GB 4789.7-2013 食品安全国家标准 副溶血性弧菌检验

中华人民共和国国家标准GB4789.7—2013食品安全国家标准食品微生物学检验副溶血性弧菌检验2013-11-29发布2014-06-01实施GB4789.7—2013I前言本标准代替GB/T4789.7-2008《食品卫生微生物学检验副溶血性弧菌检验》。本标准与GB/T4789.7-2008相比，主要变化如下：——修改了标准的中文名称；——修改了范围；——修改了设备和材料；——修改了培养基和试剂；——修改了样品制备过程；——修改了检验程序。GB4789.7—20131食品安全国家标准食品微生物学检验副溶血性弧菌检验1范围本标准规定了食品中副溶血性弧菌（Vibrioparahaemolyticus）的检验方法。本标准适用于食品中副溶血性弧菌的检验。2设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：a)恒温培养箱：36℃±1℃；b)冰箱：2℃～5℃、7℃～10℃；c)恒温水浴箱：36℃±1℃；d)均质器或无菌乳钵；e)天平：感量0.1g；f)无菌试管：18mm×180mm、15mm×100mm；g)无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头；h)无菌锥形瓶：容量250mL、500mL、1000mL；i)无菌培养皿：直径90mm；j)全自动微生物生化鉴定系统；k)无菌手术剪、镊子。3培养基和试剂3.13％氯化钠碱性蛋白胨水：见附录A中A.1。3.2硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖（TCBS）琼脂：见附录A中A.2。3.33％氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂：见附录A中A.3。3.43％氯化钠三糖铁琼脂：见附录A中A.4。3.5嗜盐性试验培养基：见附录A中A.5。3.63％氯化钠甘露醇试验培养基：见附录A中A.6。3.73％氯化钠赖氨酸脱羧酶试验培养基：见附录A中A.7。3.83％氯化钠MR-VP培养基：见附录A中A.8。3.93％氯化钠溶液：见附录A中A.9。3.10我妻氏血琼脂：见附录A中A.10。3.11氧化酶试剂：见附录A中A.11。3.12革兰氏染色液：见附录A中A.12。3.13ONPG试剂：见附录A中A.13。3.14Voges-Proskauer（V-P）试剂：见附录A中A.14。3.15弧菌显色培养基。GB4789.7—201323.16生化鉴定试剂盒。4检验程序副溶血性弧菌检验程序见图1。图1副溶血性弧菌检验程序5操作步骤5.1样品制备5.1.1非冷冻样品采集后应立即置7℃～10℃冰箱保存，尽可能及早检验；冷冻样品应在45℃以下不超过15min或在2℃～5℃不超过18h解冻。5.1.2鱼类和头足类动物取面组织、肠或鳃。贝类取全部内容物，包括贝肉和体液；甲壳类取整个动物，或者动物的中心部分，包括肠和鳃。如为带壳贝类或甲壳类，则应先在自来水中洗刷外壳并甩干表面水分，然后以无菌操作打开外壳，按上述要求取相应部分。定量定性36℃±1℃，8h～18h36℃±1℃，18h～24h36℃±1℃，18h～24h36℃±1℃，8h～18h样品25g（mL）+225mL3%氯化钠碱性蛋白胨水接种3%氯化钠碱性蛋白胨水3管，3个适宜的连续稀释度挑取可疑菌落，接种于3％氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂生化试验或选用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统结果与血清学试验、神奈川试验（选做项目）TCBS或弧菌显色培养基筛选试验氧化酶试验，革兰氏染色，3％氯化钠三糖铁琼脂，嗜盐性试验GB4789.7—201335.1.3以无菌操作取样品25g（mL），加入3%氯化钠碱性蛋白胨水225mL，用旋转刀片式均质器以8000r/min均质1min，或拍击式均质器拍击2min，制备成1:10的样品匀液。