【doc】葡萄糖氧化酶尿糖试纸的研制
葡萄糖氧化酶尿糖试纸的研制 第H掌
第3期
青岛化工学院
Jour.all洳自血0I龇I把Camni~1c?咀嘟
v血.14N3
l993
葡萄糖氧化酶尿糖试纸的研制
-?一曲蕊
硼工幕)
.
R易/t/
摘要介鳝j葡萄糖氧化酶尿糖试航的制奋,反应最佳条件及有关特 性.
关键词堕煎蕉垫垡堕墨堕苎苎
O引言
尿糖测定是临床中常用的一个项目,以往多采用班氏(a~edieO尿葡萄糖检验法(即铜
还原法)测定尿中葡萄糖,该法特异性差,易造成慢性糖尿.近年来,在国外(美,日,蒋)用葡
萄糖氧化酶试纸(尿糖试纸)测定尿中葡萄糖,应用较普遍[】?.70年代起,国内开始研村,但
由于质量不稳定,未投入批量生产.我们研制的尿糖试纸具有特异性强,快速,准确,灵敏度
高,简便,价廉等优点.
1实验部分
l,l主要原料.
葡萄糖氧化酶(GOD)}过氧化物酶(POD)}聚乙烯吡咯烷酮(mrp){吐温80;亮兰(FCF);
新华1号滤纸.
l.2实验步骤
1.2.1配制浸渍液
(1)海藻酸钠溶液称取海藻酸钠5g,加蒸馏水100ml于沸水格中溶解成胶状,并维 持在40'C水浴中.
(2)明胶溶液;称取明破4g,加蒸馏水60mi,于沸水浴中溶解成胶状,并维持在40? 水浴中.
(3)l吐温80溶液;吸取国产吐温80液1删,加入蒸馏水99mi. (4)pH5.5枸椽酸缓冲液:称取枸椽酸6g,枸撵酸钠]88,加蒸馏水60mi,加热溶解. (5)酶溶液:称取葡萄糖氧化酶2E(1.4u/n~),过氧化物酶10mg(RZ=2.12),加蒸水 少许混匀.再加入钼酸铺64rag,碘化钾960n~,然后用蒸馏水加至19ml. 取100gml烧杯一只,加入海藻酸钠溶液40ml,1吐温80溶液10ml,以及上述配制的
全部明胶溶液,pH5.5枸橼酸缓冲液,酶溶液,碘化钾,聚乙烯毗咯烷酮,亮兰,每加一种搭液
应充分混匀.
收稿日期tl993—03—30
青岛化工学盹牵挂
1.2+2浸纸
将上述浸渍液倒入稽瓷盘内,浸泡新华定性1号滤纸,用玻璃棒将多余的溶液刮去,放
在dO?鼓风烘箱中干燥30分钟.干后为淡兰色试纸,剪成小方块,用白胶贴到塑料条(骨
架)上,放到棕色瓶中密闭保存.
1.3
色板的绘制
1.3.1配制标准液
(1)配制25葡萄糖溶液
(2)用正常人尿液配制各种浓度的尿糖溶液(见表1),再置冰箱d?,过2d一48小时 使用.
表l不同浓度屎糖溶蔽配射
(3)任意选择临床迭验尿糖标本5个,经用班氏试剂试验结果为(一),(+)(++), (+++),(++++).
1.3.2制各色板
用制成的试纸以尿糖标准溶液及选就的阳性尿糖标本进行试测,观察其颜色是否分辨
明显.如果分辨明显,即可参照后调制色板.
1.4试纸鉴定
(1)用新制备的尿糖试纸,试测用上述方法配制和选择的各种尿糖标本与原标准色板
及判断时间对照,若符合则产品合格,若不符合,则根据新试纸的色阶重画色板咖. (2)检查试纸的外观和显色是否均匀.
2结果与讨论
2.1原理
葡萄糖氧化酶尿糖试纸反应原理是连续的酶反应.试纸用于测定屎液中葡萄糖含量,
内含有葡萄糖氧化酶(OOD)和过氧化物酶(POD),以及显色系统.当试纸与糖尿接触时,试
纸中的葡萄糖连续进行下列反应:
葡萄糖+0z二=;葡萄糖酸+HO2
p0D
H202+21一+21-I+——.I:+21-120
Iz+聚乙烯吡咯烷酮—一棕色沉淀
先由葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸及过氧化氢,再由过氧化物酶僵化过氧
化氢与碘化钾显色反应,产生潞离碘与聚乙烯毗咯烷酮络合物产生棕色,由于兰色
背景物质
亮兰的存在,葡萄糖含量不同,试纸由淡兰色(阴性)变绿色到棕色. 2.2反应适宜的pH值的确定
由于酶反应受介质pH的影响,酶活性最高的pH值时称为最佳PH值. 5
l
第3期葡萄糖氧记酶詹糖试最的研{If
用枸橼酸和枸橼酸钠配成不同pH的缓冲液(pH=5.0,7.0),用这些缓冲液分别配制
测定试剂,用2g/dj葡萄糖标准液,按上述方法分别用不同的pH的试剂测定,在35"C恒温条
件下,于浓度比色计上测定反应变化.实验结果说明:
(1)随着pH的增加,显色反应达到稳定所需时闻逐步缩短.pH5.0--5.0范围内,1分 钟反应可达到平衡.pH6.2--6.5范围内0.5分钟反应可达到平衡.pH7.0范围内几秒钟可
达到平衡.
