毕赤酵母表达操作手册（PDF精译版）

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物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。 两种醇氧化酶蛋白： 毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶－AOX1 及 AOX2。细胞中大多数的醇氧化酶是 AOX1 基因产物。甲醇可紧密调节、诱导 AOX1 基因的高水平表达，较典型的是占可溶性 蛋白的 30%以上。AOX1 基因已被分离，含 AOX1 启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白 的目的基因的表达。AOX2 基因与 AOX1 基因有 97%的同源性，但在甲醇中带 AOX2基因 的菌株比带 AOX1基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离 Muts菌株。 表达： AOX1 基因的表达在转录水平受调控。在甲醇中生长的细胞大约有 5%的 polyA+ RNA 来自 AOX1 基因。AOX1 基因调控分两步：抑制/去抑制机制加诱导机制。简单来说，在含 葡萄糖的培养基中，即使加入诱导物甲醇转录仍受抑制。为此，用甲醇进行优化诱导时，推 荐在甘油培养基中培养。注意即使在甘油中生长（去抑制）时，仍不足以使 AOX1 基因达 到最低水平的表达，诱导物甲醇是 AOX1基因可辨表达水平所必需的。 AOX1突变表型： 缺失 AOX1 基因，会丧失大部分的醇氧化酶活性，产生一种表型为 Muts 的突变株 （methanol utilization slow），过去称为Mut，而Muts可更精确地描述突变子的表型。结果 细胞代谢甲醇的能力下降，因而在甲醇培养基中生长缓慢。Mut+（methanol utilization plus） 指利用甲醇为唯一碳源的野生型菌株。这两种表型用来检测外源基因在毕赤酵母转化子中的 整合方式。 蛋白胞内及分泌表达： 外源蛋白可在毕赤酵母胞内表达或分泌至胞外。分泌表达需要蛋白上的信号肽序列，将 外源蛋白靶向分泌通路。几种不同的分泌信号序列已被成功应用，包括几种外源蛋白本身分 PDF created with pdfFactory trial version www.pdffactory.com 毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒 制作者：陈苗 商汉桥 泌信号序列，利用酿酒酵母 α因子前原肽信号序列也获得许多成功。 分泌表达外源蛋白的最大优点是：毕赤酵母只分泌很少的自身蛋白，加上毕赤酵母最 小生长培养基中只有少量的蛋白，这意味着分泌的外源蛋白是培养基中蛋白的主要组成成 份，也可算作蛋白纯化的第一步。注意，如果外源蛋白一级结构中有可识别的糖基化位点 （Asn-X-Ser/Thr）,则这些位点可能发生糖基化。 翻译后修饰： 与酿酒酵母相比，毕赤酵母在分泌蛋白的糖基化方面有优势，因为不会使其过糖基化。 酿酒酵母与毕赤酵母大多数为 N-连接糖基化高甘露糖型，然而毕赤酵母中蛋白转录后所增 加的寡糖链长度（平均每个支链 8-14 个甘露糖残基）比酿酒酵母中的（50-150个甘露糖残 基）短得多。 另外，酿酒酵母核心寡糖有末端 α-1,3聚糖连接头，而毕赤酵母则没有。一般认为酿酒 酵母中糖基化蛋白的 α-1,3聚糖接头与蛋白的超抗原性有关，使得这些蛋白不适于治疗应用。 虽然未经证明，但这对毕赤酵母产生的糖蛋白不构成问题，因为毕赤酵母表达蛋白与高级真 核生物糖蛋白结构相似。 选择载体用于基因多拷贝整合： 在某些情况下，毕赤酵母中重组基因多拷贝整合可增加所需蛋白的表达量。该试剂盒中 的三个载体均可用于在体内（pPIC3.5K, pPIC9K）或体外（pAO815）产生并分离多拷贝插 入，同时可检测增加重组基因的拷贝数是否增加蛋白表达量。体内整合可通过高遗传霉素抗 性，筛选可能的多拷贝插入；而体外整合可通过连接产生外源基因的串联插入。pPIC3.5K, pAO815用于胞内表达，而 pPIC9K用于分泌表达，所有载体均利用 AOX1启动子来诱导高 水平表达。 多拷贝插入频率： 毕赤酵母 His+转化子高拷贝整合事件自发发生的概率为 1－10%，体内方法可筛选可能 插入多拷贝外源基因的 His+转化子，体外方法可通过连接构建多拷贝子。当选择 His+转化子 时，它们中插入体外构建结构多聚体的概率很高。 体内多拷贝插入的产生： Ppic3.5k及 Ppic9k含有细菌 kan基因，赋予毕赤酵母遗传霉素抗性，注意 Kan并不赋 予毕赤酵母卡那霉素抗性。遗传霉素抗性水平主要依赖整合的 kan 基因的数目。单拷贝 Ppic3.5k或 Ppic9k整合入毕赤酵母基因组后，赋予毕赤酵母约 0.25mg/ml的遗传霉素抗性水 平。任何载体多拷贝整合可增加遗传霉素抗性水平，从 0.5mg/ml（1-2拷贝）到 4mg/ml（7-12 拷贝）。由于 kan基因与表达盒（pAOX1及目的基因）之间有遗传连锁，可从遗传霉素高抗 性推断该克隆所包含多拷贝目的基因数。由于基因的剂量效益，蛋白的表达可能会增加。因 此，kan基因可检测转化子是否含有多拷贝目的基因。下图显示多拷贝插入及 kan基因与表 达盒的连锁。 