如无均质器，则将样品放入无菌乳钵，自225mL3%氯化钠碱性蛋白胨水中取少量稀释液加入无菌乳钵，样品磨碎后放入500mL无菌锥形瓶，再用少量稀释液冲洗乳钵中的残留样品1～2次，洗液放入锥形瓶，最后将剩余稀释液全部放入锥形瓶，充分振荡，制备1:10的样品匀液。5.2增菌5.2.1定性检测将5.1.3制备的1:10样品匀液于36℃±1℃培养8h～18h。5.2.2定量检测5.2.2.1用无菌吸管吸取1:10样品匀液1mL，注入含有9mL3%氯化钠碱性蛋白胨水的试管内，振摇试管混匀，制备1:100的样品匀液。5.2.2.2另取1mL无菌吸管，按5.2.2.1操作程序，依次制备10倍系列稀释样品匀液，每递增稀释一次，换用一支1mL无菌吸管。5.2.2.3根据对检样污染情况的估计，选择3个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种3支含有9mL3%氯化钠碱性蛋白胨水的试管，每管接种1mL。置36℃±1℃恒温箱内，培养8h～18h。5.3分离5.3.1对所有显示生长的增菌液，用接种环在距离液面以下1cm内沾取一环增菌液，于TCBS平板或弧菌显色培养基平板上划线分离。一支试管划线一块平板。于36℃±1℃培养18h～24h。5.3.2典型的副溶血性弧菌在TCBS上呈圆形、半透明、表面光滑的绿色菌落，用接种环轻触，有类似口香糖的质感，直径2mm～3mm。从培养箱取出TCBS平板后，应尽快（不超过1h）挑取菌落或标记要挑取的菌落。典型的副溶血性弧菌在弧菌显色培养基上的特征按照产品说明进行判定。5.4纯培养挑取3个或以上可疑菌落，划线接种3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板，36℃±1℃培养18h～24h。5.5初步鉴定5.5.1氧化酶试验：挑选纯培养的单个菌落进行氧化酶试验，副溶血性弧菌为氧化酶阳性。5.5.2涂片镜检：将可疑菌落涂片，进行革兰氏染色，镜检观察形态。副溶血性弧菌为革兰氏阴性，呈棒状、弧状、卵圆状等多形态，无芽胞，有鞭毛。5.5.3挑取纯培养的单个可疑菌落，转种3%氯化钠三糖铁琼脂斜面并穿刺底层，36℃±1℃培养24h观察结果。副溶血性弧菌在3%氯化钠三糖铁琼脂中的反应为底层变黄不变黑，无气泡，斜面颜色不变或红色加深，有动力。5.5.4嗜盐性试验：挑取纯培养的单个可疑菌落，分别接种0%、6%、8%和10%不同氯化钠浓度的胰胨水，36℃±1℃培养24h，观察液体混浊情况。副溶血性弧菌在无氯化钠和10%氯化钠的胰胨水中不生长或微弱生长，在6%氯化钠和8%氯化钠的胰胨水中生长旺盛。5.6确定鉴定GB4789.7—20134取纯培养物分别接种含3%氯化钠的甘露醇试验培养基、赖氨酸脱羧酶试验培养基、MR-VP培养基，36℃±1℃培养24h～48h后观察结果；3%氯化钠三糖铁琼脂隔夜培养物进行ONPG试验。可选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统。6血清学分型（选做项目）6.1制备接种两管3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂试管斜面，36℃±1℃培养18h～24h。用含3%氯化钠的5%甘油溶液冲洗3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂斜面培养物，获得浓厚的菌悬液。6.2K抗原的鉴定取一管6.1制备好的菌悬液，首先用多价K抗血清进行检测，出现凝集反应时再用单个的抗血清进行检测。用蜡笔在一张玻片上划出适当数量的间隔和一个对照间隔。在每个间隔内各滴加一滴菌悬液，并对应加入一滴K抗血清。在对照间隔内加一滴3%氯化钠溶液。轻微倾斜玻片，使各成分相混合，再前后倾动玻片1min。阳性凝集反应可以立即观察到。6.3O抗原的鉴定将另外一管的菌悬液转移到离心管内，121℃灭菌1h。灭菌后4000r/min离心15min，弃去上层液体，沉淀用生理盐水洗三次，每次4000r/min离心15min，最后一次离心后留少许上层液体，混匀制成菌悬液。用蜡笔将玻片划分成相等的间隔。在每个间隔内加入一滴菌悬液，将O群血清分别加一滴到间隔内，最后一个间隔加一滴生理盐水作为自凝对照。轻微倾斜玻片，使各成分相混合，再前后倾动玻片1min。