或10,100pmol，以最低引物 量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。 酶及其浓度 目前有两种Taq DNA聚合酶供应， 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2。5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。 dNTP的质量与浓度 dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0,7.5，小量分装， -20?冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50,200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。 模板(靶基因)核酸 模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是: 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀; 蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法， 要防止RNase降解RNA。 Mg2+浓度 Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5,2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。 PCR反应条件的选择 PCR反应条件为温度、时间和循环次数。 温度与时间的设置: 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90,95?变性，再迅速冷却至40 ,60?，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70,75?，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100,300bp时)可采用二温度点法， 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94?变性，65?左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。 ?变性温度与时间:变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93?,94?lmin足以使模板DNA变性，若低于93?则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。 ?退火(复性)温度与时间:退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40?,60?，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55?为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度: Tm值(解链温度)=4(G+C)，2(A+T) 复性温度=Tm值-(5,10?) 在Tm值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合， 提高PCR反 应的特异性。复性时间一般为30,60sec，足以使引物与模板之间完全结合。 ?延伸温度与时间:Taq DNA聚合酶的生物学活性: 70,80? 150核苷酸/S/酶分子 70? 60核苷酸/S/酶分子 55? 24核苷酸/S/酶分子 高于90?时， DNA合成几乎不能进行。 PCR反应的延伸温度一般选择在70,75?之间，常用温度为72?，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够 的。3,4kb的靶序列需3,4min;扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。 循环次数 循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30,40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。 PCR技术概论 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点;能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断;可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情，用PCR几小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。 PCR技术简史 PCR的最早设想 核酸研究已有100多年的历史，本世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想:“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。 PCR的实现 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供以致一种合适的条件---摸板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间。 PCR的改进与完善 Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段，其缺点是: ?Klenow酶不耐高温，90?会变性失活，每次循环都要重新加。?引物链延伸反应在37?下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。此种以Klenow酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。这使得PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶。此酶具有以下特点:?耐高温，在70?下反应2h后其残留活性大于原来的90%，在93?下反应2h后其残留活性是原来的60%，在95?下反应2h后其残留活性是原来的40%。?在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。?大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶I Klenow片段区别，将此酶命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的发现使PCR广泛的被应用。 PCR技术基本原理 PCR技术的基本原理 类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成:?模板DNA的变性:模板DNA经加热至93?左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备;?模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55?左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;?引物的延伸:DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2,4分钟，2,3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。 PCR的反应动力学 PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y,(1，X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。 PCR扩增产物 可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5’端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3’端开始延伸，其5’端是固定的，3’端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。引物在与新链结合时，由于新链模板的5’端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3’端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计，这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。 PCR反应体系与反应条件 标准的PCR反应体系: 10×扩增缓冲液 10ul 4种dNTP混合物 各200umol/L 引物 各10,100pmol 模板DNA 0.1,2ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至 100ul PCR反应五要素: 参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ 引物: 引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。 设计引物应遵循以下原则: ?引物长度: 15-30bp，常用为20bp左右。 ?引物扩增跨度: 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。 ?引物碱基:G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 ?避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。 ?引物3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。 ?引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。 ?引物的特异性:引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。 引物量: 每条引物的浓度0.1,1umol或10,100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。 酶及其浓度 目前有两种Taq DNA聚合酶供应， 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。 dNTP的质量与浓度 dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0,7.5，小量分装， -20?冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50,200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。 模板(靶基因)核酸 模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是:溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀;蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。 Mg2+浓度 Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5,2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。 PCR反应条件的选择 PCR反应条件为温度、时间和循环次数。 温度与时间的设置: 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三 温度点法，双链DNA在90,95?变性，再迅速冷却至40 ,60?，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70,75?，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100,300bp时)可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94?变性，65?左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。 ?变性温度与时间:变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93?,94?lmin足以使模板DNA变性，若低于93?则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。 ?退火(复性)温度与时间:退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40?,60?，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55?为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度: Tm值(解链温度)=4(G+C)，2(A+T) 复性温度=Tm值-(5,10?) 在Tm值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30,60sec，足以使引物与模板之间完全结合。 ?延伸温度与时间:Taq DNA聚合酶的生物学活性: 70,80? 150核苷酸/S/酶分子 70? 60核苷酸/S/酶分子 55? 24核苷酸/S/酶分子 高于90?时， DNA合成几乎不能进行。 PCR反应的延伸温度一般选择在70,75?之间，常用温度为72?，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。3,4kb的靶序列需3,4min;扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。 循环次数 循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30,40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。 PCR反应特点 特异性强 PCR反应的特异性决定因素为: ?引物与模板DNA特异正确的结合; ?碱基配对原则; ?Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性; ?靶基因的特异性与保守性。 其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。 灵敏度高 PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12g)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=10-6g)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞;在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位);在细菌学中最小检出率为3个细菌。 简便、快速 PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2,4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。 对标本的纯度要求低 不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板。可 直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。 PCR扩增产物分析 PCR产物是否为特异性扩增 ，其结果是否准确可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定，才能得出正确的结论。PCR产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。 凝胶电泳分析:PCR产物电泳，EB溴乙锭染色紫外仪下观察，初步判断产物的特异性。PCR产物片段的大小应与预计的一致，特别是多重PCR，应用多对引物，其产物片断都应符合预讦的大小，这是起码条件。 