雨生红球藻培养

雨生红球藻培养 [摘要]虾青素(astaxanthin)具有抗氧化、抗癌变、增强免疫等功能,可用作抗癌变预防治疗剂、抗衰老剂、饲料添加剂、食品和化妆品的着色剂,是一种具有很大发展前途的新资源性天然产物。雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)是天然虾青素的重要来源，但是，雨生红球藻的养殖与保存相对来说比较困难，所以一直是不少科研人员的研究对象。试验首先在最适生长条件下培养雨生红球藻的运动细胞，使游动细胞的细胞密度变的尽可能的高，培养条件为:光照强度1000~1500 lx;光照周期24 h;光质为LED白光;温度为室温10?1 ?;通空气;初始pH?7.0。然后改变培养基的成分，探讨单因素条件对虾青素积累量的影响，实验条件:光照强度15000~20000 lx;光照周期24 h;光质为LED白光;温度为室温17?1?;不通气;初始pH?7.0。最终的结果明，在氮饥的饿情况下虾青素百分含量为3.465%和3.484%，磷饥饿情况下虾青素百分含量为1.414%和1.435%，盐胁迫环境下虾青素百分含量为0.738%和0.650%，说明氮元素的缺乏比磷元素的缺乏和盐胁迫，更有利于雨生红球藻积累虾青素。 [关键词]虾青素;氮饥饿;磷饥饿;盐胁迫 I Abstract: Astaxanthin has antioxidant, anticancer and function of enhancing immune. It can be used as anti-cancer prevention and treatment agent, anti-aging agent, feed additive and coloring agents of food and cosmetic. So it is a kind of promising “new resources of food”. With the rapid development of medicine industry, food industry and aquaculture, the demand for Astaxanthin will must grow. In the experiment, the green movement cells of Haematococcus pluvialis were cultivated under optimal growth conditions in order to obtain maximum biomass. The conditions of culture were as following: light intensity was 1000~1500 lx; light cycle was 24 h; light quality was white; temperature was 10?1? and pH was about 7.0. Then the components of culture medium were changed for investigation on the effect of single factor on astaxanthin accumulation. The final results show that in the same external conditions, the lack of nitrogen was more conducive than those of phosphorus and salt stress to the accumulation of astaxanthin in Haematococcus pluvialis. ey word: Astaxanthin, Nitrogen starvation, Phosphorus starvation, Salt stress. K II 目 录 1 前 言 ............................................................ - 1 - 1.1 雨生红球藻 ..................................................... - 1 - 1.1.1 雨生红球藻形态及分类学特点 ................................ - 1 - 1.1.2雨生红球藻生活周期 ......................................... - 1 - 1.1.3雨生红球藻培养 ............................................. - 2 - 1.1.4外界环境对雨生红球藻生长的影响 ............................. - 2 - 1.2虾青素 .......................................................... - 2 - 1.2.1虾青素的化学特征及来源 ..................................... - 2 - 1.2.2雨生红球藻细胞内虾青素合成及积累 ........................... - 3 - 1.2.3外界环境对虾青素合成的影响 ................................. - 4 - 1.2.4虾青素的生理功能及实际应用 ................................. - 4 - 2 试验材料与 .................................................... - 6 - 2.1 主要试验材料 ................................................... - 6 - 2.1.1 藻种 ...................................................... - 6 - 2.1.2 主要试验试剂 .............................................. - 6 - 2.1.3主要试验仪器与设备 ......................................... - 6 - 2.2试验方法 ........................................................ - 7 - 2.2.1雨生红球藻的培养 ........................................... - 7 - 2.2.2雨生红球藻的生长检测 ....................................... - 7 - 2.2.3虾青素的积累 ............................................... - 7 - 7 - 2.2.4虾青素含量的检测 ........................................... -3 试验内容 .......................................................... - 8 - 3.1 雨生红球藻的培养 ............................................... - 8 - 3.1.1 培养基的配置 .............................................. - 8 - 3.1.2 试验材料的灭菌 ............................................ - 8 - 3.1.3接种 ....................................................... - 9 - 3.1.4培养 ....................................................... - 9 - 3.1.5生长检测 .................................................. - 10 - 3.2诱导虾青素 ..................................................... - 11 - 3.3 虾青素含量的测定.............................................. - 12 - 4 结果与讨论 ....................................................... - 13 - 结 论 ............................................................. - 18 - 参考文献 ........................................................... - 19 - 致 谢 ................................................. 错误～未定义书签。 III 1 前 言 1.1 雨生红球藻 1.1.1 雨生红球藻形态及分类学特点 雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)在分类上属于绿藻门(Chlorophata)、绿藻纲(Chlorophyceae)、团藻目(Volvocales)、红球藻科(Haem matococcaceae)、红球藻属 [1] (Haematococcus，Ag) 。