(2)在pH4.8时反应显色灵敏度整,以pH5.0起随pH的增高灵敏度有所增高,pH5.5 显色灵敏度高,pH5.2显色灵敏度略有降低,pH7.0更低.
(3)显色稳定性,在pH6.0时反应较快达到平衡,但显色稳定性差,反应至l0分钟 时,即出现退色.pH5.2--5.8显色稳定.因此综上考虑,我们选用pH5.2—5.8之间的最佳
反应条件.
2.3GOD和POD用量的选择
在pH5.2--5.8,枸橼酸缓冲液条件下,将GOD和POD分别以不同的用量进行组合. GOD用量为2—6单位/iml,POD为3一10单位/州.其余试剂同原试剂配制条件.亦以2S/
dI葡萄糖标准液,按上述方法,用不同组合试剂分别测定.实验证明:当GOD为5单位/ml
和POD为8单位/州用量时,已满足反应要求.再增大GOD和POD用量,并不能加快反应
速度和显色灵敏度.减少二种酶的用量将使反应平衡显色时间延长.用量过少,对显色灵敏
度下降,因此,最后确定用量为GOD5单位/ml,POD为8单位/ml. 2.4显色系统的选择
在反复实验的过程中,发现显色系统的确定对试纸的质量也起着重要作用.据国外资料
报道,有机显色系统不够稳定,而目前国际上普遍采用的是无机和有机显色荆的复合反应为
显色系统.
分别用盐酸邻联甲苯胺溶液和游离碘与聚乙烯吡咯烷酮作显色剂,并进行比较(见表
2)
表2两种显色荆比较
由表可见,游离碘与聚乙烯吡咯烷酮络合产生棕色的显色系统,达到满意效果.其显色
的色阶变化范围大,由淡兰一绿一黄一浅棕一红棕色变化.色阶明显,颜色档次清楚,容易辨
别,而且在规定的时间内显色后,能保留较长一段时间不变(约半小时). 2.5本试纸检刮对葡萄糖专一性的观察
收集了5种糖,都配成2g/d1浓度,然后各种糖分别用盐酸邻联甲苯胺试剂和本试剂测
青岛化工学院l{善
定.结果见表3.
表3GOD--POD试剂和盐酸邻联甲
名称l兰壁竺壁!苎壁望.!竺二竺望
葡萄糖22.——
l相当于葡萄糖量吕/m
乳糖
果糖
蔗糖
麦芽糖
凰李糖
5l
0.24
0.1
1
0.09
上述结果明显地说明,GOD--POD试剂对葡萄糖测定的专一性,其它糖的存在都不产
生干扰.相比之下盐酸邻联甲苯胺试剂对所有的糖都有反应.因此,GOD--POD试剂在特异
性上,优于盐酸邻联甲苯胺试剂.
3试纸使用方法
取试纸一条浸入欲测定尿液中,湿透(约1秒种)取出.停1分钟,与标准色板表对照,即
能得出测定结果.
表{标准色板表
4结论
葡萄糖氧化酶尿糖试纸质量稳定.具有采用国产原料的特点,显色梯度明显,颜色档次
清楚,容易辨别,显色稳定时问长,携带使用方便,在避光,避热,避潮的条件下,保存期较长,
该产品的研制成功填补了省内空白与国内同类产品相比,接近国际先进水平. 参考文献
FreeAH?H~LUyB扭iI|d抽|叫b.埘P!辑龇.CRCP士鼬,Flur~.UsA,1975
晰曲mJKelsl,Di8b阳蛐龃_崛usL~gapuarttttatlveurine曲嫩m曲衄,Dia~tes1978I盯t810
未庭敏和l王如.尿定性试验纸N一于于少I检讨.临床检查机器.试药,1984,7:25 伊藤机一,小紫喜代子-田表见丢尿检查J(尿Uy)_血aI1蚰n一咖目r1981}目469 ResearchandI?aIluractureofGlucoseTbtpaper ofGhlc0seOxideEnzyme
QIIRui
(DepartmentofchemicalEngine)
AhstraciIn恤paper,theprepa_~l:ion,thereactionop~numcondi~onsandthereb删good qualitiesofanewgIucoseten.perofm.oseoxideofaleintroduced.
KeyWoodsgIuc08eomdeofenzyme}gIu.0?协stler