琼脂糖凝胶电泳: 通常应用1,2%的琼脂糖凝胶，供检测用。 聚丙烯酰胺凝胶电泳:6,10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好，条带比较集中，可用于科研及检测分析。 酶切分析:根据PCR产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶切、电泳分离后，获得符合理论的片段，此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究。 分子杂交:分子杂交是检测PCR产物特异性的有力证据，也是检测PCR 产物碱基突变的有效方法。 Southern印迹杂交: 在两引物之间另合成一条寡核苷酸链(内部寡核苷酸)标记后做探针，与PCR产物杂交。此法既可作特异性鉴定，又可以提高检测PCR产物的灵敏度，还可知其分子量及条带形状，主要用于科研。 斑点杂交: 将PCR产物点在硝酸纤维素膜或尼膜薄膜上，再用内部寡核苷酸探针杂交，观察有无着色斑点，主要用于PCR产物特异性鉴定及变异分析。 核酸序列分析:是检测PCR产物特异性的最可靠方法。 PCR常见问题 PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。 假阴性，不出现扩增条带 PCR反应的关键环节有?模板核酸的制备，?引物的质量与特异性，?酶的质量及活性 ?PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 模板:?模板中含有杂蛋白质，?模板中含有Taq酶抑制剂，?模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，?在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。?模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。 酶失活:需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。 引物:引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为:?选定一个好的引物合成单位。?引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。?引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。?引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。 Mg2+浓度:Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。 反应体积的改变:通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。 物理原因:变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率，退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩 增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。 靶序列变异:如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。 假阳性 出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。 引物设计不合适:选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。 靶序列或扩增产物的交叉污染:这种污染有两种原因:一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决:?操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。?除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。?必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。 出现非特异性扩增带 PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因:一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有:?必要时重新设计引物。?减低酶量或调换另一来源的酶。?降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。?适当提高退火温度或采用二温度点法(93?变性，65?左右退火与延伸)。 出现片状拖带或涂抹带 PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有:?减少酶量，或调换另一来源的酶。?减少dNTP的浓度。?适当降低Mg2+浓度。?增加模板量，减少循环次数。 PCR污染与对策 PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但令人头痛的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生。 污染原因 (一)标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染，或标本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;标本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染。 (二)PCR试剂的污染:主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染. (三)PCR扩增产物污染:这是PCR反应中最主要最常见的污染问题，因为PCR产物拷贝量 大(一般为1013拷贝/ml)，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可造成假阳就可形成假阳性。 还有一种容易忽视，最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染;在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染.据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题. (四)实验室中克隆质粒的污染:在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室，这个问题也比较常见。因为克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力，其污染可能性也很大。 污染的监测 一个好的实验室，要时刻注意污染的监测，考虑有无污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。 对照试验 1.阳性对照:在建立PCR反应实验室及一般的检验单位都应设有PCR阳性对照，它是PCR反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志。阳性对照要选择扩增度中等、重复性好，经各种鉴定是该产物的标本，如以重组质粒为阳性对照，其含量宜低不宜高(100个拷贝以下)，但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本，其对检测或扩增样品污染的可能性很大。因而当某一PCR试剂经自己使用稳定，检验人员心中有数时，在以后的实验中可免设阳性对照。 2.阴性对照:每次PCR实验务必做阴性对照。它包括?标本对照:被检的标本是血清就用鉴定后的正常血清作对照;被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照。?试剂对照:在PCR试剂中不加模板DNA或RNA，进行PCR扩增，以监测试剂是否污染。 3.重复性试验 4.选择不同区域的引物进行PCR扩增 防止污染的方法 (一)合理分隔实验室:将样品的处理、配制PCR反应液、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行，特别注意样本处理及PCR产物的鉴定应与其它步骤严格分开。最好能划分?标本处理区;?PCR反应液制备区;?PCR循环扩增区;?PCR产物鉴定区。其实验用品及吸样枪应专用，实验前应将实验室用紫外线消毒以破坏残留的DNA或RNA。 (二)吸样枪:吸样枪污染是一个值得注意的问题。由于操作时不慎将样品或模板核酸吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样或吸取模板核酸时要十分小心，吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染。 (三)预混和分装PCR试剂:所有的PCR试剂都应小量分装，如有可能，PCR反应液应预先配制好，然后小量分装，-20?保存。以减少重复加样次数，避免污染机会。另外，PCR试剂，PCR反应液应与样品及PCR产物分开保存，不应放于同一冰盒或同一冰箱。 (四)防止操作人员污染，使用一次性手套、吸头、小离心管应一次性使用。 (五)设立适当的阳性对照和阴性对照，阳性对照以能出现扩增条带的最低量的标准病原体核酸为宜，并注意交叉污染的可能性，每次反应都应有一管不加模板的试剂对照及相应不含有被扩增核酸的样品作阴性对照。 (六)减少PCR循环次数，只要PCR产物达到检测水平就适可而止。 (七)选择质量好的Eppendorf管，以避免样本外溢及外来核酸的进入，打开离心管前应先离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部。开管动作要轻，以防管内液体溅出。 PCR常见问题总汇(一) PCR产物的电泳检测时间 一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消 失。 不出现扩增条带 PCR反应的关键环节有?模板核酸的制备，?引物的质量与特异性，?酶的质量及， ?PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 模板:?模板中含有杂蛋白质，?模板中含有Taq酶抑制剂，?模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，?在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。?模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。 酶失活:需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。 引物:引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度 高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为:?选定一个好的引物合成单 位。?引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有 引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条 带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条 亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。?引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融 或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。?引物设计不合理，如引物长度不 够，引物之间形成二聚体等。 Mg2+浓度:Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特 异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。 反应体积的改变:通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多 大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。 物理原因:变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出 现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退 火温度过高影 响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下 扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。 靶序列变异:如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某 段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。 出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。 引物设计不合适:选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增 时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳 性。需重新设计引物。 靶序列或扩增产物的交叉污染:这种污染有两种原因:一是整个基因组或大片段的交 叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决:?操作时应小心轻柔，防止 将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。?除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或 器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。?必要时，在加标本 前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污 染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩 增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。 PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因:一是引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数 过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有:?必要时重新设计引 物。?减低酶量或调换另一来源的酶。?降低引物量，适当增加模板量，减少循环次 数。?适当提高退火温度或采用二温度点法(93?变性，65?左右退火与延伸)。 PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或 酶的质量 差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有:?减少酶量，或调换另一来源的酶。?减少dNTP的浓度。?适当降低Mg2+浓 度。?增加模板量，减少循环次数。 PCR常见问题总汇(二) PCR产物 1)克隆PCR产物的最优条件是什么, 1:1(插入片段:载体)常为最佳比，摩尔数比1:8或8:1也行。应测定比值范围。连接用5ul 2X连接液, 50ng质粒DNA,1Weiss单位的T4连接酶，插入片段共10ul。室温保温1小时，或4oC过夜。在这2种温度下，缺T-凸出端的载体会自连，产生蓝斑。室温保温1小时能满足大多数克隆要求，为提高连接效率，需4oC过夜。 2)PCR产物是否需要用凝胶纯化, 能是积累了大量引物的二聚体。少量的引物二聚体的摩尔数也很高，这会产生高比例的带有引物二聚体的克隆，而非目的插入片段。为此需在克隆前做凝胶纯化。 3)如果没有回收到目的片段，还需要作什么对照实验, A)涂布未转化的感受态细胞。 的菌落。 B)转化完整质粒，计算菌落生长数，测定转化效率。 将1ug/ul质粒1:100稀释,1ul用于100ul感受态细胞转化。