雨生红球藻细胞的形状大多数呈现为广卵形，宽度约为19 μm ~51 μm，长度约为28 μm ~63 μm。雨生红球藻是单细胞藻类，用孢子或合子进行生殖，内外细胞壁层的主要成分分别是是纤维素和果胶质，自由游动的雨生红球藻细胞大多含有2条鞭毛，含有多个不规则的散布在原生质体内的伸缩泡。由于游动的雨生红球藻细胞内用于进行光合作用的色素成份含有叶绿素a、叶绿素b、叶黄素和类胡萝卜素，因此细胞呈绿色。 由于雨生红球藻的快速分裂生长和虾青素的大量累积不同步，使得很多学者在研究雨生红球藻时观念的表述不清楚，造成了一定程度的混乱。Elliot、Lee以及刘建国等先后对雨生红球藻的细胞形态和生活周期进行了系统的研究，对雨生红球藻研究文献中出现的一些混乱观念进行了改正，将雨生红球藻的细胞形态描述为四种: (1) 游动细胞(motile cell)，指游动阶段除游动孢子以外的细胞形式，细胞呈卵形或椭圆形。 (2) 动孢子 (zoospore)，可以由游动细胞和不动孢子在适宜条件下经过无性繁殖产生。繁殖过程中，由细胞壁演化成的孢子囊膨胀变大，从顶端逐步破裂释放出能自由游动的子细胞。这些从在母细胞内产生起到释放出孢子囊为止的具有游动能力的子细胞称为游动孢子。 (3) 静细胞 (non- motile cell)，指不运动阶段除不动孢子以外的细胞形态，在名称上与游动阶段的游动细胞相呼应 (4) 静孢子 (aplanospore)，不动阶段细胞表面上不游动呈静止状态，但是细胞不一定处于静止的休眠状态。实际上，该阶段细胞仍能进行分裂增殖，在母细胞内产生没有鞭毛，发育至冲破细胞壁释放后也不能游动的子细胞。这种由不动细胞经过无性 [2]生殖方式产生，到从孢子囊内释放时期的子细胞称为不动孢子 。 1.1.2雨生红球藻生活周期 [3]刘建国等 经过自己的观察和结合前人研究成果后认为，雨生红球藻的生活周期主要如下: 环境适宜时，游动细胞以有丝分裂的方式进行无性繁殖，多数母细胞产生2-4个子细胞。无论母细胞内有2个或是4个子细胞，都能观察到鞭毛的存在并能够自由游动，属游动孢子，释放出的子细胞游动孢子成为新的游动细胞;不动细胞发育为孢子母细胞和孢子囊，最终孢子从膨大的孢子囊壁中释放出来成为带有鞭毛的游动孢子并残留下透明外壳。环境不适时，游动细胞或者刚释放的游动孢子褪去鞭毛，直接转入不动细胞阶段。 - 1 - 1.1.3雨生红球藻培养 虽然室外大池培养螺旋藻(Spirulina)和小球藻(Chlorella)已经获得成功，但因雨生 [4]红球藻生长缓慢，容易被其他藻类如小球藻(Chlorella)、原生动物等污染 ，因此有 人采用封闭玻璃管道培养雨生红球藻。该方法虽然克服了微生物污染的问题，但是培 养成本相对提高了。工业培养雨生红球藻多采用气升式反应器，培养藻类多用 光照培养箱，将培养箱架上的日光灯作为光源，通过日光灯的数目和光照持续的时间 对光照强度和周期进行控制。 1.1.4外界环境对雨生红球藻生长的影响 (1) 光照 光照是雨生红球藻生长的重要因素，最适宜雨生红球藻生长的光照强度数值大约 为30μE/(??s)，高过50μE/(??s)的光照会使分裂中的细胞由营养型转为休眠状态。虽 然在黑暗条件下细胞能利用有机碳源(如葡萄糖和醋酸盐)进行生长，但生长速率明显低于有光的情况。在30μE/(??s)的光照条件下，持续光照与12 h光暗交替没有显著的 差异，但在大于50μE/(??s)的光照条件下持续光照会显著抑制雨生红球藻的生长在小 于20μE/(??s)的光照条件下持续光照反而有利于细胞的生长。光质方面红光比蓝光对 [5]雨生红球藻的生长更为有利 。 (2) 温度 ~28?，当温度高于30 ?时雨生红 最适于雨生红球藻光合自养生长的温度为25? 球藻的生长会受到抑制。但是较高的温度(如30 ?)有利于雨生红球藻利用有机碳源进 [1]行混合培养，这可能是较高温度影响雨生红球藻异养生长所需的酶活性的缘故 。 (3) pH 雨生红球藻最适生长的pH为中性至微碱性(pH 7-8)，虽然有研究显示在强碱的环 境下红球藻仍然可以生长，但生长速率很低。 (4) 溶解氧 关于溶解氧对雨生红球藻生长的影响研究较少，目前认为较低的溶解氧(如50%饱 和度)有利于雨生红球藻的自养生长，而饱和的溶解氧则有利于雨生红球藻进行异养生 [6]长 。 (5) 碳源及氮源 不同科学家对雨生红球藻氮源的需要持不同的意见。大部分的学者认为当硝酸铵 作为雨生红球藻的氮源时，首先被消耗利用的是铵离子，硝酸根离子只有在铵离子消 [7]耗完之后才会被利用 。Borowitzka等认为最好的氮源是质量浓度为0.5~1.0 g/L的 硝酸盐。醋酸盐是比较好的用于雨生红球藻混合培养的碳源，醋酸盐除了有利于雨生 [8]红球藻的生长外，也很容易被雨生红球藻吸收参与虾青素的合成 。 