Q-PCR重复性

Q-PCR重复性实验的时候常常面临一个问题：重复性。那么如何才能做好样品之间的重复，在实验过程中我们要注意那么方面，下面展开讨论。1：合格重复性  重复性为：3个重复样品的任何两个样品CT值之差不能大于0.5。举例如下：重复样品    1    2    3合格CT    18.49    18.56    18.32不合格CT    18.03    18.79    18.72  18.79－18.03=0.76＞0.5因为重复2－重复1＞0.5，所以三个重复不合格，需要重做。2：做好重复性  假设做1个目的基因9个样品，操作步骤如下：2.1为了得到良好重复性我们可以每个样品做4个重复，这样假如4个里面有一个不好，还有合格的3个重复数据，另外这样做还可以避免反应过程中的边缘效应。2.2 先配制混合液。实验过程体系如下：   PCR反应体系    1×SYBYMIX    5µLPrimerF/R(5P)    0.5µLDNA    2µLddH2O    2µlTotal    10µL注意：在配置混合液的过程中一般每9个反应，多加一个。   模板DNA需要单独加入   9个样品，每个样品4个重复。理论需要配制36个反应液，我们实际需要配制40个反应体系反应总体系如下：PCR反应体系SYBYMIX    200µLPrimerF/R(5P)    20µLDNA    2µLddH2O    80µL 2.3配制好混合液后放进4℃备用2.4拿出5排八连管（或者PCR反应板）  操作必须在冰上进行。（可以根据情况购买反应冰盒或者自行制备）加模板（模板必须完全相同，不能为相同样品，放在不同管中）必须用同一个枪头加4个重复。（也就是说只需要用9个枪头）模板要加到反应管的底部，并且不要产生气泡。2.5加完模板后，用一个枪头加反应液。反应液要加在反应孔壁上，这个时候如果是好的反应耗材，可以明显的看到液体顺着管壁流下，不会有任何残留。（只需要一个枪头）当然此过程中如果感觉枪头使用次数过多造成了稍许的挂壁现象，可以更换，但必须保证4个重复不更换枪头。2.6加好样品后，盖上盖子或者是封板模，一定保证封好口。2.7进行离心，转速不要超过2000.2.8进行上机反应。2.9结果。3.实验中关键点：1：必须保证1个月对移液器进行校正。如果使用频率比较高可半月校正一次。2：实验中移液器必须专用。3：规范用移液器，禁止用力下磕移液器使枪头固定在移液器上，正确的使用方法是转动移液器使枪头固定。4：实验仪器进行定期检查，维护。避免有反应孔不合格。5：实验过程中必须选择Real-TimePCR专业枪头和反应板或者八连排（这个很重要）因为普通的枪头或者反应板没有经过特殊处理会发生挂壁现象，这对重复性是致命的。推荐使用Crystalgen公司耗材产品，基诺莱普生物技术有限公司2×SYBRGreenqPCRMix我们实验室一直再用此产品，性价比很高。完全可以替代Axygen产品。