用SOC稀释到1000ul后，用100ul铺板。培养过夜，产生1000个菌落。转化率为: 产生菌落的总数/铺板DNA的总量。 DNA的总量是转化反应所用的量除以稀释倍数。具体而言转化用10ng DNA，用SOC稀释到1000u后含10 ng DNA，用1/10铺板，共用1 ng DNA。转化率为: 1000克隆X10(3次方) ng /铺板1 ng DNA ug=10(6次方)cfu/ ug pGEM-T应用10(8次方)cfu/ ug感受态细胞 C)如用pGEM-T正对照，或PCR产物，产生>20-40蓝斑(用指定步骤10(8次方)cfu/ ug感受态细胞)，表明载体失去T。可能是连接酶污染了核酸酶。T4 DNA连接酶(M1801，M1804，M1794)质量标准好无核酸酶污染，不应用其它来源的T4 DNA连接酶替换。 D)用pGEM-T或pGEM-T Easy载体，连接pGEM-T正对照，转化高频率感受态细胞(10(8次方)cfu/ug),按照指定的实验步骤，可得100个菌落，其中60%应为白斑，如产生>20-40蓝斑, 没有菌落或少有菌落，连接有问题。 4)对照实验结果好，却没有回收到目的片段，实验出了什么问题, A)连接用室温保温1小时，能满足大多数克隆，为提高效率，需4oC过夜。 B)插入片段带有污染，使3`-T缺失，或抑制连接，抑制转化。为此，将插入片段和pGEM-T正对照混合，再连接。如降低了对照的菌落数，插入片段需纯化，或重新制备。如产生大量的蓝斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-T Easy载体3`-T缺失。 C)插入片段不适于连接。用凝胶纯化的插入片段，因受UV过度照射，时有发生。UV过度照射会产生嘧啶二聚体，不利于连接，DNA必需重新纯化。 D)带有修复功能的耐热DNA聚合酶的扩增产物末端无A，后者是pGEM-T或pGEM-T Easy载体克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。详情查pGEM-T pGEM-T Easy载体技术资料(TM042)。 E)高度重复序列可能会不稳定，在扩增中产生缺失和重排，如发现插入片段高频率地产生缺失和重排，需用重组缺陷大肠杆菌菌株，如SURE细胞 PCR常见问题总汇(三) PCR反应体系与反应条件 PCR反应体系: 10×扩增缓冲液 10ul 4种dNTP混合物 各200umol/L 引物 各10,100pmol 模板DNA 0.1,2ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至 100ul PCR反应五要素: 参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ 引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。 15-30bp，常用为20bp左右。 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。 G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。 3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处。 量: 每条引物的浓度0.1,1umol或10,100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。 酶及其浓度 目前有两种Taq DNA聚合酶供应， 一种是从栖热水生杆菌中 提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2。5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。 dNTP的质量与浓度 dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0,7.5，小量分装， -20?冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50,200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。 模板(靶基因)核酸 模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是: 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀; 蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。 Mg2+浓度 Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5,2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。 PCR反应条件的选择 PCR反应条件为温度、时间和循环次数。 温度与时间的设置: 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90,95?变性，再迅速冷却至40 ,60?，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70,75?，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100,300bp 时)可采用二温度点法， 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94?变性，65?左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。 ?变性温度与时间:变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93?,94?lmin足以使模板DNA变性，若低于93?则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。 ?退火(复性)温度与时间:退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40?,60?，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55?为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度: Tm值(解链温度)=4(G+C)，2(A+T) 复性温度=Tm值-(5,10?) 在Tm值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合， 提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30,60sec，足以使引物与模板之间完全结合。 ?延伸温度与时间:Taq DNA聚合酶的生物学活性: 70,80? 150核苷酸/S/酶分子 70? 60核苷酸/S/酶分子 55? 24核苷酸/S/酶分子 高于90?时， DNA合成几乎不能进行。 PCR反应的延伸温度一般选择在70,75?之间，常用温度为72?，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够 的。3,4kb的靶序列需3,4min;扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。 PCR应用中存在的问题 开展 PCR 应具有一定的条件。需要一个正规的 pCR 实验室，采集标本、核酸提取、扩增及产物分析应在不同的房间进行;需有严密的防污染措施、假阳性和假阴性结果的质控等。实验者应具有一定的分子生物学理论知识及实验技能，能够及时发现和纠正实验中的问题。目前，我国在 PCR 应用中尤其是在临床诊断中存在问题较多，主要表现为: PCR 试剂的考核、审查工作薄弱，许多单位实验条件不符合要求，部分操作人员的理论和实验知识水平较低。 PCR 的应用范围过宽等，因此造成 PCR 实验结果的可靠性差，出现较多的假阳性、假阴性结果。 阴性对照中出现一个或几个阳性结果，提示本次实验中其它标本的检测结果可能有假阳性。造成假阳性的原因包括样品污染、扩增试剂污染、扩增产物交叉污染等。常见的污染来源包括实验室环境、加样器、操作中形成的喷雾、 DNA 抽提仪器、试剂及任何与扩增产物接触的东西。预防措施:(1)工作区隔离。(2)改进实验操作，如在加样过程中避免试剂飞溅、吸头离心管使用前高压处理、试剂分装成小份一次使用后弃去等。(3)操作程序合理化，如后加阳性对照等。 交叉污染指扩增产物对将要扩增的样品或反应管的污染。由于 PCR 的敏感性和效率特别高，所以少量的扩增产物污染标本或反应管即可出现假阳性。交叉污染的处理方法包括 [1] : 1 (在 DNA 模板和多聚酶加入前，紫外线照射反应管内容物以破坏污染的 PCR 产物。一般选用波长 254nm 照射 30min ( Nature ， 1990 ， 34:27 ) 2 ( PCR 实验中使用 dUTP ，而不用 dTTP 。在扩增前使用 UraciI N 一 g1ycosylase (尿嘧啶糖基化酶)处理可降解交叉污染的 PCR 产物，而不降解基困组 DNA 模板，然后热灭活此酶，再进行扩增反应( Gene ， 1990 ， 93 : 125 )。美国 PE 公司提供此类试剂盒( PCR carry-over preventionkit 。 3 (在 PCR 反应前加入一种光化学试剂，反应完成后激活该试剂，光化学试剂可交联 DNA 链，使之不能再扩增( Nucleic Acids Res ， 1991 ， 19 : 99 )。 阴性结果。但这里应注意，许多国产 PCR 试剂盒中阳性对照采用质粒 DNA ，和标本相比来说，不需纯化提取核酸的步骤，因此，如果在标本核酸纯化提取步骤有问题，即使阳性对照均呈阳性，标本检测中还可能有假阴性。 : (1) DNA 抽提过程不当。 (2) DNA 样品中含有 Taq 聚合酶抑制剂，如尿素、 DMSO 、 SDS 等物质，可抑制 Taq 酶活性， DNA 样品中的蛋白质和重金属离子等亦影响 Taq 酶活性，尤其是含有较多脓液或分泌物的标本，其中虽有待查菌，但却因标本处理不当而出现假阴性 [2] 。 示系统。在每一反应管中加入内对照，若内对照未能扩增出来，说明该反应管的结果可能有问题。 PCR产物的鉴定 PCR 产物通过琼脂糖凝胶电泳可判断其长度是否为预期的长度，但只有通过杂交试验或序列分析等才能判断其特异性。严格说来， PCR 产物均应通过实验证实其特异性。在我国一些科研和临床检测中缺乏这一环节。 PCR 具有其优点，但也有不足之处，它是一种很好的科研手段，但作为常规诊断方法尚需进一步改进和提高 [9] 。目前的关键问题是如何正确应用 PCR 。虽然 PCR 尚未在包括美国等发达国家作为常规诊断方法，但如果具备开展 PCR 需要的条件， PCR 是可作为辅助诊断手段使用的。目前，只有针对 PCR 应用中存在的问题，采取措施，正确应用 PCR ，才能使这一技术在科研和临床工作中发挥应有的作用。 PCR实用技巧 增加PCR的特异性: 1. primers design 火的引物要符合下面的 一些条件 a. 足够长,18-24bp,以保证特异性.当然不是说越长越好,太长的引物同样会降低特异性,并且降低产量 b. GC% 40%~~~~60% c. 5'端和中间序列要多GC,以增加稳定性 d. 避免3'端GC rich, 最后3个BASE不要有GC,或者最后5个有3个不要是GC e. 避免3'端的互补, 否则容易造成DIMER f. 避免3'端的错配 g. 避免内部形成二级结构 h. 附加序列(RT site, Promoter sequence)加到5'端, 在算Tm值时不算,但在检测互补和二级结构是要加上它们 i. 使用兼并引物时, 要参考密码子使用表,注意生物的偏好性,不要在3'端使用兼并引物,并使用 较高的引物浓度(1uM-3uM) j. 最好学会使用一种design software. PP5,Oligo6,DNAstar, Vector NTI, Online desgin et al. * 引物的另一个重要参数是熔解温度(Tm)。这是当50,的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tm对于设定PCR退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火， 同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55?到70?。退火温度一般设定比引物的 Tm低5?。 设定Tm有几种公式。有的是来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于18碱基的引物。 有的是根据GC含量估算Tm。确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。这种方法从序列一级结构和 相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。大部分计算机程序使用近邻分析法。 Tm会差异很大。因为大部分公式提供一个估算的Tm值，所有退火温度只是一个起始点。可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。开始低于估算的Tm5?，以2?为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。 为获得最佳结果，两个引物应具有近似的Tm值。引物对的Tm差异如果超过5?，就会引物在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5? 或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。 2. stability of primers PCR应用是足够的。 最好在TE重溶引物，使其最终浓度为100μM。TE比去离子水好，因为水的pH经常偏酸，会引起寡核苷的水解。 引物的稳定性依赖于储存条件。应将干粉和溶解的引物储存在-20?。以大于10μM浓度溶于TE的引物在 -20?可以稳定保存6个月，但在室温(15?到30?)仅能保存不到1周。干粉引物可以在-20?保存至少1年，在室温(15?到30?)最多可以保存2个月。 3. optimize reactants concentration a. magnesiom ions Mg离子的作用主要是 dNTP-Mg 与核酸骨架相互作用 并能影响Polymerase的活性，一般的情况下 Mg的浓度在0.5-5mM之间调整，同样要记住的是在调整了dNTPs的浓度后要相应的调整Mg离子的浓度，对实时定量PCR，使用3到5mM带有荧光探针的镁离子溶液 b. 其他的离子 NH4+ K+都会影响PCR，增加K+的浓度后, 会因为中和了核酸骨架上磷酸基团的负电荷而退火的温度,从而降低了PCR的 严谨性(stringency)，NH4+也有相同的作用. MBI公司的TAQ酶就提供了两种BUFFER, 一种是加Mg的一种是已经混合了(NH4)2SO4的，当然, 过高的阳离子浓度(KCL>0.2M)时, DNA在94度根本不会发生变性, 当然也就无从谈起PCR了. c. polymerase ,需要operator自己掌握适合的酶的浓度，一些高保真没的效率要远远低于Taq polymerase,所以可能需要的酶的量也要大一些. 另外, 一般的 情况下, 变性的温度可以使用90~92度, 变性的时间也可以缩短,从而保证polymerase的活性 d. template 50ul PCR SYSTEM ================================ human gDNA 0.1ug-1ug E.Coli 10ng-100ng LamadaDNA 0.5ng-5ng Plasmid DNA 0.1ng-10ng ================================ 4. termperature a. denaturation 94度5分钟, GC Rich的摸板是95度5分钟 GC Rich外, 常规的APPLICATIONS可以将这部分时间缩短到1到2分钟, 或者在CYCLE 1时给予较长的时间,而取消开始的denaturation b. annealing , 是从55度开始.根据情况配合以Mg离子浓度进行调整. 有条件的可以做gradient pcr. 退火的时间在30-60S, 时间短一些可以得到更好的效果. 因为, polymerase 在 annealing temp.时也会有一些活性. 所以在A.T.的时间过长, 会极大的增加非特异性扩增的风险，另外,在对于一些困难户, 比如从gDNA里扩增大片段, 还可使用two step PCR. 5. touchdown PCR ,但的确是一个很有用的方法。