1.2虾青素 1.2.1虾青素的化学特征及来源 虾青素(astaxanthin ，ASTA)的化学系统名(IUPAC)为3,3′-二羟基-β,β′-胡萝卜素-4,4 ′-二酮，分子式是CHO，相对分子质量是596.86。纯的虾青素颜色是暗红棕色，呈 40524 粉末状，不溶于水，能溶于大多数的有机溶剂。虾青素的化学结构是由四个异戊二烯 - 2 - 单位以共轭双键型式联结，两端又有两个异戊二烯单位组成六节环结构。虾青素含有 一个长的共轭不饱和双键系统，光、热、氧化物很容易破坏它的结构。从生物体内提 取虾青素的过程中，酶的作用也会破坏虾青素的这种结构。虾青素有三种不同的旋光 异构体(见图1)，(A)是雨生红球藻生物合成的虾青素异构体，(B)是酵母菌合成的虾青 [9]素异构体，(C)则是人工合成的虾青素异构体 。 图1 虾青素的三种异构体 Fig 1 The three isomers of astaxanthin 虾青素的生产主要有人工合成和生物获得两种方法。世界上化学合成的首要生产 厂商是瑞士的F.Hoffmann-LaRoche 公司。该公司生产的商品名为“Carophyll Pink”的反 [10]式虾青素，是现在市场上三文鱼饲料添加着色剂的重要来源 。 生物获得可以从甲壳类动物、微藻、真菌等生命体中提取。甲壳类动物的甲壳中 含虾青素，但含有量很低，而且甲壳中灰分和几丁质的含量相对较高，限制了虾青素 的提取和再利用;雨生红球藻细胞内，虾青素含量很高，超过细胞干重的2%，被认为 [11] 是最具发展前景的虾青素天然来源 ;真菌中应用最广的是红法夫酵母(Phaffia rhodozyma)，1976年，Andrewes和Phaff等人在红法夫酵母中首次发现了虾青素，在 此之后，许多公司在对红法夫酵母的研究上作了不少的努力，并获得了一定的进展[12] ;细菌中已知乳酸分支杆菌(Mycobacterium lacticoda)和短杆菌(Bevibacterium)能产 虾青素，其中乳酸分支杆菌只在烃类培养基上产生虾青素，短杆菌(Bevibacterium)在石 油里生长，考虑到烃类发酵的不利之处和其较低的产量以及红法夫酵母的可用性，未 [1,12]来上述2种细菌在虾青素生产上的利用看来是没有希望的 。 1.2.2雨生红球藻细胞内虾青素合成及积累 虾青素在雨生红球藻细胞内合成和积累的位置是影响其产量的重要因素。Sprey认为次生类胡萝卜素像初生类胡萝卜素一样也在叶绿体中形成，并且参与光合作用。 但Santos和Mesquita通过电镜观察，发现虾青素不是在细胞器而是在内质网外面的透 [1]明质内形成的 。 在雨生红球藻最适生长环境下，藻细胞内的色素主要是叶绿素a、叶绿素b、β- 胡萝卜素和叶黄素，这时细胞呈绿色卵圆形，细胞的生长速率很高。当环境条件不适 宜雨生红球藻的分裂增值时，其光合速率和光合作用产物利用速度不平衡，导致碳水 [13]化合物的累积，脂肪酸和类胡萝卜素特别是虾青素的快速累积 。这时的雨生红球 藻细胞变大，细胞壁变厚，细胞颜色也由绿色转变成红色。相关资料显示，任何引起雨生红球藻细胞生长速率降低的因素都可以成为虾青素积累的因素。 - 3 - 1.2.3外界环境对虾青素合成的影响 (1) 光照 大部分的学者认为光照度对雨生红球藻的生长特别是虾青素的生物合成是必须的，也有人认为虾青素可以在黑暗条件下合成，只是光照条件下的合成速率比黑暗条 件下高7倍。大于50μE/(??s)的光照强度利于虾青素的合成，蓝色光质最有利于虾青 素的积累。 (2) 温度 温度对雨生红球藻虾青素的生物合成的影响与光照条件很相似，前面也提到过， 当温度高于30 ?时虾青素会快速积累但细胞生长受抑制，因此较高温度适用于雨生红球藻培养后期。 (3) 营养元素 氮饥饿、磷饥饿以及氮饥饿与高光强相结合可显著促进细胞内虾青素的合成，并 可在人工控制下通过培养基配方的优化而保持高积累量。在盐胁迫条件下，例如0.8 % [13][14] NaCl或高浓度的NaAc 也可导致虾青素的积累，陆开形和蒋霞敏 等利用NaN3 诱导雨生红球藻并发现浓度为1 mmol/L NaN处理有利于促进藻细胞的生长，而其他3 浓度处理则对藻生长起抑制作用;但不同浓度处理都有利于促进虾青素的积累，其中又以1 mmol/L NaN处理后的虾青素含量最高。 3 1.2.4虾青素的生理功能及实际应用 (1) 着色作用 虾青素是类胡萝卜素合成的终点，它进入动物体后可以不经生物转化而直接累积 [15,16]在组织中，并可与肌动蛋白非特异性结合 。它的着色效果在家禽蛋黄、体色上及水产动物上显示出优越性，例如JOHNSON等发现虾青素对鹌鹑蛋黄的着色效果显 [17]著好于万寿菊 。虾青素的着色作用是它被最早被开发出来的应用价值，因此目前为止虾青素最广泛的应用主要用作三文鱼饲料添加剂。