阳性凝集反应可以立即观察到。如果未见到与O群血清的凝集反应，将菌悬液121℃再次高压1h后，重新检测。如果仍为阴性，则培养物的O抗原属于未知。根据表1报告血清学分型结果。表1副溶血性弧菌的抗原O群K型11，5，20，25，26，32，38，41，56，58，60，64，6923，2834，5，6，7，25，29，30，31，33，37，43，45，48，54，56，57，58，59，72，7544，8，9，10，11，12，13，34，42，49，53，55，63，67，68，73515，17，30，47，60，61，68618，46719820，21，22，39，41，70，74923，441024，711119，36，40，46，50，51，611219，52，61，6613657神奈川试验（选做项目）神奈川试验是在我妻氏琼脂上测试是否存在特定溶血素。神奈川试验阳性结果与副溶血性弧菌分离GB4789.7—20135株的致病性显著相关。用接种环将测试菌株的3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂18h培养物点种于表面干燥的我妻氏血琼脂平板。每个平板上可以环状点种几个菌。36℃±1℃培养不超过24h，并立即观察。阳性结果为菌落周围呈半透明环的β溶血。8结果与报告根据检出的可疑菌落生化性状，报告25g（mL）样品中检出副溶血性弧菌。如果进行定量检测，根据证实为副溶血性弧菌阳性的试管管数，查最可能数（MPN）检索表，报告每g（mL）副溶血性弧菌的MPN值。副溶血性弧菌菌落生化性状和与其他弧菌的鉴别情况分别见表2和表3。表2副溶血性弧菌的生化性状试验项目结果革兰氏染色镜检阴性，无芽胞氧化酶＋动力＋蔗糖－葡萄糖＋甘露醇＋分解葡萄糖产气－乳糖－硫化氢－赖氨酸脱羧酶＋V-P－ONPG－注：＋表示阳性；－表示阴性。GB4789.7—20136表3副溶血性弧菌主要性状与其他弧菌的鉴别名称氧化酶赖氨酸精氨酸鸟氨酸明胶脲酶V︱P42℃生长蔗糖D︱纤维二糖乳糖阿拉伯糖D︱甘露糖D︱甘露醇ONPG嗜盐性试验氯化钠含量%036810副溶血性弧菌V.parahaemolyticus＋＋－＋＋V－＋－V－＋＋＋－－＋＋＋－创伤弧菌V.vulnificus＋＋－＋＋－－＋－＋＋－＋V＋－＋＋－－溶藻弧菌V.alginolyticus＋＋－＋＋－＋＋＋－－－＋＋－－＋＋＋＋霍乱弧菌V.cholerae＋＋－＋＋－V＋＋－－－＋＋＋＋＋－－－拟态弧菌V.mimicus＋＋－＋＋－－＋－－－－＋＋＋＋＋－－－河弧菌V.fluvialis＋－＋－＋－－V＋＋－＋＋＋＋－＋＋V－弗氏弧菌V.furnissii＋－＋－＋－－－＋－－＋＋＋＋－＋＋＋－梅氏弧菌V.metschnikovii－＋＋－＋－＋V＋－－－＋＋＋－＋＋V－霍利斯弧菌V.hollisae＋－－－－－－nd－－－＋＋－－－＋＋－－注：＋表示阳性；－表示阴性；nd表示未试验；V表示可变。GB4789.7—20137附录A培养基与试剂A.13％氯化钠碱性蛋白胨水A.1.1成分蛋白胨10.0g氯化钠30.0g蒸馏水1000.0mLA.1.2制法将A.1.1中成分溶于蒸馏水中，校正pH至8.5±0.2，121℃高压灭菌10min。A.2硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖（TCBS）琼脂A.2.1成分蛋白胨10.0g酵母浸膏5.0g柠檬酸钠（C6H5O7Na3˙2H2O）10.0g硫代硫酸钠（Na2S2O3˙5H2O）10.0g氯化钠10.0g牛胆汁粉5.0g柠檬酸铁1.0g胆酸钠3.0g蔗糖20.0g溴麝香草酚蓝0.04g麝香草酚蓝0.04g琼脂15.0g蒸馏水1000.0mLA.2.2制法将A.2.1中成分溶于蒸馏水中，校正pH至8.6±0.2，加热煮沸至完全溶解。冷至50℃左右倾注平板备用。A.33％氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂A.3.1成分胰蛋白胨15.0g大豆蛋白胨5.0g氯化钠30.0gGB4789.7—20138琼脂15.0g蒸馏水1000.0mLA.3.2制法将A.3.1中成分溶于蒸馏水中，校正pH至7.3±0.2，121℃高压灭菌15min。