举个例子，ANNEALING TEMP. 55度 94 5min 94 30s 60 30s 72 1min 2cycles 94 30s 59 30s 72 1min 2cycles 94 30s 58 30s 72 1min 2cycles 94 30s 51 30s 72 1min 2cycles 94 30s 50 30s 72 1min 20cycles 72 5min 6. hot start PCR 热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。尽管Taq DNA聚合酶的最佳延伸温度在72?，聚合酶在室温仍然有活性。因此，在进行PCR反应配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会 产生非特异性的产物。这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。在用于引物设计的位点因为遗传元件的定位而受限时，如site-directed突变、表达克隆或用于DNA工程的遗传元件的构建和操作，热启动PCR尤为有效。 限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反应液，并将其置于预热的PCR仪。这种方法 简单便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特异性产物的扩增。 热启动通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR仪达到变性温度。包括延缓加入Taq DNA聚合 酶，在反应体系达到90度时，PAUSE，将温度保持在70度以上，手工加入polymerase，但这个方法 过于烦琐， 尤其是对高通量应用，并容易造成污染。其他的热启动方法使用蜡防护层将一种基本 成分，入镁离子或酶，包裹起来，或者将反应成分，如模板和缓冲液，物理地隔离开。在热循环时， 因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一起。有很多公司提供这样的酶。 ======================= ampliwax PCR Gems (Perkin Elmer) Taq Bead Hot Start Polymerase (Promega) Magnesium wax beads (Stratagene). ========================= 量应用。 inactive DNA Polymerase. polymerase被抗体抑制失活，当变性温度超过70度时，抗体也变性了，这样polymerase又被激活了。 7. Booster PCR 们知道1ug human genomic DNA 大约在3X10 5幂个模板分子,这样的模板分子数目可以是引物与模板很好的结合. 当模板的浓度过低,比如低于100个分子时, 引物和模板之间就很难发生反应. 引物容易自身进行反应形成二聚体.这样就有来了个 booster PCR 我一直找不到合适的词来翻译这个booster. .开始几个cycles保持primer的低浓度,保证 primer:template的molar ratio在10 7~ 10 8. 以确保开始扩增的准确性.然 后booste Primer的浓度到正常的水平 8. 循环数和长度 确定循环数的基本原理是: 产物能够保证你进一步分析操作的最小循环数.因为过多的循环数容易造 成ERRORS和非特异性产物的积累 产物的量不够, 优化的方法有: 1. 增加TEMPLATE 2. 增加循环数 如何确定循环数,有一个方法. 做一个PCR体系,40循环,50ul, 分别在20,25,30,35循环时从体系中取5ul,一起跑电泳分析.从而确定最佳的循环数 PCR特异性的是PCR cycling时在两个温度间变化的速率(ramping rate).当然是越高 越好.不过咱们大部分条件有限,就那么几台PCR仪,也没有多少挑选的余地 9. thermal cycler PCR仪的因素我们经常容易忽视.长时间的使用后需要调整PCR仪,以保证其能够到达正确的温度.现在的PCR仪基本上都有自检功能(self-diagnosis). 10. PCR additives 附加物或者说enhancer实在是多种多样. 基本上包括几类, 能够增加反应退火效率的化学因子, DNA结合蛋白和一些商业试剂. 基本的原理不外是增加引物退火特异性,减少错配, 增加产物的长度和产量. GC Rich情况中, additive可以造成配对碱基间的的不稳定,从而提高扩增的效率.而在另一种情况下,additive由于造成错配的primer-template复合物的极大的不稳定, 而提高了扩增的忠实性.要注意的是,没有万能的enhancer全部通用,需要你根据自己的情况,最好结合gradient pcr选择最优条件. 聚合酶链式反应(PCR) 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，为最常用的分子生物学技术之一。典型的PCR由(1)高温变性模板;(2)引物与模板退火;(3)引物沿模板延伸三步反应组成一个循环， 通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。其主要步骤是:将待扩增的模板DNA置高温下(通常为93?-94?)使其变性解成单链;人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短;耐热的DNA聚合酶(Taq酶)在72?将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，以目的基因为模板从5’?3’方向延伸，合成DNA的新互补链。 PCR能快速特异扩增任何已知目的基因或DNA片段，并能轻易在皮克(pg)水平起始DNA混合物中的目的基因扩增达到纳克、微克、毫克级的特异性DNA片段。因此，PCR技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。它不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。通常，PCR在分子克隆和DNA分析中有着以下多种用途: (1) 生成双链DNA中的特异序列作为探针; (2) 由少量mRNA生成 cDNA文库; (3) 从cDNA中克隆某些基因; (4) 生成大量DNA以进行序列测定; (5) 突变的分析; (6) 染色体步移; (7) RAPD、AFLP、RFLP等DNA多态性分析等。 1. DNA模版 2(对应目的基因的特异引物 3(10×PCR Buffer 4(2mM dNTPmix:含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM 5(Taq酶 1(在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。 10×PCR buffer 5 μl dNTP mix (2mM) 4 μl 引物1(10pM) 2 μl 引物2(10pM) 2 μl Taq酶 (2U/μl) 1 μl DNA模板(50ng-1μg/μl) 1 μl 加ddH2O至 50 μl 视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。 2( 调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般:在93?预变性3-5min，进入循环扩增阶段:93? 40s ? 58? 30s ? 72? 60s，循环30-35次，最后在72? 保温7min。 3( 结束反应，PCR产物放置于4?待电泳检测或-20?长期保存。 4(PCR的电泳检测:如在反应管中加有石蜡油，需用100μl氯仿进行抽提反应混合液，以除去石蜡油;否则，直接取5-10μl电泳检测。 PCR反应体系的组成与反应条件的优化 PCR反应体系由反应缓冲液(10×PCR Buffer)、脱氧核苷三磷酸底物(dNTPmix)、耐热DNA聚合酶(Taq酶)、寡聚核苷酸引物(Primer1，Primer2)、靶序列(DNA模板)五部分组成。各个组份都能影响PCR结果的好坏。 1( 反应缓冲液:一般随Taq DNA聚合酶供应。标准缓冲液含:50mM KCl，10mM Tris-HCl(pH8.3室温)，1.5mM MgCl2。Mg2+的浓度对反应的特异性及产量有着显著影响。浓度过高，使反应特异性降低;浓度过低，使产物减少。在各种单核苷酸浓度为200μM时，Mg2+为1.5mM较合适。若样品中含EDTA或其它螯合物，可适当增加Mg2+的浓度。在高浓度DNA及dNTP条件下进行反应时，也必须相应调节Mg2+的浓度。据经验，一般以1.5-2mM(终浓度)较好。 2( dNTP :高浓度dNTP易产生错误掺入，过高则可能不扩增;但浓度过低，将降低反应产物的产量。PCR中常用终浓度为50-400μM的dNTP。四种脱氧三磷酸核苷酸的浓度应相同，如果其中任何一种的浓度明显不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会诱发聚合酶的错误掺入作用，降低合成速度，过早终止延伸反应。此外，dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。因此，dNTP的浓度直接影响到反应中起重要作用的Mg2+浓度。 3( Taq DNA聚合酶酶:在100μl反应体系中，一般加入2-4U的酶量，足以达到每min延伸1000-4000个核苷酸的掺入速度。酶量过多将导致产生非特异性产物。但是，不同的公司或不同批次的产品常有很大的差异，由于酶的浓度对PCR反应影响极大，因此应当作预试验或使用厂家推荐的浓度。当降低反应体积时(如20μl或50μl)，一般酶的用量仍不小于2U，否则反应效率将降低。 4( 引物:引物是决定PCR结果的关键，引物设计在PCR反应中极为重要。要保证PCR反应能准确、特异、有效地对模板DNA进行扩增，通常引物设计要遵循以下几条原则: 引物的长度以15-30bp为宜，一般(G+C)的含量在45-55%，Tm值高于55?,Tm=4(G+C)+2(A+T),。应尽量避免数个嘌呤或嘧啶的连续排列，碱基的分布应表现出是随机的。 引物的3’端不应与引物内部有互补，避免引物内部形成二级结构，两个引物在3’端不应出现同源性，以免形成引物二聚体。3’端末位碱基在很大程度上影响着Taq酶的延伸效率。两条引物间配对碱基数少于5个，引物自身配对若形成茎环结构，茎的碱基对数不能超过3个由于影响引物设计的因素比较多，现常常利用计算机辅助设计。 人工合成的寡聚核苷酸引物需经PAGE或离子交换HPLC进行纯化。 引物浓度不宜偏高，浓度过高有两个弊端:一是容易形成引物二聚体(primer-dimer)，二是当扩增微量靶序列并且起始材料又比较粗时，容易产生非特异性产物。一般说来，用低浓度引物不仅经济，而且反应特异性也较好。一般用0.25-0.5pM/μl较好。 引物一般用TE配制成较高浓度的母液(约100μM)，保存于-20?。使用前取出其中一部分用ddH2O配制成10μM或20μM的工作液。 5( 模板:PCR对模板的要求不高，单、双链DNA均可作为PCR的样品。虽然PCR可以用极微量的样品(甚至是来自单一细胞的DNA)作为摸板，但为了保证反应的特异性，一般还宜用μg水平的基因组DNA或104拷贝的待扩增片段作为起始材料。原材料可以是粗制品，某些材料甚至仅需用溶剂一步提取之后即可用于扩增，但混有任何蛋白酶、核酸酶、Taq DNA聚合酶抑制剂以及能结合DNA的蛋白，将可能干扰PCR反应。 6( PCR循环加快，即相对减少变性、复性、延伸的时间，可增加产物的特异性。 PCR反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行。最好设立一个专用的PCR实验室。 得到可靠的结果，纯化的方法越简单越好。 PCR试剂配制应使用最高质量的新鲜双蒸水，采用0.22μm滤膜过滤除菌或高压灭菌。 仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性。 应洗涤干净并高压灭菌。 PCR的样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀。 增加PCR特异性 1、 引物设计 细心地进行引物设计是PCR中最重要的一步。理想的引物对只同目的序列两 侧的单一序列而非其他序列退火。设计糟糕的引物可能会同扩增其他的非目的序列。下面的指导描述了一个可以增加特异性的引物所具有的令人满意的特点: 1.典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。 2.选择GC含量为40,到60,或GC含量映像模板GC含量的引物。 3.设计5'端和中间区为G或C的引物。这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交的稳定性。 4.避免引物对3'末端存在互补序列，这会形成引物二聚体，抑制扩增。 5.避免3'末端富含GC。设计引物时保证在最后5个核苷中含有3个A或T。 6.避免3'末端的错误配对。3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。 7.避免存在可能会产生内部二级结构的序列，这会破坏引物退火稳定性。 物5'端而不影响特异性。当计算引物Tm值时并不包括这些序列，但是应该对其进行互补性和内部二级结构的检测。 列，可以设计兼并引物。兼并引物是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列的混合物。为了增加特异性，可以参考密码子使用表，根据不同生物的碱基使用偏好，减少兼并性。次黄嘌呤可以同所有的碱基配对，降低引物的退火温度。不要在引物的3'端使用兼并碱基，因为3'端最后3个碱基的退火足以在错误位点起始PCR。使用较高的引物浓度(1μM到3μM)，因为许多兼并混合物中的引物不是特异性针对目的模板。 2、引物退火温度 引物的另一个重要参数是熔解温度(Tm)。这是当50,的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度。Tm对于设定PCR退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55?到70?。退火温度一般设定比引物的Tm低5?。 设定Tm有几种公式。表4列出确定引物Tm最常用的两种方法。第一个公式来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于18碱基的引物。第二个公式根据GC含量估算Tm。确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。这种方法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。大部分计算机程序使用近邻分析法。 根据所使用的公式及引物序列的不同，Tm会差异很大。因为大部分公式提供一个估算的Tm值，所有退火温度只是一个起始点。可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。开始低于估算的Tm5?，以2?为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。为获得最佳结果，两个引物应具有近似的Tm值。引物对的Tm差异如果超过5?， 就会引物在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5?。或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。 3、递减PCR 递减PCR通过在PCR的前几个循环使用严紧的退火条件提高特异性。循环开在比估算的Tm高大约5?的退火温度下开始，然后每个循环降低1?到2?，直到退火温度低于Tm 5?。只有同同源性最高的目的模板会被扩增。这些产物在随后的循环中继续扩增，并会将扩增的非特异性产物排挤出去。递减PCR对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法较为有用，如AFLP DNA指纹分析。 4、引物浓度 引物的浓度会影响特异性。最佳的引物浓度一般在0.1到0.5μM。较高的引物浓度会导致非特异性产物扩增。 为了确定引物浓度，可以在260nm(OD260)测量光密度值。然后使用光吸收值和微摩消光系数的倒数(nmol/OD)，通过Beers法则(公式1)计算引物浓度。微摩消光系数可以使用公式2计算。与大分子双链DNA可以使用平均消光系数不同，确定引物的精确浓度必须使用计算的消光系数。这是因为引物较短，碱基组成差异很大。在Gibco/BRL定制引物的质检中包含了消光系数(OD/μmol)和消光系数的倒数(μmol/OD)。