科学研究显示，素虾青素作为 [1,18]三文鱼的着色剂明显优于其他色素，能更有效地被三文鱼积累 。 (2) 抗氧化作用 虾青素的抗氧化功能高于其他类胡萝卜素，能有能抑制生物膜被氧化的作用。Di [19]等 研究了多种类胡萝卜素猝灭分子氧的能力，发现猝灭分子氧的能力为虾青素,α-胡萝卜素,β-胡萝卜素,黄质,黄体素,胆红素,胆绿素。虾青素的强抗氧化活性还表现在解除光诱导的胁迫，可作为潜在的光保护剂用于阻止皮肤的光老化。 [20]Cornnor等 人分析了虾青素、胡萝卜素等保护小鼠肾纤维细胞免受UVA诱导产生 的氧化压力的能力，结果显示虾青素保护机体免受UVA光诱导的氧化效果最佳。 (3) 抗癌作用 [21]免疫学研究显示，类胡萝卜素具有缩小肿瘤等抗癌功效。Gradelet等 的研究发现虾青素、β-胡萝卜素在降低肝癌细胞的数目和大小方面效果明显，而番茄红素没 [22]有效。Kozuki等 对虾青素等8种类胡萝卜素抑制老鼠腹水肝细胞瘤发病的活性进 [23]行了研究，证明这些类胡萝卜素可以减少肝细胞瘤的发作。Tnaka等 研究了虾青素对由一种亚硝胺所引起的雄性ICR老鼠的膀胱癌和由一种硝基喹啉氧化物所引起的 - 4 - 雄性F344老鼠的口腔癌的化学预防作用后发现，虾青素可以作为潜在的化学预防剂， 有效预防膀胱癌和口腔癌的发生。 (4) 增强免疫作用 虾青素还能显著的促进淋巴结抗体特别是T细胞相关抗原抗体的产生 。Jyonoychi [24]等 人的研究结果表明虾青素能增强T细胞刺激人体血细胞免疫球蛋白的产生，可有效防止视网膜的氧化和感光器细胞的损伤，据此可以将虾青素作为治疗眼科疾病的 [25]药物。Jyonouchi等 人的研究结果显示了虾青素能提高人体免疫球蛋白的产生。对 于养殖的水产品、家畜禽等，虾青素在防治疾病方面有与对人类相似的功用，所以， 如果喂以含有一定浓度虾青素的饲料后，会提高它们的抗病能力。 (5) 保护心血管健康作用 类胡萝卜素对以各种脂蛋白形式存在的胆固醇含量有明显影响，对心血管系统有显著的保护效果。目前认为导致动脉粥样化的低密度脂蛋白的含量与高血压、心绞痛、 心肌梗塞等心血管系统疾病的盛行有正面相关性，高密度脂蛋白的含量和心血管健康 之间存在反面相关性。研究报道当在老鼠的饮食中添加虾青素时，高密度脂蛋白的含 量有显著的增加;而添加其它的类胡萝卜素、β-胡萝卜素时，对高密度脂蛋白没有效 [26]果 。由此可以看出，虾青素有保护心血管系统的作用。 综合虾青素的生理特点及作用来看，由于虾青素具有抗氧化、抗肿瘤和增强免疫 力等许多重要的生理和生物学功能，使得其在食品添加剂、水产养殖、保健品和医药 工业等方面具有广阔的应用前景。目前美国的食品药品管理局已批准人工合成反式结 构的虾青素用作水产养殖的添加剂，但是现在市场上虾青素的售价很高，其人工合成 [27] 品的单价达2 000~2 500美元/kg 。因此研究和开发虾青素具有重要的商业和经济价 值。近年来我国的虾青素研究也步入新的领域，据报道，中科院昆明植物所黄俊潮研 究组与北京大学、香港大学合作，培育出世界首例能高产虾青素的工程番茄新品种， [28]其富含自然界中最强的抗氧化剂虾青素，具有极大的产业化和商业化应用前景 。 - 5 - 2 试验材料与方法 2.1 主要试验材料 2.1.1 藻种 雨生红球藻(Haematococcus pluvialis) 取自烟台市高新区海洋生物工程研究所。 2.1.2 主要试验试剂 KNO3 分析纯 KHPO 分析纯 24 FeSO?7HO 分析纯 42 MnSO 分析纯 4 EDTA-Na2 分析纯 VB 分析纯 1 NaHCO 分析纯 3 NaCl 分析纯 NaN3 分析纯 KI 分析纯 碘液 分析纯 二甲亚砜 分析纯 丙酮 分析纯 2.1.3主要试验仪器与设备 FA1004型电子天平 立式压力蒸汽灭菌器 超净工作台 LED光照仪 GBR-3型光生物反应器 GXZ-430A光照培养箱 JD-3型 Lx METER 722型光栅分光光度计 OLYWPUS型奥林帕斯显微镜 血球计数板 3K30型台式高速冷冻离心机 CR22G?型日立高速冷冻离心机 电热恒温干燥箱 二列四孔型电热恒温水浴锅 - 6 - 2.2试验方法 由于雨生红球藻生物量的增长和其次级代谢产物虾青素累积所需培养条件不同，故本试验过程采用两步法，即先在最适生长条件下培养雨生红球藻的绿色运动细胞，使雨生红球藻到达生长的平衡期，最大限度地获取生物量，然后通过改变培养条件诱 [29]导虾青素的大量快速累积 。 2.2.1雨生红球藻的培养 本试验的接种方式为湿藻接种，接种条件为:每瓶培养基体积1700 mL;接种量15%;接种的藻种液体积250 mL。培养方式为通气悬浮细胞培养，培养条件为:光照强度1000~1500 lx;光照周期24 h;光质为白光;培养温度为10?1?;通空气;初始pH?7.0。 