养老服务常见风险因素及防控措施

组织裂解液和细胞裂解液如何配制?一、细胞裂解液配制一一、试剂准备1、新鲜配制冷的RIPA裂解缓冲液:150mMNaCL1%NP-40(去垢剂)0.1%SDS(去垢剂)2ug/mlAprotinin(蛋白酶抑制剂)(使用前加入)2ug/mlLeupeptin(蛋白酶抑制剂)(使用前加入)1mMPMSF(蛋白酶抑制剂)1.5mMEDTA(蛋白酶抑制剂)1mMNaVanadate(磷酸脂酶抑制剂)(任选)以上所有试剂均按比例溶于150mMNaCL溶液中。2、冷的PBS中加入1mMPMSF1.5mMEDTA1mMNaVanadate（钒酸钠）(任选)3、对数期生长状态佳的细胞，75cm至少3-4瓶（90%以上生长面积）。二、实验步骤1、将长满细胞的培养瓶放置在冰上，用吸液管吸出培养液。加入足够的冷的PBS在培养瓶中充分洗涤细胞表面，以洗去瓶中残留的培养基，倒掉PBS，重复以上操作2-3遍。在最后一次洗涤中尽可能吸干残留的PBS，尽量在冰上操作。2、向培养瓶中加入冷的RIPA裂解缓冲液(每75cm2培养瓶加1ml).然后用细胞刮子沿着瓶壁开始刮细胞，如果所需要刮的同种细胞有多瓶，则将第一瓶刮下的细胞液吸出转入下一瓶中继续刮(由于处理后的细胞裂解液较粘稠，所以宜用直径大点的吸液管吸取)。3、吸出刮好的细胞裂解液置于14ml离心管中（置于冰上），然后重复步骤2以刮取剩下的细胞。4、尽可能将多的细胞裂解液收集到14ml的离心管中，样品插入冰盒进行超声，超声强度以不产生泡沫为准，超声每次2-3秒，重复3-4次。如仍有细胞碎片或沉淀，应离心10000rpm,10分钟，留取上清。5、取出小量细胞裂解液测其蛋白浓度（用BioradBradford试剂盒或紫外分光光度计，在A280测定），分装保存在-70℃。4方法二NP-40orTriton-1001%TrisHCl(pH8.0)50mmol/LNaCl150mmol/LPMSF（苯甲基磺酰氟）0.1mmol/L(100µg/ml)Pepstatin(胃蛋白酶抑制剂)1µmol/L(0.7µg/ml)Leupeptin（亮抑制肽）0.5mg/mlAprotinin（抑蛋白酶肽）0.3µmol/L(1µg/ml)（注：PMSF贮存液：100mmol/L即17.4mg/ml于异丙醇中；Aprotinin贮存液：10mg/ml溶于0.01mol/LHEPES(pH8.0);Leupeptin贮存液：10mg/ml溶于水中；Pepstatin贮存液10mg/ml于甲醇液中.均于-20℃保存）裂解操作程序：*离心收集1×107个细胞*加入4℃预冷1%NP-40裂解液100µl*剧烈震荡使细胞充分悬浮混匀（如为组织进行匀浆）*4℃放置15~30min*4℃离心，15000rpm,10min，取上清备用。 方法三细胞裂解液的主要目的：1.利用去污剂破坏脂质双分子层，破裂细胞；2.溶解蛋白；3.蛋白变性使其稳定；4.抑制蛋白酶活性推荐RIPAbuffer:.50mMTris-HClpH7.4缓冲体系·150mMNaCl等渗体系·1mMPMSF强大的蛋白酶抑制剂·1mMEDTA变性剂和稳定剂·5µg/mlAprotinin（抑肽酶）蛋白酶抑制剂·5µg/mlLeupeptin蛋白酶抑制剂·1%Tritonx-100破坏细胞·1%Sodiumdeoxycholate中度变性剂和蛋白溶解剂 细胞裂解液的主要目的：1.利用去污剂破坏脂质双分子层，破裂细胞；2.溶解蛋白；3.蛋白变性使其稳定；4.抑制蛋白酶活性推荐RIPAbuffer:.50mMTris-HClpH7.4缓冲体系·150mMNaCl等渗体系·1mMPMSF强大的蛋白酶抑制剂·1mMEDTA变性剂和稳定剂·5µg/mlAprotinin蛋白酶抑制剂·5µg/mlLeupeptin蛋白酶抑制剂·1%Tritonx-100破坏细胞·1%Sodiumdeoxycholate中度变性剂和蛋白溶解剂·0.1%SDS强变性剂和蛋白溶解剂其中PMSF等蛋白酶抑制剂最好另外配制，－20℃保存，用前混合。蛋白酶抑制剂较贵，如果你的经费有限，可以仅用PMSF试一试，能出结果就可以。用于普通的Western、IP或co-IP，我们推荐使用Western及IP细胞裂解液(P0013)，该裂解液已被国内各大研究机构广泛使用，用户普遍反映很好。裂解细胞或组织后，没有非常粘滞的透明状DNA团块形成，不必采用超声处理等就可以非常理想地用于后续操作。另外该裂解液裂解的产物也适合用于磷酸化蛋白的Western检测。对于某些特殊蛋白的IP，如果发现Western及IP细胞裂解液(P0013)效果不是非常理想，可以尝试用RIPA裂解液(强、中或弱)或NP-40裂解液。