另外，不要使用寡聚核苷酸作为标准，在EB染色的胶上估算引物浓度，因为引物和标准的染色能力根据序列不同而差异很大。 5、引物纯度和稳定性 定制引物的标准纯度对于大多数PCR应用是足够的。因脱盐而除去的苯甲酰基和异丁酰基很少，因此不会干扰PCR。部分应用需要纯化，以除去在合成过程中的任何非全长序列。这些截断序列的产生是因为DNA合成化学的效率不 ,。这是个循环过程，在每个碱基加入时使用重复化学反应，使DNA从是100 3'到5'合成。在任何一个循环都可能失败。较长的引物，尤其是大于50个碱基， 截断序列的比例很大，可能需要纯化。 引物产量受合成化学的效率及纯化方法的影响。Life Technologies以一个最小OD单位确保总寡核苷的产量。定制引物以干粉形式运输。最好在TE重溶引物，使其最终浓度为100μM。TE比去离子水好，因为水的pH经常偏酸，会引起寡核苷的水解。 引物的稳定性依赖于储存条件。应将干粉和溶解的引物储存在-20?。以大于10μM浓度溶于TE的引物在-20?可以稳定保存6个月，但在室温(15?到30?)仅能保存不到1周。干粉引物可以在-20?保存至少1年，在室温(15?到30?)最多可以保存2个月。 6、热启动 热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。尽管Taq DNA聚合酶的最佳延伸温度在72?，聚合酶在室温仍然有活性。因此，在进行PCR反应配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物。这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。在用于引物设计的位点因为遗传元件的定位而受限时，如site-directed突变、表达克隆或用于DNA工程的遗传元件的构建和操作，热启动PCR尤为有效。 限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反应液，并将其置于预热的PCR仪。这种方法简单便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特异性产物的扩增。 热启动通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR仪达到变性温度。包括延缓加入Taq DNA聚合酶在内的大部分手工热启动方法十分烦琐，尤其是对高通量应用。其他的热启动方法使用蜡防护层将一种基本成分，入镁离子或酶，包裹起来，或者将反应成分，如模板和缓冲液，物理地隔离开。在热循环时，因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一起。象手动热启动方法一样，蜡防护层法比较烦琐，易于污染，不适用于于高通量应用。 Platinum DNA聚合酶对于自动热启动PCR来说方便高效。Platinum Taq DNA聚合酶的成分为复合有抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体的重组Taq DNA聚合酶。抗体在PCR配制，以至于在室温的延时保温过程中抑制酶的活性。Taq DNA聚合酶在变性步骤的94?保温过程中被释放到反应中，恢复了完全的聚合酶活 性。同经化学修饰用于热启动的Taq DNA聚合酶相比，Platinum酶不需要在94?延时保温(10到15分钟)以激活聚合酶。使用PlatinumTaq DNA聚合酶，在94?进行2分钟就可以恢复90,的Taq DNA聚合酶活性。 7、镁离子浓度 镁离子影响PCR的多个方面，如DNA聚合酶的活性，这会影响产量;再如引物退火，这会影响特异性。dNTP和模板同镁离子结合，降低了酶活性所需要的游离镁离子的量。最佳的镁离子浓度对于不同的引物对和模板都不同，但是包含200μM dNTP的典型PCR起始浓度是1.5mM(注意:对实时定量PCR，使用3到5mM带有荧光探针的镁离子溶液)。较高的游离镁离子浓度可以增加产量，但也会增加非特异性扩增，降低忠实性。为了确定最佳浓度，从1mM到3mM，以0.5mM递增，进行镁离子滴定。为减少对镁离子优化的依赖，可以使用Platinum Taq DNA聚合酶。Platinum Taq DNA聚合酶能够在比Taq DNA聚合酶更广的镁离子浓度范围内保持功能，因此仅需较少的优化. 8、促进PCR的添加剂 退火温度，引物设计和镁离子浓度的优化足以对大多数模板进行高特异性的扩增，但是，某些模板，包括高GC含量的模板，需要其他的措施。影响DNA熔解温度的添加剂提供了提高产物特异性和产量的另外一种方法。为获得最好的结果需要模板的完全变性。另外，二级结构会阻止引物结合和酶的延伸。PCR添加剂，包括甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱以及PCRx Enhancer Solution可以增强扩增。它们可能的机理是降低熔解温度，从而有助于引物退火并辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区。PCRx Solution还有其他优点。在同Platinum Taq DNA聚合酶和Platinum Pfx DNA聚合酶一起使用时，仅需很少的镁离子优化。这样，将Platinum技术同添加剂结合，增强了特异性，同时减少了第三种方法-镁离子优化的依赖。为获得最佳结果，应优化添加剂的浓度，尤其是会抑制Taq DNA聚合酶的DMSO，甲酰胺和甘油。 PCR特异性(五) 9、巢式PCR 使用巢式引物进行连续多轮扩增可以提高特异性和灵敏度。第一轮是15到20个循环的标准扩增。将一小部分起始扩增产物稀释100到1000倍加入到第 二轮扩增中进行15到20个循环。或者，也可以通过凝胶纯化将起始扩增产物进行大小选择。在第二轮扩增中使用一套巢式引物，其可以同第一套引物内侧的靶序列结合。巢式PCR的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同两套引物都互补的靶序列很少。而使用同样的引物对进行总数相同的 三、 扩增产物拖尾 有时扩增产物电泳后出现一个个萤光团(Smear现象)或出现一连串的条带，这些种现象主要与以下几种因素有关: ? 扩增系统不完善: 这种现象表明出现非特异性扩增，而产生非特异性扩增与扩增系统中镁离子浓度、引物浓度、DNTP浓度有密切关系，需认真调整以期避免这种现象出现。另外也可以适当提高退火温度，从而提高扩增特异性。 ? 模板处理方法不完善: PCR扩增技术的原理虽然非常简单，但这一技术的合理应用是极其复杂的，如对PCR主要成分之一DNA聚合酶的影响因素很多，这些因子是怎样作用于聚合酶，其作用机制至今仍不清楚，因此对样本处理不当不妥可能抑制扩增，也可能导致非特异扩增。一般分泌物样本，应取脱落细胞为主，避免采集过多的脓性分泌物，痰液样本一定要充分液化，等等。 ? 引物设计不合理: 引物设计应遵循以下几个原则。首先，引物一般应由15-30个BP组成;其次，引物中碱基应是随机分布，不能有一串相同碱基或出现其它不常见结构;第三，GC碱基含量应在45-55,左右;第四，两个引物在3′未端不能出现同源性。其中以引物与基因组之间的同源性是产生非特异性扩增的最主要原因，而我们一般在设计引物时往往只了解其基因组中的某一段序列，因此我们必须充分利用这些资料巧妙地设计出一组合理的引物，并通过反复比较、证实，最后才能确定其能否用于检测。 四、 产物电泳单萤光带及多萤光带一般PCR扩增后，对扩增结果的判断最简单的方法是，琼脂糖电泳，溴乙淀染色，在320nm的紫外激发观察其萤光条带， 如果有明显和特异性扩增产物，就会在电泳平板预期的位置出现一条清晰的萤光亮带，按标准扩增系统配制的反应液，其引物浓度在0.1-0.5mM，一般经30个循环扩增后，仍有相当数量的游离引物存在，因此在电泳平板就有一条20BP左右(电泳速度较快)的淡淡的引物萤光带，这样每次电泳结果就有两条荥光带，一条在前面的，每个点样样本都有的引物带。 引物设计相当重要，由于基因组有庞大数量的DNA序列，除了特异性的扩增外，往往很容易产生非特异性产物。如果引物与基因组存在较广泛的同源性，那么就会出现严重的非特异性扩弗，引物不仅与特异性的扩增区域结合，而且也与其它区域发生一系列非特异性结合，而选择引物时，常须考虑敏感性问题，特别是临床检验试剂盒，为了能把少至几个病原体检出，我们大都采用在病原体基因组中重复出现的DNA序列设计引物，如果这些重复序列没有严格的同源性，就在可能出现不同长度的扩增产物而出现多条带扩增。 病原体变异，与前面所述一样，我们为得高敏感性经常使用具有重复序列的基因作为引物设计的区段，在有些病原体，比如结核杆菌在治病过程中，会发生严重畸变，也包括其遗传物质的变化，出现染色体的缺失、不等位交换、其它序列的插入等。如果这些缺失与不等位交换正好发生在我们所选择的扩增序列上，也会出现不同长度的扩增产物，从而产生多条扩增产物带。 PCR基因扩增技术简单易行，应用日趋广泛，但其影响因素很多，在实践过程中时常现现这样或那样的问题，甚至得不到预期的结果，或出现无法解释的现象。诚然，近年来在大量科学工作者的共同努力下，取得了许多宝贵的经验，使这一技术日趋完善，毕竟PCR是一项近几年才出现的新技术，许多问题至今仍然不能得到很好地解释或解决。想信随着对PCR的深入研究，在PCR的应用过程中不断总结经验，PCR这一新技术将会为人类的发展作出更大的贡献。 在PCR的优化开始阶段，应用新的DNA模板，引物或热稳定DNA聚合酶等材料建立的PCR方法，其扩增效果一般总不是最佳的。这种PCR反应通常要求尽量抑制非特异性扩增和(或)增加目的DNA产物的产率。表1列举了一些通常遇到的问题和对PCR反应进行优化的一些推荐方法。 1 PCR扩增的疑难解析 解释 补救措施 目的产物条带有时呈不清晰的成片条带，条带在凝胶中扩散到较期望分子量更小的DNA分子量的区域内。 无效引导或无效延伸 通过建立两个引物不同浓度的PCR系列试验，从中发现两个引物的最适浓度;通过建立降落PCR系列试验，摸索最佳镁离子浓度的水平。 GC-Melt(Clonte-CH)PCR反应混合液。 牛白蛋白(0.2~0.6mg/ml)，二甲基亚砜(5%)或甘油(5%) 2与试验管内呈现非常模糊的带型，而在阳性对照管1内却又很强的条带。 模板DNA不纯。 重新纯化模板DNA，用酚:氯仿抽提两次，乙醇沉淀回收。纯化后的DNA样品溶解于水中(不含EDTA)。 照管扩增出目的条带。 盛模板DNA的塑料器具溶解模板DNA的溶液污染所致。 重新配置新的试剂。 根据一条或两条引物的非特异性引导。 缩短复性时间或增加复性温度。 DNA呈现模糊的广泛的成片条带。 要么为引物二聚体所致的扩增;要么为模板DNA过量。 检查引物是否均一及模板DNA序列内是否具有高度重复序列存在。优化每条独立引物的浓度。 PCR和(或)热启动PCR。降低模板DNA的量。 PCR过程中的主要问题的解析 表2描写在PCR扩增反应中可能遇到的一些问题以及提供怎样解决这些问题的一些方法。 2 多种PCR扩增过程的一些疑难问题的诊断与解决方法 可能原因 补救措施 试剂不合格;PCR仪有故障;扩增程序设置错误。 在两台不同的PCR仪上用新鲜购买的试剂与老的 试剂分别进行PCR，比较其扩增产物结果。 重新计算引物Tm;应用降落PCR，最好再结合热启动PCR。 所在，重新设计合成新的引物。 优化MgCl2、模板DNA和dNTP的浓度;试验此PCR的pH值的范围;考虑用N-三甲基甘氨酸、N,N-二羟乙基甘氨酸或EPP等具有更低温度变异系数的化学物质替代Tris(Cheng et al. 1994)。 DNA聚合酶。 DNA以去除抑制物。 55?)条件下增加PCR循环数。 10%二甲基亚砜，5% PEG6000或10%甘油)。 如果问题依然存在，用首次扩增的PCR产物进行1:100稀释后作为模板，再加入新的PCR缓冲液与引物在恒定复性温度条件下进行30个循环的第二次PCR扩增;或者进行嵌套式PCR扩增。 GC-Melt(CLONTECH)PCR反应混合液。 增加变性的时间或者设置更高的变性温度。 应用那些能够扩增大DNA片段的热稳定DNA聚合酶。 应用降落PCR，最好再结合热启动PCR或加强PCR(booster PCR)。 MgCl2、模板DNA、热稳定DNA聚合酶及dNTP的浓度。 PCR产物进行1:100稀释后作为模板，再加入新的PCR缓冲液与引物在恒定复性温度条件下进行30个循环的第二次PCR扩增;或者进行嵌套式PCR扩增;或者从凝胶上切割目的条带作模板重新进行PCR扩增。 计合成引物。 应用降落PCR，最好再结合热启动或加强PCR(booster PCR);若问题仍然存在，重新设计合成引物，要特别注意引物3’末端的序列。 反向PCR方法程序 描述一种大聚合酶链反应(PCR)应用的方法，使在已知序列的核心区边侧的未知 DNA成几何级数扩增。用适当的限制性内切裂解含核心区的DNA，以产生适合于PCR扩 增大小的片段，然后片段的末端再连接形成环状分子。PCR的引物同源于环上核心区 的末端序列，但其方向性，使链的延长经过环上的未知区而不是分开引物的核心区。 这种反向PCR方法可用于扩增本来就在核心区旁边的序列，还可应用于制备未知序列 探针或测定边侧区域本身的上、下游序列。 通常测定一个与已知序列相邻的DNA序列是必要的，例如位于编码DNA的上游和下游两 侧的区域，转位因子的插入位点以及克隆于Lambda、科期粒或酵母人工染色体载体上 的DNA片段末段的未知序列的探针等。这种末端特异探针在Southern Blot或染色体步 查(Chromosome walking)所需的噬菌斑杂交或克隆杂交中都十分有用。 要得到边侧序列的探针一般需要进行一系列费时、费力的工作，首先用内切酶裂解和 用已知边侧序列的探针Southern杂交以确定大小适合于克隆的末端片段;这些片段还 要经过凝胶分离、克隆，得到的物质再与已知边侧区域杂交以确定合适的克隆子。要 测定未吞边侧区序列时，通常需要从克隆中进行各种片段的亚克隆。 为避免这些步骤，我们采用扩展的PCR方法，使相邻边侧区域得以扩增。典型的PCR扩 增使用与互补链杂交的寡聚核苷酸引物。引物是定向的，使延伸向内跨过两个引物之 间的区域。一个引物的DNA合成产物作为另一个引物的模板，进行DNA变性、引物退 火，DNA聚合酶管伸反应的多次重复性循环，可使引物规定区域的拷贝数成指数增 加。但用传统PCR方法得不到紧邻引物外侧的DNA序列，因为寡聚核苷酸所引导的既有 目的DNA又有引物外侧区的DNA合成 在拷贝过程中只呈线性增长，这种线性增长是因 为，对于每种引物来讲，其不能引导DNA反向合成(3’-5’). 几乎是同时，有三个实验室分别设计出一种方法，使PCR可以扩增边侧区域。该方法 (反向PCR)的基本点是用适当内切酶裂解核心区外分子，使这些酶切片段自身连接形 成环状分子，从而将边侧区域转化为内部区域。用与核心区末端同源的引物，但其 3’端趄向未知区域，可以进步用PCR扩增环中的未知区域，该方法如图1所示。 PCR程序 Ochman等[5]，Triglia等[6]和Silver、Keerikatte[7]的文章中详细地描述了反向 PCR的不同应用，下面是Ochman[1]等描述的方法概要。 用传统的缓冲液和其他提供者推荐的条件裂解DNA。反向PCR所扩增的片段的大小由 PCR扩增片段的大小决定，目前，PCR扩增的实际上限为3-4kb。在许多情况下，首先 需要进行Southern杂交来确定内切酶用以产生大小适于环化及反向PCR的片段的末端 片段。能裂解核心区的内切酶使反向PCR只能扩增引物所定模板(依赖于引物)的上游 或上游区，而不裂解核心区的酶则使两上边侧序列都扩增，并带有由内切酶和环化类 型决定的接点(例如，互补突头连接与钝头连接)。对于扩增左翼或右翼序列，初试时 最好靠近识别上个碱基位位的酶，并已知在核心区有其方便的裂解位点。如果用反向 PCR从含有大量不同的克隆片段的同一载体中探测杂交探针，建议事先在载体中引入 合适的酶切位点。 用T4连接酶在稀DNA浓度下环化更容易形成单环[8]。在一些实验中，为产生对反向 PCR大小适当的DNA片段需要两种内切酶，但这样所产生的片段末端则不适于连接，环 化前需用Klenow或噬菌体T4DNA聚合酶修理(钝化)。连接前，需用酚或热变性使内切 酶失活。在我们实验中，不必裂解环状分子核心区也可得到有效的PCR扩增。(这显然 不同于Silver和Keerikatter[7]的实验 结果，他们报道在核心裂解使模板线性化后， PCR扩增率增加100倍，但Triglia[5]等则发现裂解环状分子与加热引起随机缺口效果 相同)。 聚合酶链反应条件与经典所用的相同，例如，94?-30秒变性，58?-30秒引物退火， Taq聚合酶70?延伸3分钟，进行30个循环。可改变PCR条件以生产特异产物。将反向 PCR用于测序时，与核心区末端后部结合的扩增引物更为有用，它使测序引物扩增部 分的核心序列与未知边侧序列间的接点更近，减少了扩增引物的干扰。 PCR的应用 反向PCR的应用已经证明该方法可以避免不方便的克隆和亚克隆步骤，因此可解决大 量问题。我们最初用反向PCR扩增E.coli(Escherichiacoli)天然分离物中转位插入序 列ISL的边侧序列;Triglia[6]等将反向PCR用于编码疟原虫(Plasmodiumfalciparum) 主裂殖子表面抗原前体的基因，在实验中，他们用Rsa?