A.43％氯化钠三糖铁琼脂A.4.1成分蛋白胨15.0g䏡蛋白胨5.0g牛肉膏3.0g酵母浸膏3.0g氯化钠30.0g乳糖10.0g蔗糖10.0g葡萄糖1.0g硫酸亚铁（FeSO4）0.2g苯酚红0.024g硫代硫酸钠（Na2S2O3）0.3g琼脂12.0g蒸馏水1000.0mLA.4.2制法将A.4.1中成分溶于蒸馏水中，校正pH至7.4±0.2。分装到适当容量的试管中。121℃高压灭菌15min。制成高层斜面，斜面长4cm～5cm，高层深度为2cm～3cm。A.5嗜盐性试验培养基A.5.1成分胰蛋白胨10.0g氯化钠按不同量加入蒸馏水1000.0mLA.5.2制法将A.5.1中成分溶于蒸馏水中，校正pH至7.2±0.2，共配制5瓶，每瓶100mL。每瓶分别加入不同量的氯化钠：（1）不加；（2）3g；（3）6g；（4）8g；（5）10g。分装试管，121℃高压灭菌15min。A.63％氯化钠甘露醇试验培养基A.6.1成分牛肉膏5.0gGB4789.7—20139蛋白胨10.0g氯化钠30.0g磷酸氢二钠（Na2HPO4˙12H2O）2.0g甘露醇5.0g溴麝香草酚蓝0.024g蒸馏水1000.0mLA.6.2制法将A.6.1中成分溶于蒸馏水中，校正pH至7.4±0.2，分装小试管，121℃高压灭菌10min。A.6.3试验方法从琼脂斜面上挑取培养物接种，于36℃±1℃培养不少于24h，观察结果。甘露醇阳性者培养物呈黄色，阴性者为绿色或蓝色。A.73％氯化钠赖氨酸脱羧酶试验培养基A.7.1成分蛋白胨5.0g酵母浸膏3.0g葡萄糖1.0g溴甲酚紫0.02gL-赖氨酸5.0g氯化钠30.0g蒸馏水1000.0mLA.7.2制法除赖氨酸以外的成分溶于蒸馏水中，校正pH至6.8±0.2。再按0.5％的比例加入赖氨酸，对照培养基不加赖氨酸。分装小试管，每管0.5mL，121℃高压灭菌15min。A.7.3试验方法从琼脂斜面上挑取培养物接种，于36℃±1℃培养不少于24h，观察结果。赖氨酸脱羧酶阳性者由于产碱中和葡萄糖产酸，故培养基仍应呈紫色。阴性者无碱性产物，但因葡萄糖产酸而使培养基变为黄色。对照管应为黄色。A.83％氯化钠MR-VP培养基A.8.1成分多胨7.0g葡萄糖5.0g磷酸氢二钾（K2HPO4）5.0g氯化钠30.0g蒸馏水1000.0mLGB4789.7—201310A.8.2制法将A.8.1中成分溶于蒸馏水中，校正pH至6.9±0.2，分装试管，121℃高压灭菌15min。A.93％氯化钠溶液A.9.1成分氯化钠30.0g蒸馏水1000.0mLA.9.2制法将氯化钠溶于蒸馏水中，校正pH至7.2±0.2，121℃高压灭菌15min。A.10我妻氏血琼脂A.10.1成分酵母浸膏3.0g蛋白胨10.0g氯化钠70.0g磷酸氢二钾（K2HPO4）5.0g甘露醇10.0g结晶紫0.001g琼脂15.0g蒸馏水1000.0mLA.10.2制法将A.10.1中成分溶于蒸馏水中，校正pH至8.0±0.2，加热至100℃，保持30min，冷至45℃～50℃，与50mL预先洗涤的新鲜人或兔红细胞（含抗凝血剂）混合，倾注平板。干燥平板，尽快使用。A.11氧化酶试剂A.11.1成分N,N,N',N'-四甲基对苯二胺盐酸盐1.0g蒸馏水100.0mLA.11.2制法将N,N,N',N'-四甲基对苯二胺盐酸盐溶于蒸馏水中，2℃～5℃冰箱内避光保存，在7d之内使用。A.11.3试验方法用细玻璃棒或一次性接种针挑取新鲜（24h）菌落，涂布在氧化酶试剂湿润的滤纸上。如果滤纸在10s之内呈现粉红或紫红色，即为氧化酶试验阳性。不变色为氧化酶试验阴性。A.12革兰氏染色液GB4789.7—201311A.12.1结晶紫染色液A.12.1.1成分结晶紫1.0g95％乙醇20.0mL1％草酸铵水溶液80.0mLA.12.1.2制法将结晶紫完全溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。A.12.2革兰氏碘液A.12.2.1成分碘1.0g碘化钾2.0g蒸馏水300.0mLA.12.2.2制法将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300mL。