PDF created with pdfFactory trial version www.pdffactory.com 毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒 制作者：陈苗 商汉桥 遗传霉素直接选择： 在酵母中对遗传霉素抗性进行直接选择并不十分有效，因为新转化的细胞需要时间表达 足够量的抗性因子。由于酵母生长比细菌慢得多，大部分重组酵母在积累足够多的抗性因子 以抵抗平板上抗生素之前就已经被杀死了。最有效的筛选遗传霉素抗性及高抗性克隆的程序 需要先对 HIS＋转化子进行选择，再进行不同水平遗传霉素抗性筛选。 虽然可以用电泳进行直接筛选，但用在遗传霉素筛选之后再进行电泳筛选，获得含高拷 贝克隆的机会更大，大约可获得 5-9拷贝的克隆，而直接电泳选择只能获得平均为 1-3拷贝 的克隆。原生质转化时不能用遗传霉素直接选择。 体外多拷贝插入的产生： 下图显示如何产生多表达盒插入载体以转化毕赤酵母。目的基因插入独个 EcoRI位点 后，产生的表达盒（pAOX1及目的基因）上下游侧翼分别为独个的 BglII及 BamHI位点。 含目的基因的 pAOX815 用 BglII 及 BamHI 消化以分离表达盒，表达盒再插入 BamHI 位点以产生串联重复表达盒，重复该插入程序可产生一系列含单个 HIS4基因及逐渐增加数 目表达盒的载体。 用体外形成的多拷贝子转化毕赤酵母增加了多拷贝表达盒重组子出现的频率，可设计包 含一特定数目多拷贝插入的毕赤酵母重组子。 转化及整合： 可产生两个不同表型的 His+重组菌株：质粒 DNA 线性化位置不同，转化 GS115 后可 产生两种转化子 His+Mut+及 His+Muts。KM71只产生 His+Muts，因为该菌株为 Muts表型。 两种重组子Mut＋及 Muts都是有用的，因为一个表型可能比另一个表型更有利于蛋白表达。 理想条件下，每一个表型应该检测 6-10 个重组子。没有办法预测哪个结构或克隆更利于蛋 白表达。强烈推荐用 PCR分析重组子来证实整合情况。 成功将基因构建至 AOX1 启动子下游后，线性化质粒转化毕赤酵母时激发重组。下图 显示用不同酶消化时产生何种重组子。 限制酶 插入事件 GS115表型 KM71表型 SalI或 StuI 插入 his4 His+Mut+ His+Muts SacI 插入 5’AOX1 His+Mut+ His+Muts BglII 取代 AOX1 His+Muts His+Muts（不推荐） PDF created with pdfFactory trial version www.pdffactory.com 毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒 制作者：陈苗 商汉桥 表达及扩大培养： 用 PCR证实毕赤酵母重组后，可检测 His+Mut+及 His+Muts的表达。小规模培养每个 重组子，用甲醇诱导，检测时间点.如果是胞内表达，每个时间点细胞沉淀用 SDS-PAGE 分 析;如果是分泌表达，分析每个时间点的细胞及上清。如果有蛋白的抗体，推荐既用考马斯 亮蓝染色又用 western blot分析 SDS-PAGE凝胶。如果可以,建议检测蛋白活性。因为并不是 所有蛋白都能达到 g/l的水平，所以建议进行 western blot或活性分析，不要仅做 SDS-PAGE 考马斯亮蓝染色分析。 如何选择最佳的表达蛋白毕赤酵母菌株及优化诱导见 P49-50。如表达已达最优，大规 模表达以产生更多蛋白。 PDF created with pdfFactory trial version www.pdffactory.com 毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒 制作者：陈苗 商汉桥 方法 毕赤菌株表型： 毕赤酵母菌 GS115及 KM71在组氨酸脱氢酶位点（His4）有突变,因而不能合成组氨酸， 所有表达质粒都有 HIS4基因可与宿主进行互补，通过不含组氨酸的培养基来选择转化子。 GS115及 KM71自发回复突变到 His＋原养生物机率小于 1/108。 KM71的亲本菌在精氨酸琥珀酸裂解酶基因（arg4）有突变，在不含精氨酸的培养基中 不能生长。用野生型 ARG4基因破坏 AOX1基因后，产生 KM71 MutsArg+His-菌株。 GS115及 KM71都可在复合培养基如 YPD（YEPD）及含组氨酸的最小培养基中生长。 转化之前，GS115及 KM71都不能在最小培养基中生长，因为它们是 His-。 KM71结构： ARG4基因（约 2kb）插入到克隆的野生型 AOX1基因的 BamHI(AOX1基因 15/16密码 子)及 SalI(AOX1基因 227/228密码子)位点。ARG4取代了 AOX1基因 16－227密码子。此 结构转化至 KM71亲本菌（arg4his4）中,分离 Arg+转化子并分析 Muts表型。Arg+转化子遗 传分析显示野生型 AOX1被 aox1::ARG4结构所取代。 重点： 用 KM71的优点是，不需要在甲醇最小培养基中筛选Mut表型。所有转化子都是 Muts 表型。第二，AOX1位点没有被完全缺失，理论上可用你的目的结构通过基因取代方法替换 aox1::ARG4结构，这样重组菌株的表型是 His+MutsArg-，这意味着重组菌株生长时需精氨 酸。不幸的是，仅添加精氨酸并不能完全缓和 arg4 突变的影响，arg4 菌株在含精氨酸的最 小培养基中不能很好地生长。因此不推荐在 KM71 中通过取代 aox1::ARG4 结构来获得 His ＋转化子。 