酶裂解基因组DNA，连接，得 到的环再用Hinf?在内部位点酶切，然后进行扩增，得到预期的297bp大小的片段， 并用DNA直接测序进行鉴定。他们认为反向PCR由于具有从全长cDNA得到序列信息的优 点，将对步查现转录基因的5’端或3’端的边侧区域有用。 反向PCR的另一个应用是Silver和Keerikatte进行的[7]。他们将其应用于扩增拉于整 合在小鼠细胞中的外生原病毒DNA边侧的细胞DNA。除强调反向PCR在染色体“步查” (Walking)或“跳查”中的用途，他们还指出，该技术用于扩增特征性弱的序列，这 些序列在E.Coli或其他宿主载体系统中很骓或不能克隆。 我们已改进反向PCR方法以得到在酵母人工染色体(YACS)[1]中的插入载体接头处的 特异探针。YACs库建立于果蝇 (Drosophilamelanogaster)OregonR种的高分子量DNA 上，有约平均大小170kb的插入。因为反向PCR可扩增果蝇插入子的特异末端，用YAC 载体任一臂上的一已知序列作核心区即可扩增，得到的DNA片段可用作探针检测所建 库中重叠和相邻的克隆序列[1]。 许多果蝇YAC染色体含有很大的插入区，可以与唾液腺多线染色体上几个相邻的主带 杂交。通过反各PCR人这些YAC克隆中产生末端牧场划1片段用于原位发交，也可以确 定插入DNA的方向。而且，许多YAC克隆含有中度或高度重复DNA序列，它们不能直接 用来探测文库以确定重叠克隆。图2为反向PCR产生的生物素标记的末端特异探针对果 蝇多线染色体的原位杂交。该探针含约1.3kb果蝇DNA，来自位于染色体2R染色体顶部 图中的一个120kb的YAC3’端。除了有助于确定具体YAC克隆的方向外，反向PCR产生的 末端特异DNA片段也克服了在含有重复DNA序列克隆的定位中的问题及制备毫克级特异 YAC探针用于染色体步查和杂交中的问题。 图2.反向PCR产生的特异末端片段与黑腹果蝇多线染色体杂交。染色体2R顶端黑色区 域为从含果蝇基因组DNA的酵母人工染色体上进行反向PCR扩增的产物与染色体2R杂交 所至。 PCR的应用和局限 如Ochman等，Silver和Keerikatte所述，反向PCR在研究转座因子、反转录病及其他 能与基因组DNA整合或易位的DNA序列中有许多重要应用。这些应用包括序列的易位、 转座和基因融合，其中之一是已知序列，例如癌基因 或免疫系统的基因组成。在所有 这些情况中，如已知序列插入未知序列或与未知序列并列，反向PCR可用于测定未知 边侧序列。反向PCR的主要优点是简单快速，可以研究许多独立克隆。其某些应用适 合于临床诊断。 目前反向PCR的局限之一是由未知边侧序列性质引起的，需用几种酶试验以选择产生 大小合适的片段的内切酶。另一局限是许多常用内切酶也在不适当位点裂解载体序 列。但一旦确定合适的内切酶，反向PCR方法是直接了当和可靠的。 大多数真核基因组含大量中度或高度重复序列，YAC或科斯粒中未知接点序列有时也 包括这些序列。通过反向PCR扩增得到的探针可与许多基因组序列杂交，但它们在用 于染色体的步查或跳查方面会受到限制，在这种情况下，需要进行亚克隆。 琼脂糖|聚丙烯酰胺|凝胶电泳|PCR产物分析 凝胶电泳分琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳两种. : 琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常用的分离纯化和 鉴定核酸的方法.琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物.根据琼脂糖的溶解温度， 把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖.低熔点琼脂糖熔点为62,65?，溶解后在 37?下维持液体状态约数小时，主要用于DNA片段的回收，质粒与外源性DNA的快速连 接等. (一)凝胶浓度 凝胶浓度的选择依DNA分子的大小而定. DNA分离范围 (%) 线型DNA分子的分离范围(Kb) 0.3 5,60 0.6 1,20 0.7 0.8,10 0.9 0.5,7 1.2 0.9,6 1.5 0.2,3 12.0 0.1,2 (二)电泳缓冲液 核酸电泳缓冲液有三种，即Tris-硼酸(TBE)、Tris-乙酸(TAE)和Tris-磷酸(TPE).TBE 与TPE缓冲容量高，DNA分离效果好，但TPE在DNA片段回收时含磷酸盐浓度高，容易使 DNA沉淀.TAE缓冲容量低，但价格较便宜，因而推荐选用TBE.缓冲液中的EDTA可螯合 二价阳离子，从而抑制DNA酶的活性，防止 PCR扩增产物降解. 10XTBE缓冲液的配制 Tris硷，108克 EDTA，9.3克 硼酸，55克 H2O至，1000ul (其PH应为8.0,8.2) 临用时用水稀至0.5XTBE(20倍稀释. (三)核酸电泳的指示剂与染色剂 1.指示剂:核酸电泳常用的指示剂有溴酚兰和二甲苯青及银染色.溴酚兰在碱性液体中 呈紫兰色，在0.6%、1%、1.4%和2%琼脂糖凝胶电泳中，溴酚兰的迁移率分别与1Kb、 0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb的双链线性DNA片段大致相同.二甲苯青的水溶液呈兰色，它在 1%和1.4%琼脂糖中电泳时，其迁移速率分别与2Kb和1.6Kb的双链线性DNA大致相似. 指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液.载样缓冲液的作用有?增加样 品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加样孔内.?在电泳中形成肉眼可见的指 示带，可预测核酸电泳的速度和位置.?使样品呈色，使加样操作更方便. 染色剂:核酸电泳后，需经染色后才能显现出带型，最常用的是溴化乙锭染色法，其 次是银染色. 溴化乙锭(ethidium bromide，EB)是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对 之间，在紫外线激发下，发出红色荧光.根据情况可在凝胶电泳液中加入终浓度为 0.5ug/ml的EB，有时亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色10,15min.琼脂 糖凝胶EB染色，肉眼可见核酸电泳带，其DNA量一般>5ng，当溴化乙锭太多，凝胶染 色过深，核酸电泳带看不清时，可将凝胶放入蒸馏水浸泡30min后再观察. 银染色:银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛 使Ag+还原成银颗粒，可把核酸电泳带染色黑褐色.主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色. 也用于琼脂糖凝胶染色.其灵敏度比EB高200倍.但银染色后，DNA不宜回收. (四)电泳 1.电泳装置: 电泳装置主要有电泳仪，电泳槽及灌胶模具等. 2.电泳方法: (1)用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净.放在水平桌面上，并架好梳子. (2)根据核酸分子量的大小配制不同浓度的琼脂糖凝胶，一般200,400bp的DNA片段， 可配制1.2,1.7%浓度的琼脂糖用于电泳. 3.配制0.5XTBE电泳缓冲液100ml于三角烧瓶中，称取一定量的琼脂糖 粉放入后沸水锅 或微波炉内加热熔化.冷却至60?(需要时可加入溴乙锭)，倒入电泳槽中，待凝固. 4.向电泳槽中倒入0.5XTBE，其量以没过胶面2mm为宜，小心移去梳子.如样品孔内有 气泡，应设法除去. 5.在DNA样品中加入0.2体积的载样缓冲液，混匀后，加入样品孔内. 6.接通电源，一般红色为正极黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动(靠近加样 孔的一端为负).电压为1-5V/cm(长度以两个电极之间的距离计算). 7.根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳.一般200,400bp的PCR产物50V电压， 电泳20,40min即可. (3)溴化乙锭染色后，紫外仪上观察电泳带及其位置，并与核酸分子量标准比较被扩 增产物的大小. 聚丙烯酰胺凝胶电泳适宜分离鉴定低分子量蛋白质、小于1Kb的DNA片段和DNA序列分 析.其装载的样品量大，回收DNA纯度高.长度仅相差0.2%(即500bp中的1bp)的核苷酸 分子即能分离. 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体，在催化剂TEMED(N，N，N，N'一四甲基乙二胺)和 过硫酸铵的作用下，丙烯酰胺聚合形成长链，聚丙烯酰胺链在交联剂，N，N'一亚甲 双丙烯酰胺参与下，聚丙烯胺链与链之间交叉联接而形成凝胶. 聚丙烯酰胺凝胶孔径的大小是由丙烯酰胺的浓度决定的，不同浓度丙烯 酰胺和DNA的 有效分离范围见表2. (%) 有效分离范围(bp) 溴酚兰* 二甲苯青* 3.5 100,2000 100 460 5.0 80,500 65 260 8.0 60,400 45 160 12.0 40,200 30 70 15.0 25,150 15 60 20.0 10,100 12 45 *表中给出的数字为与指示剂迁移率相等的双链DNA分子所含碱基对数 目(bp). (一)材料 1.电泳仪器:电泳仪，垂直电泳槽及其附件. 2.30%丙烯酰胺 丙烯酰胺，29克 N，N'一亚甲基双丙烯酰胺，1克 H2O，加至100ml 装于棕色瓶内，4?可保存二个月. 3.10%过硫酸铵 过硫酰铵，1克 加水至，10ml 4?可保存一周，-20?可保存一个月. 4.1XTBE电泳缓冲液 5.TEMED(四甲基乙烯基二胺) (二)聚丙烯酰胺凝胶的制备与电泳 根据分离DNA片段的大小及需凝胶的容积，配制聚丙烯酰胺凝胶. 1.按要求装配好垂直电泳板，两块玻璃板的两侧及底部用1%的琼脂 糖 封边，防止封闭不严而使聚丙烯酰胺液漏出. 2.将装好的玻璃电泳板倾斜成45,60?角. 3.按表3配制所需%浓度凝胶的毫升数. 4.加入TEMED后，立即混匀，缓缓倒入两玻璃板间的胶床中，直到液 体 接近溢出时为止. 5.立即插入适当的梳子，密切注意防止梳齿下产生气泡，用一有力 的夹将梳子夹在一边的玻璃板上，然后将玻璃板斜靠在物体上，使 成10?角，可减少液体泄漏的机会. 6.室温聚合一小时后，将玻璃板插入电泳槽中，上紧，倒入0.1XTBE 缓冲液. 7.小心取出梳子，立即用缓冲液冲洗加样孔，因为梳子取出后，梳 子上吸附的及凝胶顶部未聚合的丙烯酰胺会流入加样孔内聚合，产 生不规则的表面，将导致以后DNA电泳带型不规则. 8.将DNA样品与适量的载样缓冲液混匀后，加到样品孔内，加样时不 要产生气泡. 9.接好电极，电压为1-8V/cm，进行电泳. 10.根据指示剂迁移位置来判定是否终止电泳. 11.电泳毕，切断电源，弃去电泳仪，取出胶床板，小心移去一块玻 璃板，让凝胶吸附在另一块玻璃板上.浸入含0.5ug/ml的溴化乙锭溶 液中，15,30min后取出水洗紫外仪下观察结果. 12.聚丙烯酰胺凝胶电泳只能检出>10ng以上量的DNA条带.要求更高 的灵敏度，可用银染. PCR条件模板产物测序 PCR技术代替了为测序而反复进行的分子克隆和模板制备步骤。PCR技术与自动测 序技术相结合后，它将成为一种最快、最有效的测定核苷权序列的方法。本章主要综 述各种测模板的制备以及如何完成PCR产物的直接测序。与传统的将PCR片段克隆入质 粒或病毒基因组相比，直接序列分析有两个主要的优点:1)由于它是一个不依赖于生 物体(如细菌、病毒等)的体外系统，因而它更容易标准化(即例于自化2);对于每个待 测样品，只需测定一个单链序列，因而它也就更快和更准确。相比之下，间接测序为 了区别在PCR反应过程中由DNA聚合酶引入的随机错朽核苷酸所引起的原始基因组序列 中的突变，以及由体外重组而产生的人工扩增产物，如产生镶嵌等位基因(混合克隆) 等，每个样品不得不测定几个PCR产物克隆的序列。 不需借助在细菌中克隆就可直接获得清蜥和准确的序列结果，其难易程度取决 于:1)只扩增靶序列的PCR引物的扩增能力(通常称为PCR特异性);2用以获笪测序模板 的方法。与引物物异性及模板制备有关的问题将在下面谈到。虽然DNA测序的化学法 (Maxam-Gilbrt)可以用来直接测序，但我们这里仅讨论Sanger的末端终止法。 PCR条件 PCR反应的特异性在很大程度上是由寡聚核苷酸引物的序列所决定的。对于特定 的引物组，PCR的特异性可以由于采用最佳的反应条件、退火温度和PCR缓冲液中的 MgCl2浓度而发生明显的变化。如果用标准的1.5mM的MgCl2浓度不能得到所需的特异 性PCR产物，我们建议MgCl2的终浓度为1.4?2.5mM之间，以0.2mM增长率来改变MgCl2 浓度，以选择最佳Mg++浓度。一个较常遇见的问题是，使PCR特异性达到最高的MgCl2 浓度导致PCR扩增失败(dropouts)。这可能是由于模板DNA溶液中有较高的EDTA，它隆 低了提供给Taq DNA聚合酶MgCl2量。因此，对于扩增溶解在TE(1mM EDTA)中的DNA， 我们建议用含2.0mM的MgCl2的PCR缓冲液。 PCR反应的温度范围包含有三个不同的恒定期:变性期、退火期和延伸 期，还有它 们之间的过渡期。为了获得用于序列分析的模板或杂交探针的单链DNA，通常并不需 要改变参数。 PCR扩增的靶序列 如果最佳PCR反应条件不能产生所需的特异性产物，可采用新的寡核苷酸重新进 行扩增，或用凝胶电泳来分离不同的PCR产物，而后再各自重新扩增进行序列分析。 长度不同的片段可以用琼脂糖凝胶电泳来分离: 1.片段大小在80-100bp时，可采用3%NuSieve1%普通琼脂糖或用聚丙烯酰胺胶来 分离。 2.从胶上切下含所南非PCR片段的薄片。 3.加入50?100μlTE浸泡胶片，可反复冻融或放置几个小时使DNA从胶中扩散出 来。 4.取少量(1-5%)进行第二次扩增，为得到纯净单一的产物，用于第二次PCR扩增 的凝胶抽提物的量必须少于1ng。 5.现已发现琼脂糖含有抑制Tab聚合酶活的物质。因而，如需重新扩增供Tab聚合 酶测序用的片段，最好用丙烯酰胺电泳分离。 当用PCR引物扩增几个同样长度的相关序列时，如来自几个新近复制的基因，或 重复序列或保守的信号序列(conserved signal sequences)的同样显子，可以通过下 列两种不同方法来改进电泳分离。1).先用只切割某一模板的内切酶进行酶切，而后 电泳纯化完整的PCR产物。2).用可使核苷酸序列不同的扩增产物分开的电泳系统。下 一个部份将讨论此类系统中的变性甲酰胺梯度凝胶系统。采用方法一时，必须事先了 解在不同PCR产物中的内切酶位点。 当两个等位基因由于单一位点突变而产生差异时，用一个PCR引物直接进行测 序，能找出杂合位点。但是，带有几个点突变或短片段的插入/缺失的等位模板用PC R引物之一来直接测序，将产生复合序列带(compound sequencing ladders)。有四种 方法可以确定几种点突在型并从杂合体中获得单个等位基因的序列:1).克隆分离不同 的模板;2).在测序之前，利用模板之间核苷酸序列的差异，用电泳技术分离不同的模 板;3).在测序反应中只启动一个等位基因;4).只扩增一个等位基因。 与PCR产物的直接测序有关的一些问题是变性后由于扩增片段的两条链可以迅速 结合起来，从而阻止了测序引物与它的互补序列退火，或阻止了引物??模板复合物 的延伸。在测序反应中，模板链重新结合使一小部份模析骖与测序从而弱化最终的测 序条带。为减少此问题，可用改进的标准双链DNA测序法或用PCR制备单链模板。 DNA模板 有两种不同方法用来制备测序用的模板，目前都已用来测定共价闭环双链质粒模 板的序列。用这些方法来进行PCR产物的测序通常是较困骓的，因为短的线性模板比 团环质粒的双链更易于重新结合。在这两种方法中，PCR片段可以由凝胶电胶或在电 泳前先进行旋转透析(Spin-dialysis)纯化。 1.在室温下，模板先在0.2M NaOH中变性5分钟，冰冻，加入0.4倍的5M醋酸铵 (pH7.5)来中和反应。立即用四体积的无水乙醇沉淀DNA。在合适的退火温度下，加入 测序缓冲引物。 2.在95?下保温5分钟来变性模板，冰浴(或在干冰乙醇中)快速冷却离心管，以 减少链的重新结合。加入测序引物并使反应达到合适的温度。测序引物在变性前或后 加入都合适。 DNA模板 使用单链模板可以避免测序中链的重新结合。单链模板可以从双链DNA模板经链 分离凝胶中制备，或用PCR反应制备。大于500bp的单链DNA片段，可从琼脂糖凝胶中 分离笪到，但它不适合于更短的单链。制备单链DNA的另一种不同方法是在PCR反应中 使用一个生物素标记的引物，变性后的PCR产物经过一个亲合素柱而使两条链得到分 离，只有生物素标记的链才可结合到柱上。然而，最简单的方法是用改进的PCR方 法，用此方法制备既定的单链DNA。