A.12.3沙黄复染液A.12.3.1成分沙黄0.25g95％乙醇10.0mL蒸馏水90.0mLA.12.3.2制法将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。A.12.4染色法A.12.4.1将涂片在酒精灯火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min，水洗。A.12.4.2滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗。A.12.4.3滴加95%乙醇脱色，约15s～30s，直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗。A.12.4.4滴加复染液，复染1min。水洗、待干、镜检。A.13ONPG试剂A.13.1缓冲液A.13.1.1成分磷酸二氢钠（NaH2PO4˙H2O）6.9g蒸馏水加至50.0mLA.13.1.2制法GB4789.7—201312将磷酸二氢钠溶于蒸馏水中，校正pH至7.0。缓冲液置2℃～5℃冰箱保存。A.13.2ONPG溶液A.13.2.1成分邻硝基酚-β-D-半乳糖苷（ONPG）0.08g蒸馏水15.0mL缓冲液5.0mLA.13.2.2制法将ONPG在37℃的蒸馏水中溶解，加入缓冲液。ONPG溶液置2℃～5℃冰箱保存。试验前，将所需用量的ONPG溶液加热至37℃。A.13.3试验方法将待检培养物接种3%氯化钠三糖铁琼脂，36℃±1℃培养18h。挑取1满环新鲜培养物接种于0.25mL3%氯化钠溶液，在通风橱中，滴加1滴甲苯，摇匀后置37℃水浴5min。加0.25mLONPG溶液，36℃±1℃培养观察24h。阳性结果呈黄色。阴性结果则24h不变色。A.14Voges-Proskauer（V-P）试剂A.14.1成分甲液α-萘酚5.0g无水乙醇100.0mL乙液氢氧化钾40.0g用蒸馏水加至100.0mLA.14.2试验方法将3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂生长物接种3%氯化钠MR-VP培养基，36℃±1℃培养48h。取1mL培养物，转放到一个试管内，加0.6mL甲液，摇动。加0.2mL乙液，摇动。加入3mg肌酸结晶，4h后观察结果。阳性结果呈现伊红的粉红色。GB4789.7—201313附录B副溶血性弧菌最可能数（MPN）检索表每g（mL）检样中副溶血性弧菌最可能数（MPN）的检索见表B.1。表B.1副溶血性弧菌最可能数（MPN）检索表阳性管数MPN95%可信限阳性管数MPN95%可信限0.100.010.001下限上限0.100.010.001下限上限000<3.0—9.5220214.5420013.00.159.6221288.7940103.00.1511222358.7940116.11.218230298.7940206.21.218231368.7940309.43.638300234.6941003.60.1718301388.71101017.21.3183026417180102113.6383104391801107.41.3203117517200111113.63831212037420120113.64231316040420121154.5423209318420130164.542321150374202009.21.43832221040430201143.642323290901,000202204.542330240421,000210153.742331460902,000211204.54233211001804,100212278.794333>1100420—注1：本表采用3个稀释度[0.1g(mL)、0.01g(mL)和0.001g(mL)]，每个稀释度接种3管。注2：表内所列检样量如改用lg(mL）、0.1g(mL)和0.01g(mL)时，表内数字应相应降低10倍；如改用0.01g(mL)、0.001g(mL)、0.0001g(mL)时，则表内数字应相应增加10倍，其余类推。