2.2.2雨生红球藻的生长检测 在培养的过程中对培养物的细胞形态、细胞密度(血球板计数法)、吸光度(比色法)和pH (pH试纸)进行监测并进行记录，根据检测结果及时调整培养条件，以使雨生红球藻细胞密度达到最大，为试验的下一步做准备。 2.2.3虾青素的积累 根据每天的检测结果判断雨生红球藻细胞的生长时期，当藻细胞处于平衡期时，细胞密度达到最大，此时将雨生红球藻藻液离心弃旧液后接种到不同培养基中，然后在相同的高强度光照(大于8000 lx)下使雨生红球藻积累虾青。 积累条件是:光照强度15000~20000 lx;光照周期24 h;光质为白光;温度为室温17?1?;不通气;pH?7.0 。 2.2.4虾青素含量的检测 [30]本试验采用美国Cyanotech公司 的测定方法，对虾青素含量进行定量检测。 - 7 - 3 试验内容 3.1 雨生红球藻的培养 3.1.1 培养基的配置 培养基是为雨生红球藻细胞繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的按一定比例配 制的多种营养物质的混合物。一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐(包括微量元 素)以及维生素和水等，本试验中为细胞生长提供氮源和磷源的物质分别是KNO和3KHPO，碳源由通用入的空气提供;细胞培养所需的的培养基pH必须控制在一定的 24 范围内，使得细胞的生长繁殖或代谢产物的产生不受影响，在本试验中，雨生红球藻 的最适pH为6.8-7.0，培养初期pH约为7.0;试验过程中为简化操作流程可以将试剂按一定比例配成母液，现用现取，本试验的母液比例为1:1000;本试验中由于实验室VB的缺乏且含量很少，可不添加。雨生红球藻的培养基配方如表1所示。 12 用电子天平精确称量培养基的各个组分试剂，在小烧杯中完全溶解并降到室温后，用容量瓶定容至100 mL，然后分装到200 mL或250 mL锥形瓶中，用二到三层报纸包扎封口。溶解过程中对于难以溶解的物质如FeSO?7HO，可以放到二列四孔型电热42 恒温水浴锅中加热溶解。 3.1.2 试验材料的灭菌 将分装好的盛有母液的锥形瓶置于立式压力蒸汽灭菌器中进行高压蒸汽灭菌，条件为121?，30 min。注意对于高温易分解的物质如VB和NaHCO，不能进行高温灭13 菌，可以在配制培养基前放在超净工作台中紫外灭菌20 min。为简化试验操作流程，培养基组分灭菌时可以将后期需要灭菌的试验材料一并灭菌，如培养基配制时所需要的无菌水(本次试验共用2×1700 mL自来水，装入2000 mL的锥形瓶中，四层报纸包扎封口)和移液枪枪头，雨生红球藻培养时通气所需要的橡胶管等。灭菌后的培养基组分母液可以在本次试验中多次使用，在配制培养基时，可以根据比例吸取母液。 表1 雨生红球藻培养基配方 Table 1 The components of culture media for Haematococcus pluvialis 营养成分 含量(mg/L) 母液(g/100 mL) 1L培养基用量(mL) KNO100 10 1 3 KHPO 10 1 1 24 EDTA-Na10 1 1 2 -3VB6×10 0.012 1 1 -5VB5×10 0.010 1 12 FeSO?7HO 2.5 0.25 1 42 NaHCO100 10 1 3 MnSO 0.25 0.25 0.1 4 - 8 - 3.1.3接种 本试验用2000 mL锥形瓶作为雨生红球藻扩大化培养的反应容器，共需要扩培2瓶。为防止在通气过程中培养液溅出，每瓶培养基体积应控制在2000 mL以下，所以每瓶的培养基体积定为1700 mL。 本试验的接种方式为湿藻接种，即将含有旧液的雨生红球藻藻种直接接种于新鲜的培养基中，虽然有文献记录干藻接种(先将藻种液离心，弃旧藻液，再将藻种接种于 [32]新鲜的培养基中)较湿藻接种更利于雨生红球藻的生长 ，但湿藻接种较干藻接种更方便快捷，因此在实验室中应用更广。 确定好培养基体积和接种方式后，最后确定藻种的接种量。本试验的接种量定义为移入藻种液的体积和原培养基体积的比例。接种量的大小决定于雨生红球藻在反应器中生长繁殖的速度，采用较大的接种量可以缩短反应器中雨生红球藻达到高峰的时间，使虾青素提前积累，并可减少杂藻的生长机会。但接种量过大或者过小，均会影响雨生红球藻的生长，过大会引起溶氧不足，过小会延长培养时间。根据经验显示，雨生红球藻培养时的接种量为10%~20%，本试验的接种量为15%，即向新鲜的培养基中直接倒入250 mL绿色游动藻种。 接种前要对藻种进行镜检，确定藻细胞处于绿色游动时期，该时期的藻细胞活动性强，生长旺盛，接种到新鲜培养基后能较快的适应新环境，利于藻细胞的存活。