菌株表达对照： GS115/His+Muts 白蛋白：该菌株为筛选毕赤酵母分泌表达转化子与Muts表型时的对 照。血清白蛋白基因及其自身分泌信号被整合进毕赤酵母 AOX1 位点。该菌株可分泌白蛋 白（67kDa）到培养基中，分泌水平＞1g/l。 GS115/His+Mut+ β－半乳糖苷酶：该菌株为筛选毕赤酵母转化子胞内表达与 Mut+表 型时的对照。β－半乳糖苷酶（lacZ）基因被整合进毕赤酵母 his4 位点，该菌株表达 β－半 乳糖苷酶（117 kDa），达到通过 SDS-PAGE考马斯亮蓝染色或 ONPG分析可测水平。 毕赤酵母菌株生长： 毕赤酵母生长温度为 28-30度（液体、平板、斜面）。在 32度以上诱导生长时，对蛋白 表达有害，甚至会导致细胞死亡。 另外注意点有： 1在 YPD中，处于对数期的 Mut+、Muts毕赤酵母倍增时间为 2小时 2除了在甲醇中生长速度不同外，Mut+、Muts生长速度没有差别 3甲醇培养基（MM）中，处于对数期的 Mut+倍增时间为 4-6小时 4甲醇培养基（MM）中，处于对数期的 Muts倍增时间为 18小时 51OD600=5×107细胞/ml 注意：生长特性依重组菌株不同而不同 PDF created with pdfFactory trial version www.pdffactory.com 毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒 制作者：陈苗 商汉桥 在甲醇中生长： 当使用甲醇平板或培养基培养时，建议每天添加甲醇以补偿甲醇挥发及消耗。 1平板培养时，在倒置平板盖中加入 100ul 100%甲醇 2液体培养时，加入 100%甲醇至终浓度为 0.5% 3 部分研究者在进行液体培养时，对 Muts菌株每天加甲醇至浓度为 1%，对 Mut+菌株 每天加甲醇至浓度为 3%时，对液体培养没有不良影响。 贮存：贮存细胞几周或几月，用 YPD培养基或 YPD琼脂斜面 1挑取所需菌株单克隆在 YPD平板上划线生长 2挑取单克隆转移至 YPD进行穿刺培养，30度 2天 3细胞在 4度可放几周 几月或几年，存于－80度 1挑取所需菌株单克隆在 YPD中过夜培养 2收集细胞，在含 15%甘油的 YPD中悬浮至终 OD600为 50-100（大约 2.5-5.0×109细 胞/ml） 3细胞先用液氮或干冰/酒精浴中冰冻再贮存于-80度。 注意：在 4度或－80度长期保存后，用之前建议在MM、MD或MGY平板上划线培养 以检测 His+转化子的表型是否正确及其活力。 大肠杆菌菌株： 大肠杆菌菌株表型：提供 E.coli Top10F’以防没有合适的 E.coli菌株。其它合适的菌株 为 DH5αF’，JM109或其它重组缺失菌株（recA），最好是 endA，及带有选择性的 F’附加体。 Top10F’适用于重组及单链拯救。 如果不需进行单链 DNA拯救，也可用不含 F’附加体的大肠杆菌菌株。 建议：建议冻存 Top10F’ 1在 5ml含 50－100mg/ml四环素的 LB中培养 Top10F’过夜 2取 0.85ml培养液加 0.15ml灭菌甘油完全混匀 3转入冻存瓶中，冻在液氮或干冰/酒精浴中 4存于－80度 选择毕赤酵母表达载体： 选择载体：如果目的蛋白是细胞溶质型且是无糖基化蛋白，可选择胞内表达蛋白。如果 目的蛋白是正常分泌、糖基化蛋白或直接分泌至胞内细胞器内，可尝试分泌表达目的蛋白。 建议用体内及体外方法产生并分离外源基因多拷贝插入子。无法预测哪种方法适用于你 的蛋白，每种方法的优缺点如下： 体外方法 pAO815 优点 缺点 可构建特定数目的多拷贝子 克隆特定数目多拷贝子需要更多工作 大多数 His＋转化子含有正确的特定数 目插入 载体可能会很大，与基因大小及插入拷 贝数有关 筛选多插入子很容易，因为大部分 His ＋转化子含有多拷贝目的基因 在 E.coli中可能会发生重排 体外构建可以分析拷贝数对蛋白表达的 影响 多拷贝插入位于单一位点 载体上无需另外的药物抗性标记 PDF created with pdfFactory trial version www.pdffactory.com 毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒 制作者：陈苗 商汉桥 体外方法 Ppic3.5k或 Ppic9k 优点 缺点 开始实验比较容易，转化毕赤酵母前载 体中只需克隆单拷贝基因 定量筛选－遗传霉素抗性并不一定与基 因拷贝数相关 1-10%的 His＋转化子有自发的多拷贝插 入 筛选 His＋转化子需要做很多工作，因为 要从成千上万个 His＋转化子中才能筛选到 足够多的遗传霉素抗性克隆进行检测 载体平均大小与其它毕赤酵母表达系统 相似 多拷贝插入的数目不知（尽管可用 southern 或 dot blot分析方法进行检测） 多拷贝插入位于单一位点 遗传霉素筛选对细胞密度敏感，可能会 分离到假阳性 特点：下表显示毕赤酵母多拷贝表达载体的一般特点及优点： 特点 描述 优点 5‘AOX1 含 AOX1启动子的约 1000bp片 段 毕赤酵母中可实现甲醇诱导的高 水平表达 α-factor 信号序列 编码 α因子信号序列的 269bp， 用于毕赤酵母分泌表达（只能用于 Ppic9k） 分泌所需蛋白至培养基中 MCS 多克隆位点 在表达载体中插入目的基因 TT AOX1 基因自带的转录终止及 polyA信号（约 260bp） mRNA 有效的转录终止及多聚腺 苷酸化 HIS4 毕赤酵母野生型基因编码组氨 酸脱氢酶（约 2.4kb），用于与毕赤酵 母 