如果发现IP的时候背景很高，即非特异的蛋白也被IP下来，则需要选用裂解强度较高的裂解液，例如RIPA裂解液(强或中)。如果发现目的蛋白无法被IP下来，则说明裂解液的强度过强，可以使用较为温和的裂解液例如RIPA裂解液(弱)或NP-40裂解液。对于某些难溶解蛋白的Western，如果发现Western及IP细胞裂解液效果不是非常理想，可以尝试使用裂解强度更高的裂解液,例如RIPA裂解液(强、中)或SDS裂解液。RIPA裂解体系：150mmoL/LNacl，1.0%NP-40或Triton-x-100，0.5%脱氧胆酸钠，0.1%SDS，50mmoL/LTris(ph8.0)。一、组织裂解液配制组织裂解液：`7M     Urea(60.06)   4.2042g2M     thiourea(76.12) 1.5224 g100mM DTT          0.1543 g4%     CHAPS       0.4    g0.5mM  EDTA        0.00146g40Mm   Tris         0.0485 g2%(v/v)  NP-40       0.2   ml1%(v/v)  TritonX-100  0.1   ml5mM PMSF用前加    0.00871g2%pharmalyte          0.2ml共10ml分装成400µl/每管（可应用于30-80毫克组织裂解）注：已配好分装成400µl/每管可供应用不需另配！！！细胞裂解液配方：6M     Urea(60.06)   1.8018 g2M    thiourea(76.12) 0.7613 g65mM  DTT         0.050   g4%     CHAPS      0.2     g40Mm   Trisbase    0.02425  g共5ml分装成200µl/每管（可应用于50-100ml培养瓶内的细胞裂解） 细胞裂解液：     组织裂解液配方：7mol/L尿素、         7M     Urea(60.06)    4.2042g                                                         2mol/L硫脲、          2M     thiourea(76.12) 1.5224 g2%NP-40、            2%(v/v)  NP-40       0.2   ml1%TritonX-100、       1%(v/v)  TritonX-100  0.1   ml65mmol/LDTT、 0.1003g 100mM DTT          0.1543 g5mmol/LPMSF、        5mM PMSF用前加   0.00871g4%CHAPS、            4%     CHAPS       0.4    g40mmol/LTris、         40Mm   Tris         0.0485 g2%pharmalyte（pH3-10）、2%pharmalyte          0.2ml                         0.5mM  EDTA       0.00146 g25mg/LDNaseI、7mg/LRNaseA、20mg/Laprotinin、20mg/Lleupeptin、2mmol/LNa3VO4、PhosphataseInhibitorCocktail1PhosphataseInhibitorCocktail21ml水化液配方：8M    Urea(60.06)   0.48048g2%     CHAPS      0.02  g痕量溴酚兰           0.4   µl1%的痕量溴酚兰（10mg+1000µl双蒸水）450µl水化液加DTT0.00135mgor400µl水化液加DTT0.00126mg  各种细胞裂解液的功用都分别是什么，SDS，NP-40，TritonX-100有何作用SDS，NP-40，TritonX-100这三种去垢剂的作用是不同的，或者说作用力量强弱不同。SDS属于离子型去垢剂，最厉害，基本可以把细胞完全破掉，DNA会释放出来，裂解液变得很粘稠。NP-40是很温和的去垢剂，1%浓度的基本可以破坏掉胞膜，而对核膜破坏的作用弱，结合特定的buffer可以获得胞浆蛋白。TritonX-100的能力介于NP40和SDS之间，偏向于NP40，也是常用的细胞裂解液成分之一，在保护蛋白活性方面有一定作用（SDS基本会使蛋白变性失活）。但是去垢剂属性只是一方面，buffer、配比、浓度、提取方法和材料处理也都是关键因素，建议参考《分子克隆》来做。