在这个反应中(不对称PCR，asymmetric PCR)，在 开始的20-25个循环中，两个比率不对称的扩增引物产生出双链DNA，当限量的那个引 物耗光后，随后的5-10个循环就产生出ssDNA。单链DNA在约在25个循环后开始出现， 这时限量的引物也几乎耗尽。经过一个短暂快速上升后，ssDNA就开始如预期的那样 呈线性积累，这时反应中仅有一个引物存在。各种比率的引物都以这种形式产生 ssDNA。一般对100μlPCR反应体系而言，引物比率为50pm0.5pmol，经过30个循环 后，大约可产生1-3pmol的ssDNA。ssDNA的产量可用下列几种方法来估计:a)。在PCR 反应中，除了加入正常数量的dDNA外，还加入32P-dNTP。取10%的反应产物在薄的3% NuSieve+1%普通琼脂糖凝胶中电泳，干燥并与胶片一起曝光。b).取5%的反应物来走 胶，转移到膜上，并用与ssDNA互补的寡核苷酸为探针杂交。ssDNA不能用EB染色来定 量，因为ssDNA有形成二级结构的趋势且染料的插入在模板中是随机的。使用不对称 引物比例的扩增效率比两种引物均过量80-90%)的扩增效率低(70%)。在实验中，这可 通过增加PCR循环的次数来弥补。若不对称的PCR反应不能产生足够数量的ssDNA，可 以试一试不同的引物比率;b).再加5-10个PCR循环;c).在最后五个循环中多加Tab聚合 酶(2U);d).试一下相反的不对称引物比率。有时，相反的不对称引物比率可能给出不 同产量的ssDNA。 制备出的单链DNA用限量的那个PCR引物或用一个内引物来测序，并 应用常规方法进行掺入测序(incorporation sequencing)或标记引物测序。制备出的 ssDNA链可能有一个不连续的5’-末端，但可能在靠近3’-末端不同位点处被切去，这 是由于延伸过程中终止过早所产生的。然而，对于测序反应中所使用的任何一种引 物，只有完整的ssDNA可以用作测序模板。 最近还报道了另一种方法制备单链核酸模板进行直接测序。这种方法包括在一个 PCR引物上加入噬菌体的启动子，转录出该PCR产物的RNA拷贝，再用反转录酶不测 序。但由于扩增反应后附加了一个酶促反应步骤和限于用反转录酶作为测序酶，这种 方法的应用受到很大的限制。 DNA聚合酶进行PCR产物的测序 一些不耐热DNA聚合酶已经用来直接测序体外扩增的DNA。使用Klenow聚合酶，修 饰T7DNA聚合酶(测序酶)及反转录酶来测序。 Taq聚合酶进行PCR产物的测序 Tab聚合酶除了用作PCR扩增外，它还是DNA测序的理想的酶。Tab聚合酶具有高度 的延伸能力(processivity)，较高的掺入速率，并可用一些核酶类似物如7-Deaza-2’ -脱氧鸟苷-5’-三磷酸来解决DNA测序中的压缩问题。除了这些与T7DNA聚合酶相同的 性质外，它有较高的热稳定性，使反应温度可达55-70?，这可使大量的二级结构解 体。可是，对于dNTPs而言，它有一个相对高的Km值(?10-20μM)并缺乏3’-外切酶活 性。当dNTP浓度低于1μM时，它将产生错配和不正确的终止。琼脂和琼脂糖中都有 Tab聚合酶的抑制物，但这些可通过增加测序反应中Tab聚合酶的量(2U-10U)得到部分 解决。当测定克隆插入子的PCR产物序列时时，由噬菌体液裂解制备的靶基因中并不 含有从平板溶解出来的抑制物。 DNA进行测序 带有强二级结构的DNA测序可能产生两个问题:1).由于Tab聚合酶不能完全延伸的 模板频率很高，因而降低了PCR的效率，2.).在测序反应中，压缩被测DNA序列的长 度。 研究结果表明:在PCR中使用Tab聚合酶(50-70?)的高反应温度足够解决大部份短 的二级结构。但强的二级结构会产生强烈的抑制作用。这些只能通过加入与dGTP比例 事适的碱基类似物c7dGTP后，才可解决。同样的碱基类似物也可用在测序反应中，来 解决压缩问题(compression problem)。Tab聚合酶可以有效地掺入c7dGTP，但不能用 次黄嘌吟核苷作为碱基类似物。同样的碱基类似物也可用在测序反应中，来解决压缩 问题(COMPRESSION)。Tab聚合酶可以有效地掺入c7d PCR产物克隆-平端粘端连接|T-vector法 平端连接 通常情况下，PCR产物可直接与平端载体DNA进行连接，但其连接效 率效低。因为TaqDNA聚合酶具有非模板依赖性末端转移酶活性，能 在两6条DNA链的3'末端加上一个多余的碱基，使合成的PCR产物成为 3'突出一个碱基的DNA分子。这种DNA分子的连接效率很低。由于PCR 产物的效率通过较高，。在采用大量T4DNA连接酶并配以5—10u T4 RNA连接酶时，可显著提高其连接效率。对于较短PCR产物，用PUS19 的Hinc?位点进行克隆，以X,gal和IPTG筛选，常可得到足量重组 子。另一种提高克隆效率的途径是先用Klenow大片段或T4DNA聚合酶 消去3'末端突出碱基将PCR产物变成平端DNA，然后再用平端连接法 克隆PCR产物。 引物中设计入限制酶位点:由于PCR引物的5'末端可以增加一些非 互 补碱基，因此可以在两引物的5'末端设计单限制酶或双限制酶切 位点。这样得到的PCR产物用限制酶消化产生粘性末端，即可与有互 补粘端的载体DNA重组。这种克隆方法效率较高，且当两引物中设计 不同酶切位点时，可有效地定向克隆PCR产物。其缺点是需要加长 PCR引物，除限制酶识别序列外，还需要在其5'端多合成3—4个碱基 以利于限制性内切酶与PCR产物末端的稳定结合。即使如此，其酶切 效率也不够高。其中尤以NotI、XhoI和XbaI等较为难切。采用突变 PCR方法可克服上述缺点。该方法是通过在两PCR引物序列中改变1至 数个核苷酸创造出一个限制性内切酶位点。鉴于PCR引物的3'末端序 列的互补性是PCR成功的关键，在PCR引物的中部或近5'端改变1个或 几个碱基对PCR扩增效果影响不大。这种方法不需要增加PCR引物的 长度，而且酶切效果优于5'加端法。对于特定DNA片段的克隆，此方 法较为经济、实用。但对于基因诊断PCR产物的克隆，似乎5'加端法 更为适宜。 T4DNA聚合回切产生粘端 如PCR两引物的5'末端是A或T，则可在 其5'端分别加上CG和CCGG。用此二引物扩增的PCR产物在dATP和dTTP 存在的情况下，用T4DNA聚合酶进行处理，则T4DNA聚合酶因具有3'? 5'外切酶活性而消去3'末端的G和C，产生AccI和XmaI粘性末端(图1)。 此DNA片段直接与用AccI和XmaI切开的载体进行连接。这种方法只需 在PCR引物的5'端加2—4个碱基，但其可选择的限制酶类有限。 T,vector法 TaqDNA聚合酶能在平端双链DNA的3'末端加一个碱 基，所加碱基几乎全是腺苷。据此，Marchuk等人采用3'端突出一个 胸苷的质粒DNA来克隆PCR产物，其克隆效率比平端的连接至少高出 100倍。他们用EcoRV将pBluescript切成平端，然后在2mmol/LdTTP 存在下，用TaqDNA聚合酶催化pBluescript的两个3'末端各加一处胸 苷。因为在4种dNTP都存在时，Taq聚合酶选择性参入 dATP，而当仅 一种dNTP存在时，它只能参入该种碱基。因此，在只加入ddTTP时， 用TaqDNA聚合酶可使平端载体DNA转变成3'末端突出一个胸苷的T尾 载体，称为T,vector。用这种T,vectorsk可以较有效地直接克隆 PCR产物。Hotton等人也报道了另一种制备T,vector的方法。他们 使用脱氧核苷酸末端转移酶在切成平端的载体DNA的3'末端加上一个 胸苷。由于末端转移酶可以催化多个碱基(ddTTP)作为底物，使平 端载体DNA分子的两个3'末端各加上一个T。用这种方法制备的T,vector 的不同之处在于前者3'末端不能与待克隆PCR产物的5'末端连接，仅 5'末端可与PCR产物的3'末端形成磷酸二脂键。 共环消解法:最近，Jung等人报道了一种有效的PCR产物克隆方 法。用磷酸化的PCR引物扩增得到的PCR产物，先用T4DNA连接酶催化 连接反应，使5'端带有限制酶切位点的扩增DNA片段连接成共环结 构。然后再用相应的限制酶进行消化，产生粘端DNA片段。对于对称 性限制酶位点，只需在引蛾的5'末端加上一关识别序列，因为在串 接成共环后能恢复限制酶切位点难于切开的缺点，且可用于双限制 酶切位点的设计，只不过有PCR产物共环化后，仅约1/4的限制酶切 点得以恢复。故此法较适用于单限制酶位点的克隆。 (A) 无连接酶克隆法(ligase-free subcloning，LFS)是利用引物5’ 末端附加碱基修饰法，修饰碱基不是酶切位点，而是与某一质粒两 端分别互补的碱基。两引物的3’端约20—25个核苷酸分别与待扩增 DNA两翼互补，5’端各有约24个核苷酸分别与线性化质粒的3’端相 同的附加序列。由于线性化质粒的3’端序列各不相同，PCR片段可 以通过选择各引物的合适5’附加序列与引物3’端定向杂交。 由此物a和b产生的两端有附加序列的PCR产物与未反应引物分离后， 分别加入两只含有线性化质粒的反应管中进行第二次PCR。第1管中 用引物a和c，引物a即为第一PCR扩增的上游引物a，引物c为下游引 物，与紧邻5’ 端附加序列内测的质粒(+)链互补。同样，第2管的 引物为b和d，引物b与第一次PCR扩增的下游引物b相同，引物d为上 游引物，与紧邻5’附加序列内侧的质粒(-)链互补。 第二次PCR的第一循环中，PCR产物与质粒均变性与复性。除自身复 性产物(这种复性产物不被扩增)外，PCR产物与质粒可通过各自3’ 端互补序列杂交成部分异源双链，延伸时，重叠的3’端互为此物沿 各自互补链延伸，结果可产生PCR片段与线性质粒的“连接”。然后 两管中PCR扩增各进行15—20个循环。这便可产生大量一端管1)或 另一端连接有PCR插入片段的质粒。 第二次PCR后，将第1管与第2管反应液混合，用碱变性双链，中和后 稀释变性的DNA。反应管中的单链DNA可以复性或几种不同的产物， 除各自本身复性产物外，管1产物ssDNA与管2中ssDNA可形成部分异 源双链DNA，并各自有一较长的5’或3’悬端，这种长的5’或3’悬 端相互互补，在低DNA浓度时可复性产生环化DNA。 尽管这种环化的DNA有两个缺口，但它们可以直接用来转化受体大肠 直杆菌。一旦进入体内，两个缺口便共价连接，修复的质粒即可复 制，下面以从λ噬菌体DNA中扩增-500bp片段，并克隆入pGem4Z载体 中为例说明LFS法。 这种方法同样适于复杂基因组中基因片段的克隆。需注意的是第一 次PCR时两引物的5’附加序列不应太短以免影响第二次PCR时异源双 链的形成，以24个核苷酸较为合适。扩增时若形成，引物二聚体， 一定要去除，否则会严重影响转化率。用LFS法已成功地克隆了长达 1.7kb的基因片段。这种方法的优点是:?可用于常规方法无法进行 亚克隆的片段;?适于任何PCR产物和任何质粒;?可亚克隆特殊目 的(如含点突变、缺失或插入等)片段;?在某些情况下，对已构 建了启动子或增强子等序列的载体，可使待表达片段插入定向合适 位置;?较快，可在1d内完成，较常规方法可靠，不需DNA连接酶。 DNA克隆是分子生物学的重要内容。特定基因的克隆常因两端缺乏合 适限制酶切点而受因，cDNA的克隆通常也效率不高、筛选因难。采 用PCR技术行DNA和cDNA的克隆，则可大大缩短克隆时间，比之全基 因合成更为经济和方便，因而愈来愈受重视。用PCR方法进行传染性 疾病和遗传性疾病的诊断常遇到产物的异性问题和分型问题，采用 产物克隆和测序方法，比之寡核苷酸探针杂交方法更为准确。随着 PCR技术的不断发展和推广，新的PCR产物的克隆方法也将不断出现。 酶 切 反 应 (Setting Up a Restriction Endonuclease Reaction) 一、 建立一个标准的酶切反应 10个单位的内切酶可以切割1μg不同来源和纯度的DNA。通常，一个50μl的反应体系中，1μl的酶在1X NEBuffer终浓度及相应温度条件下反应1小时即可降解1μg已纯化好的DNA。如果加入更多的酶，则可相应缩短反应时间;如果减少酶的用量，对许多酶来说，相应延长反应时间(不超过16小时)也可完全反应。 选择正确的酶 DNA上必须至少有一个相应的识别位点。识别碱基数目少的酶比碱基数目多的酶更频繁地切割底物。假设一个GC含量50%的DNA链，一个识别4个碱基的酶将平均在每44(256)个碱基中切割一次;而一个识别6个碱基的酶将平均在每46(4096)碱基切割一次。内切酶的产物可以是粘端的(3'或5'突出端)，也可以是平端的片段。粘端产物可以与相容的其它内切酶产物连接，而所有的平端产物都可以互相连接。相关信息参见目录的 Compatible Cohesive Ends And Recleavable Blunt Ends一文。 酶 体系中(在加入酶之前所有的其它反应物都应当已经加好并已预混合)。酶的用量视在底物上的切割频率而定。例如，超螺旋和包埋法切割的DNA通常需要超过1U/μg的酶才能被完全切割。参见目录第244和264之"切割质粒DNA"和"包埋法切割DNA"。 DNA DNA应当已去除酚、氯仿、乙醇、EDTA、去污剂或过多盐离子的污染，以免干扰酶的活性。DNA的甲基化也应该是酶切要考虑到的因素。关于甲基化的内容，参见第252页至253页之甲基化相关内容。 缓冲液 NEB都提供相应的最佳缓冲液，可保证几乎100%的酶活性。使用时的缓冲液浓度应为1X。有的酶要求100μg/ml的BSA以实现最佳活性。在这种情况下，我们也相应提供100X的BSA(10mg/ml)。不需要BSA的酶如果加了BSA也不会受太大影响。关于缓冲液更详细的信息参见第234页。 反应体积 1小时内，50μl反应体积中，降解1μg的底物DNA所需的酶为一个活力单位。因此酶:DNA的反应比例可以由此确定。较小的反应体积更容易受到移液器误差的影响。为了将甘油的浓度控制在5%以下，要注意酶的体积不要超过总体积的10%(一般酶都贮存于50%的甘油中)。 混合 而常常被忽略的一步。想要反应完全，必须使反应液充分混合。我们推荐用枪反复吸取混合，或是用手指轻弹管壁混合，然后再快速离心一下即可。注意:不可振荡～ 反应温度 37?C;从嗜热菌中分离出来的内切酶则要求更高的温度。一般为50-65?C不等。参看第244页 Activity of thermophiles at 37?C。 反应时间 1酶活单位的定义时间为1小时。如果加入的酶较多，可以相应地缩短反应时间;反之，如果加入的酶量较少，也可以延长时间以使反应达到完全。参见第241页酶在反应中的存活时间。 终止反应 NEB我们使用如下反应终止液:50%的甘油，50mM EDTA(pH8.0)，和0.05%溴酚蓝(10μl/50μl反应液)。如果要进行下一步酶切反应，可用热失活法终止反应(65?C或85?C，20分钟)。热失活并不能适用于所有的酶，详情参见第240页热失活表。此外，酚/氯仿抽提也可以用于终止反应。 -20?C。少部分酶则须在-70?C长期保存。详情请参见相关酶的DATA SHEET 或目录相关部分。10X BUFFER 和100X BSA于-20?C保存。BSA不能与NEBuffer混合后保存，否则将会出现BSA沉淀。 1-2个月都会对所有的酶有一个活性检测;最近的一次检测结果将被贴在售出的每一管酶上。通过三十多年来的经验，我们发现大部分酶在推荐的保存缓冲液里在-20?C条件下十分稳定。高于-20?C条件下稳定性将有所降低。 DNA底物不能被成功切开，可以进行对照实验以查明原因。具体方法如下: DNA(待切底物)与加入了内切酶的对照DNA(有多个已知酶切位点)同时进行反应。若实验结果表明底物DNA降解，则说明DNA在纯化过程中或反应液里引入了核酸酶污染;若实验结果发现底物DNA保持完整，而对照DNA被成功切开，则可以排除酶质量的原因，此时可以将对照DNA和待切底物DNA混合起来再次进行反应，以确定样品中是否有抑制剂。如果有抑制剂存在(通常是盐、EDTA或酚)，则混合物里的对照DNA也无法被切开。 DNA酶切 一、 DNA酶切反应 1、 将清洁干燥并经灭菌的eppendorf管(最好0.5ml)编号,用微量移液枪分别加入DNA 1μg和相应的限制性内切酶反应10×缓冲液2μl,再加入重蒸水使总体积为19μl,将管内溶液混匀后加入1μl酶液,用手指轻弹管壁使溶液混匀,也可用微量离心机甩一下,使溶液集中在管底。此步操作是整个实验成败 的关键,要防止错加，漏加。使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降低。 2、 混匀反应体系后,将eppendorf管置于适当的支持物上(如插在泡沫塑料板上),37?水浴保温2-3小时,使酶切反应完全。 3、 每管加入2μl 0.1mol/L EDTA(pH8.0),混匀,以停止反应,置于冰箱中保存备用。 二、DNA分子量标准的制备 采用EcoR?或Hind?酶解所得的λDNA片段来作为电泳时的分子量标准。λDNA为长度约50kb的双链DNA分子,其商品溶液浓度为0.5mg/ml,酶解反应操作如上述。HindIII切割 DNA后得到8个片段,长度分别为23.1, 9.4, 6.6, 4.4, 2.3, 2.0, 0.56和0.12kb。EcoRI切割lDNA后得到6个片段,长度 分别为21.2, 7.4, 5.8, 5.6, 4.9和2.5kb。 