his4菌株进行互补 为选择毕赤酵母重组菌株提供选 择标记 3‘AOX1 AOX1基因序列，在 TT3‘远端 序列（约 650bp） 质粒靶向整合进 AOX1基因 Amp pBR322 复制起点 Amp抗性基因 E.coli复制起始 用于选择、复制及维护 E.coli BamHI BglII NotI SacI SalI StuI 单一酶切位点 （StuI在 Ppic3.5k或 Ppic9k中不 是唯一的） 可线性化载体，使有效插入毕赤 酵母基因组产生Mut+或 Muts重组子 Kan 来自 Tn903的卡那抗性基因，赋 予 E.coli卡那基因抗性，赋予毕赤酵 母遗传霉素抗性（Ppic3.5k或 Ppic9k） 通过增加的抗遗传霉素抗性，可 在体内筛选多拷贝插入子 在大肠杆菌中筛选 Kan抗性菌株 在该试剂盒中，任何毕赤酵母表达载体都没有酵母复制起始位点。只有当质粒与毕赤酵 母基因组发生重组时，才能分离到 HIS＋转化子。 Ppic9k：含卡那基因，体内筛选多拷贝子插入，分泌重组蛋白至培养基中。在 GS115 及 KM71中有功能。 PDF created with pdfFactory trial version www.pdffactory.com 毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒 制作者：陈苗 商汉桥 1 9276bp融合载体 2 在 α-factor 分泌信号阅读框中含有用于克隆的 4 个单限制酶位点。SnaBI、EcoRI、 AvrII、NotI 3 α-factor分泌信号分泌表达目的蛋白。表达时，目的基因必须克隆进信号序列起始密 码的读码框中 毕赤酵母 HIS4筛选 GS115或 KM71，在 AOX1基因处插入，用 SacI线性化（对于 GS115产生 His+Mut+， 对于 KM71产生 His+Muts） 在HIS4位点插入，用SalI线性化（对于GS115产生His+Mut+，对于KM71产生His+Muts） 在 GS115菌株中，替换 AOX1基因，用 BglII线性化（产生 His+Muts） 克隆进毕赤酵母多拷贝表达载体： 介绍：下面列出用这些载体进行克隆策略时应考虑的方针。考虑位点，如用 Ppic9k 载 体，应考虑将目的基因克隆进 α-factor信号序列读码框中。 建议将 3个超螺旋毕赤酵母表达载体转化 E.coli，以便长期保存。 1用灭菌水或 TE缓冲液稀释 1ul质粒（1ug/ul）至 10-100pg/ul 2取 1-2ul稀释质粒转化感受态 E.coli，在含 50-100 ug/mlAmp的 LB平板上选择 一般考虑：下面是应用 pAO815、 Ppic3.5k或 Ppic9k时的一般考虑 1毕赤酵母的密码偏爱与酿酒酵母相同，已证明许多酿酒酵母中基因在毕赤酵母中有交 叉功能 2应在含 recA, endA突变的 E.coli菌株如 Top10F’中构建质粒 3AOX1mRNA的 5‘末端在各多克隆位点都已标注出。如需分析 RNA，可计算插入基 因 mRNA的大小 4插入基因的终止密码子或 3‘AOX1序列可使翻译有效终止，3‘AOX1序列终止密码 已标注出 PDF created with pdfFactory trial version www.pdffactory.com 毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒 制作者：陈苗 商汉桥 5 在毕赤酵母及其它真核系统中均发现了“AT 富含区”导致的转录提前终止。如果表 达蛋白时出现问题，应检查是否是提前终止及 AT富含区。如要表达基因则需改变基因序列。 6Ppic9k中预测的蛋白酶裂解位点如图（p28）所示 7插入成熟基因的开放阅读框，应克隆进 α-factor信号序列读码框的下游 一般克隆策略： 1连接适合的限制性片段 A直接插入MCS上两个不同位点 B利用相同的限制性末端，将片段连入单个合适位点 2PCR扩增插入基因以产生合适的用于连入合适载体的限制性末端 3扩增含目的基因片段通过 TA克隆盒进行直接克隆，再将合适的片段亚克隆进所选择 载体 克隆程序： 注意：如果你要插入 pAO815上 EcoRI位点，而基因中也含有 EcoRI位点，我们建议： 1BsaI可识别以下的限制性识别位点： 5‘GGTCTCN/ 3‘CCAGAGNNNNN/ 2将 EcoRI位点改造成 BsaI可识别位点 5‘GGTCTCG/AATTC…… 3‘CCAGAGCTTAA/G…… 3将该序列通过 PCR整合进 DNA片段中，或在体外制造其它限制性位点的适配子接头 4用 BsaI消化 PCR产物或适配连接产物，这样不用 EcoRI消化就可产生 EcoRI的限制 性末端。 信号序列加工：Ppic9k中 α-factor成熟信号序列加工分两步： 1KEX2基因产物初步切割信号序列，在 Glu-lys-arg*glu-ala-glu-ala中星号位置即 arg及 glu之间出现 Kex2断裂 2STE13基因产物接着切割 Glu-Ala重复序列 优化信号切割：酿酒酵母中，Glu-Ala 重复序列并不是 Kex2 切割时的必需序列，但 Glu-Ala重复序列可使该切割更有效。 Glu-Lys-Arg-X-序列中，在 X位置上有许多氨基酸都可替代 Glu，如芳香族氨基酸，小 氨基酸及组氨酸。但脯氨酸会抑制 Kex2的切割。 许多情况下，Stel13 切割 Glu-Ala 重复片段效率不高，Glu-Ala 重复序列就留在了表达 的目的蛋白的 N端，这一般与目的蛋白本身性质有关。 