三、 琼脂糖凝胶的制备 1、 取5×TBE缓冲液20ml加水至200ml,配制成0.5×TBE稀释缓冲液,待用。 2、 胶液的制备:称取0.4g琼脂糖,置于200ml锥形瓶中,加入50ml 0.5×TBE稀释缓冲液,放入微波炉里(或电炉上)加热至琼脂糖全部熔化,取出摇匀,此为0.8,琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。 3、 胶板的制备:将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏(宽约1cm)紧密封住。将封好的胶槽置于水平支持物上,插上样品梳子,注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙。 50-60?的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭(EB)溶液使其终浓度为0.5μg /ml(也可不把EB加入凝胶中,而是电泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色)。用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封橡皮膏内侧,待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内,使胶液形成均匀的胶层。倒胶时的温度不可太低,否则凝固不均匀,速度也不可太快,否则容易出现气泡。待胶完全凝固后拨出梳子,注意不要损伤梳底部的凝胶,然后向槽内加入0.5×TBE稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。因边缘效应样品槽附近会有一些隆起,阻碍缓冲液进入样 品槽中,所以要注意保证样品槽中应注满缓冲液。 4、 加样:取10μl酶解液与2μl 6×载样液混匀,用微量移液枪小心加入样品槽中。若DNA含量偏低,则可依上述比例增加上样量,但总体积不可超过样品槽容量。每加完一个样品要更换tip头,以防止互相污染,注意上样时要小心操作,避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。 5、 电泳:加完样后,合上电泳槽盖,立即接通电源。控制电压保持在60-80V,电流在40mA以上。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时,停止电泳。 6、 染色:未加EB的胶板在电泳完毕后移入0.5μg/ml的EB溶液中,室温下染色20-25分钟。 7、 观察和拍照:在波长为254nm的长波长紫外灯下观察染色后的或已加有EB的电泳胶板。DNA存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。紫光灯下观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃面罩,以免损伤眼睛。 经照相机镜头加上近摄镜片和红色滤光片后将相机固定于照相架上，采用全色胶片，光圈5.6,曝光时间10-120秒(根据荧光条带的深浅选择)。 8、 DNA分子量标准曲线的制作:在放大的电泳照片上,以样品槽为起点,用卡尺测量λDNA的EcoR?和Hind?酶切片段的迁移距离,以厘米为单位。以核苷酸数的常用对数为纵坐标,以迁移距离为横坐标,在坐标纸上绘出连结各点的平滑曲线,即为该电泳条件下DNA分子量的标准曲线。 9、 DNA酶切片段大小的测定:在放大的电泳照片上,用卡尺量出DNA样品各片段的迁移距离,根据此数值,在DNA分子量标准曲线上查出相应的对数值,进一步计算出各片段的分子量大小(若用单对数坐标纸来绘制标准曲线,则可根据迁移距离直接查出DNA片段的大小)。反之,若已知DNA片段的大小亦可由标准曲线上查出它预计的迁移距离。 10、 DNA酶切片段排列顺序的确定:根据单酶切,双酶切和多酶切的电泳分析结果,对照DNA酶切片段大小的数据进行逻辑推理,然后确定各酶切片段的排列顺序和各酶切位点的相对位置。以环状图或直线图表示,即成该DNA分子的限制性内切酶图谱。 [注意] 1.酶切时所加的DNA溶液体积不能太大，否则DNA溶液中其他成分会干扰酶反应。 2、酶活力通常用酶单位(U)表示，酶单位的定义是:在最适反应条件下，1小时完全降解1mg lDNA的酶量为一个单位，但是许多实验制备的DNA不象lDNA那样易于降解，需适当增加酶的使用量。反应液中加入过量的酶是不合适的，除考虑成本外，酶液中的微量杂质可能干扰随后的反应。 3、市场销售的酶一般浓度很大，为节约起见，使用时可事先用酶反应缓冲液(1×)进行稀释。另外，酶通常保存在50%的甘油中，实验中，应将反应液中甘油浓度控制在1/10之下，否则，酶活性将受影响。 4、 观察DNA离不开紫外透射仪,可是紫外光对DNA分子有切割作用。从胶上回收DNA时,应尽量缩短光照时间并采用长波长紫外灯(300-360nm),以减少紫外光切割DNA。 5、 EB是强诱变剂并有中等毒性,配制和使用时都应戴手套,并且不要把EB洒到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。 6、 当EB太多,胶染色过深,DNA带看不清时,可将胶放入蒸馏水冲泡,30分钟后再观察。 1、什么是高原反应,高原反应有哪些症状, 高原反应是人到达一定海拔高度后，身体为适应因海拔高度而造成的气压差、含氧量少、空气干燥等的变化，而产生的自然生理反应，海拔高度一般达到2700米左右时，就会有高原反应。高原反应的症状一般表现为:头痛、气短、胸闷、厌食、微烧、头昏、乏力等。部分人因含氧量少而出现:嘴唇和指尖发紫、嗜睡、精神亢奋、睡不着觉等不同的表现。部分人因空气干燥而出现:皮肤粗糙、嘴唇干裂、鼻孔出血或积血块等。 2、如何避免或减轻高原反应, 绝大部分人到西藏是没有高原反应，一般什么样的人会有高原反应没有规律可循，避免或减轻高原反应的最好方法是保持良好的心态面对它，许多的反应症状都是心理作用或有心理作用而引起的，比如:对高原有恐惧心理，缺乏思想准备和战胜高原决心的人，出现高原反应的机会就多。 建议初到高原地区，不可疾速行走，更不能跑步或奔跑，也不能做体力劳动，不可暴饮暴食，以免加重消化器官负担，不要饮酒和吸烟，多食蔬菜和水果等富有维他命的食品，适量饮水，注意保暖，少洗澡以避免受凉感冒和耗体力。不要 一开始就吸氧，尽量要自身适应它，否则，你可能在高原永远都离不开吸氧了(依赖性非常强)。 走入高原腹地所需的物资-青瓜,西红柿。可服用一些缓解高原反应的药品:高原安、高原红景天(至少提前10天服用)、西洋参含片、诺迪康胶囊(对缓解极度疲劳很有用)、百服宁(控制高原反应引起的头痛)、西洋参(对缓解极度疲劳很有用)、速效救心丸，但作用不是特明显，一般认为都是自我安慰的精神疗法，与保持良好的心态效果雷同。对于高原适应力强的人，一般高原反应症状在1-2天内可以消除，适应力弱的需3-4天。 3、到达西藏后有高原反应我怎么办, 西藏一般宾馆或有一定规模的城镇都有医院或卫生院，轻微的高原反应建议通过自我调节来适应它，严重的可以看医生。出现高原反应后，应多休息，少活动，坚持进食，可服用一些缓解高原反应的药品。 严重的高原反应，比如出现:浮肿、肺水肿、重感冒等症状，建议一定到医院输液、吸氧等治疗，并尽快离开高原，在拉萨比较方便，每天都有进出拉萨的航班，可乘航班离开，一般高原反应一进飞机或一到平原便消失的无影无踪，并且无任何后遗症。 4、进藏身体有何要求,哪些病人不宜进藏,是否要体检吗,需要锻炼身体吗, 进藏除了要保持良好的心态外，对于健康的身体并无特殊要求，有严重呼吸气管、心脏、心血管、精神方面疾病的人不宜进藏，因此，对于有严重的高血压、心脏病、(支)气管炎、糖尿病、感冒的患者限制进藏。到西藏一般不需体检，没有以上几种严重疾病的人都能去西藏。建议进藏前不要刻意的锻炼身体，因为通过锻炼后的身体，耗氧量增大，增加了在西藏心脏的负担，反而容易引起高原反应。 5、感冒为什么不能去西藏,在西藏感冒怎么办, 感冒患者由于自身身体机能被破坏，抗病能力减弱，又增加自身的抵抗能力负荷，带着严重的感冒进藏极易转为其他高原病，特别是肺水肿-一种特别危险的高原疾病，不及时治疗很容易有生命危险。感冒患者，一定要将感冒治好后才进藏，不能带感冒病菌进藏。 在西藏感冒，一般没有太大的问题，因在高原已经有一定的适应性和抵抗力，身体基本上都调整过来了，及时治疗即可，而且，西藏的医生治疗感冒都非常有经验。随身带一些感冒药，一旦有感冒征兆，自己服用一些常用感冒药品，一般1-2天症状即可消失。 6、西藏洗澡方便吗, 西藏有一定规模的城市(比如:拉萨、日喀则、樟木镇、江孜、泽当、林芝、那曲)都有洗澡的地方，一般星级宾馆的标准间都有独立的卫生间，有热水，可洗澡，许多招待所也有公共浴池，定时供应热水，洗澡都较方便。初到西藏，尽量少洗澡或不洗澡，以免受凉感冒，或因洗澡消耗体力过度而引起或加重高原反应，到达几天后，身体适应高原气候后，洗澡一般没有问题了。因西藏的空气干燥、蒸发快且晚上气温较寒冷，人在西藏一般不是特别想洗澡，并且不会感觉不舒适。 7、听说乘飞机进藏比从陆路进藏高原反应更厉害, 乘飞机进藏和从陆路进藏各有利弊，但没有什么优劣之分。因一般高原反应是在抵达高原后3-4个小时后才有可能有，乘飞机进藏的话，若有高原反应，此时都已经抵达住宿地点，可以得到充分的休息和调整了，而且即使有严重的反应，也可采取一些正规的辅助治疗，较为方便。陆路进藏，虽然海拔逐渐升高，理论上有利于适应高原反应，但由于所有进藏的陆路路况都很糟糕，特别是长途汽车，车内空气不好，空间又狭小，加之长途乘车、颠簸，体力消耗特别大，反而容易造成高原反应，特别陆路还要翻越几个海拔在5000米以上的山口，且一旦有严重的反应，应急治疗设施都没有，反而比较危险。 8、时间非常紧，我如何选择西藏旅游路线, 对于时间较紧张的，飞机往返比较适合您，您可选择拉萨一地四日或选择西藏的黄金旅游线路拉萨-江孜-日喀则六日游。另外，让旅行社来安排您的西藏之行是个明智的选择，您不必去收集资料、筛选资料、安排选择线路、考虑餐饮、考虑住宿等诸多琐事，您可将您的想法告诉旅行社，旅行社会根据您的要求推荐给您具体的特色旅游线路，或您也可选择参加旅行社成行团队或单独组团进藏旅游，或者一些比较有个性的特种旅游，如:徒步、野营、挑战自我。 9、走川藏线进藏好还是走青藏线进藏好, 川藏线是陆路进藏风景最美的路线，但这条线也是最危险的一条线路，路况基本以砂石或石子路面为主，危险主要来自自然条件，此线路横穿横断山脉，雨季多泥石流，冬季多大雪封山，途中四季变幻无常，住宿和餐饮条件很简陋，比较适合旅游探险者或深度旅游爱好者，建议初次进藏的游客不要选择这条线路。青藏线为进藏路况最好的线路，全成柏油路面，基本上没有危险而言，住宿和餐饮条件比较齐备，但风景较平淡、单调，适合初次进藏又不想乘飞机的旅游者。 10、青藏线的沿途住宿、餐饮条件如何, 住宿已经都可以保证，条件较差的像茶卡、沱沱河有招待所和兵站可以住宿，其他各地都有宾馆和招待所，基本上，随到随住，很少有住满的时候，有宾馆的地方就有热水、可以洗澡，当然，招待所就无法保证热水了。餐饮也绝对没问题，沿途川菜馆和回民开的餐馆很多，只要不是特荒凉的路段，基本上由村庄或部队的地方，十几分钟您就可吃到热饭或面，而且沿途小买铺也很多，您可买到方便 面或饼干。 11、机场到拉萨的交通工具如何解决, 民航公司有民航班车往返于拉萨和贡嘎机场之间，车次基本上于当天的进出的航班相衔接的，基本上是人差不多坐满就走，或一个航班人走完就走，从拉萨的发车时间较稳定。像其他机场一样，拉萨贡嘎机场也有许多出租车可以租，可以几个人合租或个人包租，司机会按人头收费或按车收费，但一定要和司机侃价，侃多少要看您的口才了。 12、拉萨在哪租车,租车安全吗,价格如何, 拉萨短途，若租出租车(桑塔纳)，在街边招手直接和出租车司机谈即可。若想跑长途(一般用越野车)，可到八角街停车场找司机谈;可到几个散客较集中的旅馆像亚旅馆、八朗学旅馆、雪域旅馆等里的公告栏里找一些合租的人或一些司机留下的联系方式，与他们联系;可找旅行社，在出发前将车就租好;也可找车队租车。 西藏租车一般来说比较安全，但经常会有些司机临时涨价或征收额外费用，即使有也没有用，特别是私人的车，更易发生，建议租车身印有“西藏旅游局”标志(牦牛)的旅游车或更保险的找旅行社租车，较为安全。还有，因旅游车辆平时保养较好些，从车况本身来说也较安全。车费从2.5-5块不等，根据车型、车况、旅游季节不同而不同。在西藏租车，建议在车费上不要过分渴求低价，一分价格一分货，届时您的屁股就会告诉您。 13、西藏的住宿条件如何,需带帐篷和睡袋吗,能租到吗, 目前，随着旅游资源的进一步开发和游客的增加，西藏的住宿条件已经得到了很大的改善，比较大的几个城市，各等级的星级宾馆都已经具备，各县城也都至少有招待所可供住宿，但整体宾馆和招待所的水平要比内地同一水平低一个档次。像拉萨有从普通的招待所到四星级的各类住宿房间，日喀则、江孜、泽当、林芝有从普通的招待所到三星级的各类住宿房间，定日、樟木、那曲有从普通的招待所到二星级的各类住宿房间，其他比较偏僻或较小的地方主要以招待所为主。到西藏旅游，是否需要带帐篷和睡袋，主要是看以什么方式旅游和到什么地方旅游，若参加旅行社的常规旅游线路，就没有必要带这些设备，因为旅行社的常规线路都是住宿设施比较完备的城市，沿途都住星级宾馆。若到比较偏僻的地方，可能要住招待所时，建议带上睡袋比较好，主要是为了卫生和防寒;若是徒步、骑自行车、探险旅游基本上是露营，那帐篷和睡袋是必不可少的，一定要考虑到自身的身体条件，因为那毕竟在高原，抬脚都比较辛苦，找到适合扎营的地方和搭帐篷都是非常艰巨的工作。 帐篷和睡袋在拉萨很方便可以租到，费用按天计算，按质论价。一般的旅行社都提供此类服务，还有在布达拉宫广场的几个探险专用商店也可办理出租业务。 14、西藏的星级宾馆多吗,紧张吗,价格贵不贵, 西藏，像拉萨、日喀则这种主要旅游地，星级宾馆较多，拉萨有四五十家星 ”三个黄金周住宿非常级宾馆，日喀则一二十家，除了五一、十一和八月“雪顿节 紧张外，其它时间住宿都没问题。其他地方的星级宾馆比较少，但相对来说去旅游的游客也不多，所以，住房很少出现“紧张”的局面。由于西藏地处高原，旅游淡旺季很明显，淡季基本处于歇业状态，故旺季房费比内地的房费相对较高，贵30%左右，部分或某个时段房费也可能翻倍。 关于高原反应: 去高原旅行都会面临有高原病症状的风险，过去一直把这些症状错误归因于流感或醉酒，一般1200至1800米就会有轻度高原症状发生，而严重症状的发生都不低于2700至3000米。我们一定要把自己旅途疲劳等在平原也会发生的不适与高原发生的不适应区别开。 经公路进藏的旅游者给他们的身体逐步适应高原提供了机会，但旅行社也有许多压力。事实上，在一些高原旅行的经典路线上会有50%左右的高原病发病率(而飞到拉萨的旅游者中据统计有1%的人会罹患高原病)。喜马拉雅山的另一边尼泊尔统计过这样的数据，旅行者每30，000人中将有1人死于高原病，每年因此有2-3人罹难。 上高原之前需要注意的是: 自己过去的身体状况是否能够接受环境的挑战，这也许需要请教自己的医生说明一下自己是否存在重要的器官功能不全;避免出发前的感冒、发烧之类呼吸道常见病;保存充沛的体力。飞抵拉萨的旅游者中据统计有1%的人会罹患高原病，因此参加旅游的人们进行一些预防用药可能是必要的。预防方面包括可以服用一些中成药，如西洋参、红景天等，西药目前认为比较好的是心痛定，但是有个别人会产生头痛等副作用，应在医生指导下使用。在高原上，解决一些常见症状可以使用:芬必得治头痛，维生素B6治恶心、呕吐，如果仍感觉不适就应该上医院治疗。告诉你一个经验之谈就是不要背着大包袱上高原，这包袱就是你的恐惧心理。 其他还要注意的事项: 1.药箱，提议旅客准备大小两个的小型药盒，大的放在背囊里，小的随身带。 基本的药物包括: 必理痛，阿士匹灵，感冒灵，伤风，牛黄解毒片，止咳水，喉炎丸，维他命C丸，白花油，纱布，胃药，眼药水及消炎药，治感冒头疼的(推荐:加合百服宁)，肠胃药;西洋参含片和金施而康对你的身体很有帮助。 2.墨镜和太阳帽，高原强烈的阳光和紫外线会伤害你的眼睛，尤其在喜马拉雅山区。 3.防晒霜、润肤露和润唇膏也是必须的，高原的空气是干燥的，阳光是强烈的，以至于在贡嘎机场大家经常可以看到一些游客带着灼伤的面颊和鼻子离开拉萨。 4.关于隐形眼镜:西藏尘土特别大，加上卫生条件欠佳，其实不宜带隐形眼镜，要戴的话，不妨考虑使用用完即弃型的镜片。拉萨也有出售进口隐形眼镜，价格和内地差不多。 ,)(应尽可能预备氧气和防治急性高原病的药物，如硝苯吡啶(又名心痛定)、氨茶碱等，也需备有防治感冒的药物、抗菌素和维生素类药物等，以防万一。 (,)(由于高原气候寒冷，昼夜温差大，要注意准备足够的御寒衣服，以防受凉感冒。寒冷和呼吸道感染都有可能促发急性高原病。 (,)(在进入高原的途中若出现比较严重的高山反应症状，应立即处理，及时服用氨茶碱或舌下含服硝苯吡啶,,毫克。严重时应吸氧。若出现严重的胸闷、剧烈咳嗽、呼吸困难、咳粉红色泡沫痰，或反应迟钝、神志淡漠、甚至昏迷，除作上述处理外，应尽快到附近医院进行抢救，或尽快转往海拔较低的地区，以便治疗恢复。 (,)(由于乘车进入高原所需时间长，途中住宿条件差，体力消耗大，因此除要准备以上各种物品外，还应该准备水或饮料以及可口易消化的食物，以便及时补充机体必需的水和热量。