细菌转化：一旦确定克隆策略，在进行连接反应前应制备好 E.coli感受态，可参考电感 受态或化学感受态 E.coli方法或使用本实验室实验程序。 Ppic9k的 pAOX1及MCS: 特殊考虑： 1目的片段必须克隆进分泌信号序列开放阅读框中 2信号序列中含 ATG，翻译从离 mRNA5‘端最近的一个 ATG开始 3 如果插入片段中有 BglII 位点，毕赤酵母转化时，可选取其它限制性位点来线性化质 粒(P30) PDF created with pdfFactory trial version www.pdffactory.com 毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒 制作者：陈苗 商汉桥 转化 E.coli： 介绍：连接反应之后，要通过化学或电转的方法转化 E.coli感受态细胞(Top10F’或相似 菌株) 转化分析： 1转化后，将转化混合物涂在含 50-100ug/ul Amp的 LB平板上，选择 Amp抗性克隆 2挑取 10个 Amp抗性转化子，接种含 50-100ug/ul Amp的培养基，37度振荡培养过夜 3小量制备分离质粒 DNA用于分析及测序。pAO815或 pPIC3.5k测序时，用 5‘AOX1 及 3‘AOX1测序引物；pPIC9k测序时，用 α-factor 引物及 3’AOX1测序引物。将引物重悬 于 20ul灭菌水中，制成 0.1ug/ul溶液。 4 在 0.85ml过夜培养菌液中加入 0.15ml 灭菌甘油，以便保存所需克隆，涡旋混匀转入 标记好的储存管中。在液氮或干冰/酒精浴中冷冻后移入-70度保存。 5测序证实结构正确后，可准备转化 DNA 重组克隆测序：强烈建议转化毕赤酵母前进行测序 1正确读码框(分泌表达) 2真核翻译起始所需的 ATG正确的上下文 PDF created with pdfFactory trial version www.pdffactory.com 毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒 制作者：陈苗 商汉桥 克隆基因后：克隆进 pAO815后，需在体外构建多插入子 如果克隆进 Ppic3.5k或 Ppic9k，可准备将质粒 DNA转入毕赤酵母。转 p28 准备转化 DNA：你应该已经获得正确插入目的基因的毕赤酵母表达载体质粒，以用于 表达。下表列出下阶段应做的实验。 步骤 实验 页数 1 准备转化用 DNA 28-30 2 GS115或 KM71用于制备去壁细胞 31-34 3 DNA转化 GS115或 KM71 35-36 4 选择 His+转化子 35 5 如果将基因克隆进 Ppic3.5k或 Ppic9k，筛选 His+转 化子的遗传霉素抗性 37-40 6 证实重组菌的Mut+Muts表型 41-43 7 PCR鉴定基因是否存在 70-71 8 检测基因表达 44-48 建议同时分离 His+Mut+及 His+Muts毕赤酵母转化子，因为很难预测哪种结构更利于蛋 白表达。通过线性化 DNA 5‘AOX1区或 HIS4基因及使用 GS115（Mut+） 或 KM71（Muts） 菌株，可方便地分离到 Mut+及 Muts重组子。每次转化时使用约 10ug线性化 DNA。 质粒 DNA准备：用于毕赤酵母转化的质粒 DNA起码纯到可以做酶切，DNA越纯，转 化效率越高。建议用 S.N.A.P MiniPrep Kit来准备质粒 DNA用于常规毕赤酵母转化，质粒 DNA也可通过碱裂解、酚：氯仿抽提及乙醇沉淀来获得。 线性化质粒 DNA：建议使用下列方法线性化载体以获得 Mut+及 Muts重组子，可能其 中一个会比另一个更利于表达多拷贝重组子。如果只想得到 Muts重组子，使用 KM71菌株。 单个十字交换事件可比双重十字交换更容易、更有效地获得 Muts重组菌（例如：插入 AOX1 或 his4而不是取代 AOX1）。如果插入片段含有下列任何限制性位点，见 p29-30以替换位点。 1如果克隆进 Ppic3.5k，线性化时， 插入 AOX1用 SacI(GS115, Mut+ 或 KM71, Muts) 插入 HIS4用 SalI(GS115, Mut+ 或 KM71, Muts) 2如果克隆进 pAO815，线性化时， 插入 HIS4用 SalI或 StuI（GS115, Mut+ 或 KM71, Muts） 注意如果用 pAO815载体，插入 2个或更多拷贝子会产生 SacI酶切位点 3如果克隆进 Ppic9k，线性化时， 插入 AOX1用 SacI(GS115, Mut+ 或 KM71, Muts) 插入 HIS4用 SalI(GS115, Mut+ 或 KM71, Muts) 程序： 1酶切新构建载体及亲本载体。将亲本载体转入 GS115或 KM71用作表达的背景对照 2凝胶分析酶切产物以确定是否酶切完全。如酶切不完全，转化数及靶向效率都会降低 3用酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）抽提酶切产物，乙醇沉淀 DNA，用 10-20ulTE缓 冲液重悬。不需要将目的基因片段从线性化质粒中分离纯化出来。 4贮存于-20度直至转化 替换酶切位点：下表列出线性化载体转化毕赤酵母时的可替换酶切位点。 注意 Ppic9k中 Kan基因中含 StuI位点，而 HIS4上的 StuI位点则被去除。 PDF created with pdfFactory trial version www.pdffactory.com 毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒 制作者：陈苗 商汉桥 对照：建议转化毕赤酵母时用以下对照： 1 亲代载体与重组载体以相同方式进行酶切，可在用 PCR 证实整合时作对照，还有表 达分析及定量 dot blot或 southern分析时作为背景对照。 2 含有单拷贝目的表达盒的 pAO815、Ppic3.5k 及 Ppic9k。以与多拷贝子同样方式线性 化 pAO815载体。 大多数通过转化重组 Ppic3.5k或 Ppic9k而得到的 His+重组子只含有单拷贝插入。确保 你挑取的转化子只能抗 0.25mg/ml 遗传霉素。pAO815、Ppic3.5k及 Ppic9k单拷贝对照应与 正检测的假定多拷贝重组子具有相同的 Mut 表型。这些单拷贝重组子可作为与多拷贝子进 行表达比较的参照，也可作为定量 dot blot及 southern分析时的参照。这是非常重要的参数， 因为目的基因拷贝数的增加并不一定会增加重组蛋白的表达量。 培养毕赤酵母用于制作原生质细胞： 介绍：一般，对大多数的研究者来说，原生质细胞及电转是效率最高的转化方法（103-104 转化子/ugDNA）。毕赤酵母同样可用 PEG1000（P68）或 LiCl（P69）进行转化。这两种方 法，特别是 LiCl 方法不如原生质法及电转化方法。如果没有电转化装置，建议使用原生质 细胞法或 PEG1000法。毕赤酵母的转化效率不如酿酒酵母的转化效率高。 原生质细胞的解释：毕赤酵母细胞壁阻止摄入 DNA，有必要去除部分细胞壁以吸收 DNA。藤黄节杆菌酶是一种葡聚糖酶，可在细胞壁水解葡聚糖的 β－1,3 接头，还可部分地 消化细胞壁。该方法的关键在于不能过度消化细胞壁，否则会导致细胞死亡。藤黄节杆菌酶 消化能力受细胞对 SDS敏感性的影响。等量细胞加入 SDS，以产生原生质细胞，该步的结 果是溶液变澄清，其澄清度可由 800nm处的吸光值获得。 一般经验，获得 70%原生质细胞时，消化程度较好。用等渗溶液清洗细胞除去酶并与 DNA共孵育。将细胞重悬于山梨醇溶液中，细胞壁再生后再铺板。 准备：制备下列溶液，存于 4度。 YPD（Yeast Extract Peptone Dextrose）培养基 1L YPD平板 1L RDB（Regeneration Dextrose Base） 平板 1L RDHB（Regeneration Dextrose Histidine Base） 平板 1L 转化当天，配制下列试剂：存于 4度 5% SDS溶液 PDF created with pdfFactory trial version www.pdffactory.com 毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒 制作者：陈苗 商汉桥 RD（Regeneration Dextrose） 融化琼脂 100ml 溶液：细胞去壁及转化试剂 1M 山梨醇 SE: 1M 山梨醇, 25mM EDTA pH8.0 DTT: 用水配制成 1M浓度 SCE： 1M 山梨醇, 1mM EDTA , 10mM 柠檬酸钠缓冲液 pH5.8 CaS: 1M 山梨醇, 10mM Tris-HCl pH7.5, 10mM CaCl2 藤黄节杆菌酶：用水配制成 3mg/ml的浓度 40%PEG：用水配制 40%（w/v）PEG3350(试剂纯) CaT: 20mM Tris pH7.5, 20mM CaCl2 SOS: 1M山梨醇, 0.3×YPD, 10mM CaCl2 每次转化时配制： SED：19mlSE加 1ml 1M DTT PEG/CaT: 1:1混合 40%PEG及 CaT 程序： 1在 YPD平板上划线培养 GS115或 KM71,28－30度培养 2天，以得到分散的单克隆。 2 在 50ml离心管或 100ml摇瓶中，从 GS115 或 KM71 平板上挑取单个克隆接种 10ml YPD，28－30度剧烈振荡（250-300rpm）过夜。该培养基可在 4度保存数天。 3 在 3 个 500ml培养瓶中加入 200mlYPD，分别取 5、10 及 20ul第 2 步中的细胞，于 28-30度剧烈振荡（250-300rpm）过夜 4第二天早上，将试剂盒中的转化溶液（SE，SCE，灭菌水，SOS，PEG，CaS,1M山梨 醇），RDB平板（用于转化）、RDHB平板（活力对照），放置于室温下。 5测每个培养瓶中的 OD600值 6收集 OD600值为 0.2-0.3瓶中的细胞，室温，1500g离心 5-10min。去除上清，接下去 准备细胞去壁 注意：如果培养基都超过 0.3，选择一个培养基，用新鲜培养基以 1：4稀释，28-30度 孵育直至 OD600值至 0.2-0.3（2-4小时）。收集细胞如第 6步 准备细胞去壁：取得上述第 6步细胞 1取 100ml融化的 RD琼脂糖，存于 45度 2解冻 1管 1M DTT 3为该次去壁细胞试验准备新鲜的 SED 无菌条件下，将 19mlSE转入合适的灭菌容器中（如 50ml离心管），加 1ml 1M DTT 混合均匀，为得到最好的效果，SED现配现用 注意：DTT 的质量及新鲜度是成功制备去壁细胞的关键，1M DTT 分析纯，-20 度保 存。 洗涤细胞： 1用 20ml灭菌水悬浮洗涤细胞，转入灭菌的 50ml的离心管中 2室温 1500g 离心 5min，收集细胞 3将细胞重悬于 20ml新鲜的 SED中洗涤，如 2离心 4用 20ml 1M 山梨醇洗涤，离心如 2 PDF created with pdfFactory trial version www.pdffactory.com 毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒 制作者：陈苗 商汉桥 5用 20ml SCE缓冲液重悬细胞，将悬液分至两个 50 ml离心管中(10ml/管) 6取 1管藤黄节杆菌酶置于冰上，轻弹管壁以混匀，藤黄节杆菌酶以浆液的形式存在， 无需配成溶液，将它混匀以确保每次的量是相等的。 加入藤黄节杆菌酶：可先取一管细胞来确定用藤黄节杆菌酶消化细胞的最佳时间，一旦 确定时间，取另一管细胞进行裂解。藤黄节杆菌酶消化细胞壁，使细胞变脆，拿样品时要轻 柔些，加入藤黄节杆菌酶后，即开始消化细胞壁。 *准备至少 20ml 5%SDS溶液 *将分光光度计调至 800nm处，用 800ul 5%SDS及 200ul SCE作空白 *准备 10 个灭菌离心管，编号 0，2，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，40， 45，50 1取 5步中一管细胞，取出 200ul加入标 0的管中，置于冰上，此即 0点 2加 7.5ul藤黄节杆菌酶到该管剩余细胞中，轻轻颠倒混匀，30度孵育，不要晃动样品。 该样品可用于建立细胞去壁最佳时间表。将另一管细胞置于室温，用于第六步。将剩余藤黄 节杆菌酶放于冰上。 3监测去壁细胞的形成：2min时，取 200ul步骤 2中的悬浮细胞，加入标 2的管中。在 t=4,5,6,,,50min时，重复上述操作，读样品 OD800值 4用公式确定每个时间点时去壁细胞的形成比例： %去壁率=100-［(时间 t时 OD800值/时间 0时 OD800值)×100］ 如 t=0时，OD800=0.256， t=15时，OD800=0.032 计算：%去壁率=100-［(0.032/0.256)×100］=100-［(0.125)×100］=100-12.5=87.5% 5 确定去壁率为 70%时的时间，藤黄节杆菌酶的用量不同，最佳时间也各不相同。 Invitrogen 实验室的最佳去壁时间为 15-40min。 注意：确定获得所需量去壁细胞的最小时间很重要，藤黄节杆菌酶消化时间过长，对细 胞有害，效率会降低。 6 在另一管中加入 7.5ul藤黄节杆菌酶(如步骤 1)，将管放于 30 度，时间为步骤 5中建 立的最佳时间，以获得最佳比例 70%的去壁细胞。 7室温 750g离心 10min，收集去壁细胞，去除悬浮液 8用 1M山梨醇洗去壁细胞 1次(轻叩管壁以分散去壁细胞团，不要涡旋)。如上离心 9用 10ml CaS洗涤去壁细胞，如 7中离心，用 0.6mlCaS重悬细胞。去壁细胞必须立即 (至多 30min)用于转化。不能放更长时间，这些细胞共可作 6次转化 转化毕赤酵母： 开始前：将 RDB 平板放于室温，准备好融化的 RD 上层琼脂，取出线性化 DNA 置于 冰上 GS115中，用 SalI,StuI或 SacI线性化的 DNA可分离 His+Mut+重组子 KM71中，用 SalI,StuI或 SacI线性化的 DNA可分离 His+Muts重组子 亲代载体用相同酶线性化 对照包括无 DNA，线性化 PBR322DNA及质粒(无细胞)涂板来检测是否有污染 程序： 1取上述 9中 100ul去壁细胞到 1.5 ml灭菌的有盖管中 2取 10ugDNA，室温孵育 10min 3同时配制 PEG/CaT溶液，计算所需用量，加入等量的 40%PEG/CaT(1:1) 4加 1ml新鲜的 PEG/CaT溶液至细胞与 DNA混合物中，轻轻混匀，室温孵育 10min PDF created with pdfFactory trial version www.pdffactory.com 毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒 制作者：陈苗 商汉桥 5 室温 750g 离心 10min，小心抽吸 PEG/CaT 溶液，颠倒管，轻叩管壁以排出多余的 PEG/CaT溶液。 6用 150ulSOS培养基悬浮转化细胞，室温孵育 20min 7加入 850ul1M山梨醇，接下来涂板 涂板：毕赤酵母去壁细胞需要铺在顶层琼脂糖或琼脂上，以防止在选择前被裂解 1接第 7步，取 100-300ul去壁细胞-DNA，与 10ml融化的 RD琼脂糖混匀倒于 RDB平 板上，直至上层琼脂变硬。注意，确保有足够的去壁细胞-DNA铺第二板，第三板 2倒置平板，28-30度孵育，转化子会在 4-6天内出现 3细胞活性：用 100ul去壁细胞加入 900ul 1M山梨醇 4取稀释 100ul，加入 10ml融化的 RDH，铺在 RDHB平板上，等上层琼脂凝固 5倒置平板，28-30度孵育，4-6天出现克隆，表明去壁细胞可再生成分裂细胞 His+转化子分析：如用 Ppic3.5k及 Ppic9k构建载体转化毕赤酵母，接着做体内筛选多 插入子 如用 pAO815构建载体转化毕赤酵母，筛选Mut+及 Muts转化子 评价转化试验：使用去壁细胞，一般转化效率为 103-104His+转化/ugDNA，在无 DNA、 线性化 PBR322及只有质粒(无细胞)平板上应均无克隆。 功能分析筛选：有些研究者通过功能分析直接检测高表达毕赤酵母重组克隆，而不进行 Mut+及 Muts表型筛选。检测完高表达后，最好也检测 Mut表型，这可帮助你优化重组克隆 的表达。 体内筛选多插入子： 介绍：His+转化子越多越好，因为只有 1-10%His+转化子可能含有多拷贝插入。这意味 着，如果多拷贝插入概率为 1%，你必须筛选 1000个克隆，才能得到 10个高遗传霉素抗性 克隆，这需要 1-5个含 His+转化子的平板。筛选数以千计的克隆并不罕见。如果有抗高遗传 霉素抗性的克隆，可检测重组蛋白的表达(P44)，或者检测 Mut表型(P41)。 筛选遗传霉素抗性转化子方法： 一、技术上简单，可筛选大量克隆，但不那么可信。筛选 HIS+转化子后，将它们集中 起来，铺在遗传霉素浓度逐渐升高的 YPD平板上，可应用于去壁细胞及电转化方法。 二、技术上较难，只可筛选少量克隆，但更可信。每个克隆在微量测定板上生长至浓度 一致，将培养基点到 YPD-遗传霉素平板上计算抗遗传霉素抗性。 注意：用遗传霉素筛选可能会有假阳性。划线挑取假定的抗遗传霉素单克隆，然后在 YPD-遗传霉素平板上进行证实很重要。如果你真的选择复制平板，一定要证实遗传霉素抗 性。 开始前：准备 10个 YPD平板，每个的遗传霉素浓度为 0，0.25，0.5，0.75，1.0，1.5， 1.75，2.0，3.0及 4.0mg/ml。 (去壁细胞)方法 1：从含 HIS+转化子的平板开始 1用灭菌刮片将含有 HIS+转化子的顶层琼脂最上层刮下，放入无菌的 50ml离心管中。 2加入 10-20ml灭菌水，量应为琼脂的两倍，剧烈振荡 1-2min 3将离心管置于管架上，让琼脂沉淀(1min) 4 用血球计数计确定上清中细胞浓度。至少要 5×105细胞/ml，那样在 200ul 或更少溶 液中可含 105 个细胞。(如果太稀，可将液体转入另一管中，离心细胞，再用适量灭菌水重 悬至 5×105细胞/ml) 5每块含遗传霉素的 YPD平板涂 105细胞。每个浓度用四块板。 PDF created with pdfFactory trial version www.pdffactory.com 毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒 制作者：陈苗 商汉桥 (需要证实在没有遗传霉素的 YPD板上细胞的滴度，计算每个遗传霉素抗性平板上抗遗 传霉素克隆的比例，以确定你所得到的多拷贝子是否占平板上转化子的 1-10%，将收集的转 化子稀释到 10-5，10-6，10-7浓度，每板加 100-200ul) 6 在 30 度孵育平板，每天检查。抗遗传霉素克隆需 2-5 天出现，不含遗传霉素的 YPD 平板上克隆需 2-3天出现。接下来做结果分析。P39 (电转化)方法 1：电转化毕赤酵母时用以下程序。转化子不需要铺在上层琼脂。从含 HIS+ 转化子平板开始。 1吸取 1-2ml灭菌水于所有 HIS+转化子平板上 2用灭菌刮子重悬 HIS+转化子，不要划破琼脂 3将细胞悬液集中转移至灭菌的 50ml离心管中，稍涡旋(5-10S) 4用分光光度计测定浓度(1OD600=5×107细胞/ml) 注意：混有琼脂会干扰读数 5在每块含有遗传霉素的 YPD平板上涂 105细胞。 (需要证实在没有遗传霉素的 YPD板上细胞的滴度，计算每个遗传霉素抗性平板上抗遗 传霉素克隆的比例，以确定你所得到的多拷贝子是否占平板上转化子的 1-10%，将收集的转 化子稀释到 10-5，10-6，10-7浓度，每板加 100-200ul) 6 在 30 度孵育平板，每天检查。抗遗传霉素克隆需 2-5 天出现，不含遗传霉素的 YPD 平板上克隆需 2-3天出现。接下来做结果分析。P39 注意：如果在以上方法里你将所有细胞都悬浮，加 15%灭菌甘油，存于-80度，可在以 后时间里做遗传霉素抗性筛选。 方法 2：需要三组各两块微量测定板(共 6块)来筛选 180个 HIS+重组子。通过持续接种， 得到相同浓度的克隆子，以确保遗传霉素平板上细胞数相等。如将转化子铺于顶层琼脂中， 有必要从琼脂上收集细胞，重新涂最小组氨酸平板(P42)以收集克隆。记住要有菌株背景对 照及单拷贝基因对照。每 180个克隆，可选择出 1-10个抗遗传霉素克隆。 1无菌条件下，在每个微量测定板上加入 200ul YPD 2用灭菌牙签在第一组平板中每孔接种单个 HIS+转化子，轻轻搅动以悬浮细胞 3盖住微量测定板在 30度孵育 2天(不需摇动) 4 2天后，取新的微量测定板，加入 190ulYPD 5用多道移液器吸取 10ul培养液于第二组测定板中，确保第二组板标记好并放置好，这 样可指示细胞所在孔。 6盖住第二组板，30度孵育过夜 7第二天，在第三组测定板上重复第 5,6步 注意：持续生长及传代可使克隆达到相同细胞浓度 8孵育后，取第三组板，用 100ul多道移液器上下吹打重新悬浮细胞 9取 10ul每孔中液体点在含遗传霉素浓度为 0，0.25，0.5……4.0mg/ml的 YPD平板上。 用多道移液器或在平板底下划线，确保以规则方式排列。 10待液体吸收，将板放于 30度，2，3，4，5天后检测抗遗传霉素克隆，接着分析结果。 结果分析：可能只有少数的抗遗传霉素克隆，大小可能也不一样，但克隆形态上应一致。 挑取抗遗传霉素克隆，划线培养纯化，挑取单克隆，确保记录抗遗传霉素的水平。 可能在 2.0，3.0，4.0mg/ml遗传霉素平板上找不到克隆，因为抗如此高遗传霉素的“头 彩”克隆很少见。需要筛选数以千计的 HIS+转化子以分离抗 2-4mg/ml遗传霉素的克隆。 因为不能保证多拷贝克隆会确实增加蛋白表达量，许多人选择直接表达来看是否有克隆 PDF created with p