接种前一天要将保存在冰箱中的雨生红球藻藻种取出，放于室温下静置活化。培养基的配制和藻细胞的接种都要在超净工作台中进行，并且接种前各种接种工具和接种材料都要进行紫外灭菌20 min，整个操作过程要严格按照无菌操作要求进行，防止杂藻和杂菌的污染。 3.1.4培养 接种后就可以进行雨生红球藻的扩大化培养了，本试验采用的培养方式是通气细胞悬浮培养。培养的第一天不通气，不提供额外的光照，给雨生红球藻一定的时间以适应新的生长环境，培养的第二天向锥形瓶中通入空气。通气前用高压蒸汽灭菌过的移液枪枪头在锥形瓶的封口报纸上扎一个大小合适的孔洞，使通气用的橡胶管刚好通过孔洞插入锥形瓶中。如果孔洞太大可以在橡胶管与报纸间塞入适量的棉花(提前进行紫外灭菌)以阻止灰尘进入锥形瓶中，防止杂菌的污染，各项装置组装完毕后可以接通吹气泵的电源进行通气。需要注意的是，此时要控制空气的通入量，资料显示 (1.1.4 环境条件对雨生红球藻生长的影响 (4)溶解氧)，较低的溶解氧(如50%饱和度)溶解氧有利于雨生红球藻的自养生长，因此培养初期过大的通气量不利于藻细胞进行自养生长，以锥形瓶中的空气气泡按每秒冒出一到两个为宜。培养三到四天后可以加大空气的通入量，以锥形瓶中的空气气泡呈连续线状且瓶中的藻悬液液体整体呈翻动状态为宜，此时的通气量如果过小，锥形瓶中的雨生红球藻容易聚集成团，沉降到瓶的底部，导致光照强度不均一，影响雨生红球藻的生长，而且成团的藻细胞不容易被摇散开，不利于藻细胞的计数和OD值的测量。相反，通气量如果过大，藻悬液容易被吹溅到锥形瓶瓶口，造成培养液的污染。 资料显示(1.1.4 环境条件对雨生红球藻生长的影响 (1)光照)，最适宜雨生红球藻 - 9 - 生长的光照强度数值大约为30μE/(??s)。在30μE/(??s)的光照条件下，持续光照与12 h光暗交替没有显著的差异，在小于20μE/(??s)的光照条件下持续光照反而有利于细胞的生长。光质方面红光比蓝光对雨生红球藻的生长更为有利。 从雨生红球藻细胞生长的最适光强的角度出发并结合现有的实验室设备条件，确定本次试验的培养的光照强度为1000~1500 lx(已知1μE/(??s) ?50 lx)，光照周期为连续光照，光照仪器选用GBR-3型光生物反应器，光质为白光，光照为单侧光。培养装置如图2所示。随着培养的进行，锥形瓶中的藻细胞数量会不断增多，藻细胞密度会不断增大，锥形瓶内的实际光照强度会不断小于预设光照强度，又由于本次试验采用单侧光照，锥形瓶内不同位置的光照强度差别较大。所以，在培养过程中要及时测量锥形瓶外的光照强度，并以此估计瓶内的光照强度，通过靠近或远离LED灯来增大或减小光照强度。估计锥形瓶中的光照强度可以用以下方法:用JD-3型光强计测量瓶外某一处的面向光源的光照强度，然后再测量一下该处延锥形瓶瓶身的另一处的光照强度，两处光照强度的平均值即为瓶内的近似光照强度。 虽然资料显示(1.1.4环境条件对雨生红球藻生长的影响 (2)温度)最适于雨生红球藻光合自养生长的温度为25?~28?，但由于实验室试验仪器有限，无法对培养温度进行控制，故本次试验的培养温度为室温，培养温度为10?1?，培养时间为25天。 图2 雨生红球藻培养时期装置图 Fig 2 Apparatus during the period of Haematococcus pluvialis culture 3.1.5生长检测 藻细胞在培养的过程中要对培养液的各项参数进行检测并记录结果，检测内容包括细胞形态、细胞密度、培养物的吸光度和pH值。 通过细胞形态的观察可以判断出雨生红球藻处于生活周期的何种时期，确定诱导雨生红球藻积累虾青素的最佳时期，同时还可以观察培养物中是否染杂菌。 细胞密度的测定在实际生产中是必不可少的，以时间为横轴以对应的细胞密度为纵轴制作出来的细胞生长曲线对生产有重要的指导意义。从该曲线中可以找出细胞生长的对数生长期，再结合对数生长期的OD值，以细胞密度为横坐标以对应的OD值为纵坐标，绘制细胞密度和OD值关系曲线。在实验室和生产中取样计算细胞培养物生物量时，只需测定培养物的OD值，通过该关系曲线计算对应的细胞密度，由此根据普通微生物学通用的公式计算细胞的生长速率μ,(?N-?N)/t ，其中N为t时间t0t - 10 - [33]的细胞数，N为初始细胞数，t为培养时间 。 0 (1) 细胞形态观察 在培养的过程中，不定期的从培养物中取少量的藻悬液滴加到干净的载玻片上，在显微镜下进行镜检，观察培养物中是否有杂菌或杂藻污染。前面也提到过(详见1.1.2 雨生红球藻的生活周期和1.2.2 雨生红球藻细胞内虾青素的合成及积累)，在雨生红球藻生活周期的后期，当细胞停止分裂时，藻细胞就会变大，细胞壁变厚，虾青素的合成速率大于分解速率，虾青素开始积累。当培养物中的大部分细胞呈现为不游动状态时，是诱导虾青素的最好时期。 (2) 培养物细胞密度的测定 由于雨生红球藻细胞体积较大，故测定细胞密度时通常采用显微镜直接计数法- [34] 血球板计数法 。 雨生红球藻在生长初期细胞游动性较强，计数时会造成很大的误差，对此可以先 [35]将藻细胞用卢戈氏液杀死再进行计数。卢戈氏固定液配制方法 :称取10g碘化钾(KI)，溶于少量的水中(10~20 mL)，待其完全溶解后，加入5g碘(I)充分摇动，待碘完2 全溶解后定容到100mL即配成卢戈氏液，最后装入棕色试剂瓶中保存。卢戈氏液最好现配现用，如果要长期使用，需要加入5 mL甲醛。取用时1 mL藻细胞悬液加10μL卢戈氏固定液，静置1 min后再进行血球板计数。 本试验采用的是25×16型的血球计数板，在每天的15:00~16:00之间用10×40倍镜对培养物的藻细胞密度进行计数并记录结果。注意计数前要将培养物充分摇匀再取样，以减少误差,每次计数时都测定2~3次，最终的细胞密度取多次测定后的平均细胞密度，以减少测定误差。 (3) 培养物吸光度值(OD值)的测定 [33] 相关资料显示 ，雨生红球藻在560 nm处有最大吸收峰，该吸收峰是雨生红球藻细胞中叶绿体的特征吸收峰。所以本试验用722型光栅分光光度计在560 nm波长下测定培养液的吸光度值(OD值)。为减少系统误差每次测定时需要重复测定1,2次，取平均值作为当次测定的结果并记录该数值。注意测量前同样要将培养物充分摇匀，减少系统误差。 (4) 培养物pH的测定 每天用pH试纸测定培养物的pH值，并记录结果。 3.2诱导虾青素 培养25天(从2014年2月26日到2014年3月22日共计25天)后，藻细胞密度 4已经到达4.0×10个/mL，并且细胞密度和吸光度值较前两天基本保持不变，镜检结果也显示培养物中游动的藻细胞数量已经很少，大部分的细胞呈静止状态，细胞体积变大，细胞壁明显变厚，少量的细胞内部甚至已经出现红色的虾青素颗粒。此时改变培养基的配方，在高光强下诱导虾青素，初步探讨单因素条件对虾青素积累量的影响。多项研究资料表明，氮饥饿、磷饥饿和盐胁迫都有利于雨生红球藻大量积累虾青素，而高强度的光照又是雨生红球藻积累虾青素的必要条件。 将高密度的藻液9000 r/min离心10 min使藻细胞沉淀，去上清液，收集藻种，加 - 11 - 入一定量的无菌水形成粘稠状的藻液，再平均分配到用于诱导的锥形瓶中，用四层报纸封口包扎封口，置于10000~20000 lx光强下诱导雨生红球藻积累虾青素，诱导时间为20天(从2014年3月25日到4月13日共计20天)，每间隔2~3天对诱导物进行镜检和计数。 由于诱导虾青素的过程也要避免染杂菌和杂藻，因此离心和重接种过程也要保持无菌环境。要求离心前将规格为80 mL的离心管放在紫外灯下灭菌20 min，离心后取藻种时用无菌水进行冲洗，重接种要在超净工作台中进行。 本试验共设置4组培养基，每组2个平行，其中第1组为全营养培养基，第2组为缺氮培养基(培养基不加KNO)，第3组为缺磷培养基(培养基不加KHPO)，第4324组为盐胁迫培养基(培养基中加入NaCl，浓度达到0.8%)。每瓶锥形瓶中的培养基体积为500 mL。 3.3 虾青素含量的测定 将诱导后的藻液15000 r/min离心10 min，去上清液，收集藻渣，将藻渣放在培养皿中 然后置于烘箱中烘干至恒重，计算干重。用药匙将藻粉从培养皿上轻轻刮下，收集干藻粉。 [30]陈晓飞，严小军 对雨生红球藻虾青素含量测定方法的探讨的结果表明，在常用的4种方法中(包括美国Cyanotech公司的测定方法、荆州天然虾青素有限公司的方法、氯仿,乙醇混合溶液提取测定方法以及高效液相色谱测定法)，美国 Cyanotech公司的测定结果与HPLC法最接近，达到1.461,，在3 种分光光度法中测定效果最好，其他分别只达到了1.250,、1.317,。结合资料和现有的试验仪器及试验试剂，本次试验决定采用美国Cyanotech公司的测定方法，来检测诱导后的虾青素含量，具体的测定方法如下: (1) 准确称量25 mg烘干后的藻粉，置于10 mL的离心管中。在离心管中加入5 mL DMSO，45?~50 ?水浴30 min，每10 min振荡15 s(共计3次)。6000 r/min离心10min，然后将上清液转入25 mL容量瓶中。 (2) 向离心管中加入5 mL丙酮，振荡30 s，6000 r/min离心10 min，再将上清液转入25 mL容量瓶中。重复操作至少3次，直至上清液基本无色(吸光值小于0.05)。向容量瓶中加入丙酮，定容至25 mL并将溶液振荡混合均匀。吸取5~7 mL放入离心管中，再次6000 r/min离心以除去前面步骤中带入的颗粒物. (3) 在474 nm波长下测定最大吸光值，用丙酮作为空白对照，如果吸光值大于1.25，则必须用丙酮稀释后再测。 计算公式为:类胡萝卜素质量(mg)=(最大吸光值A/250)×25 mL(丙酮)×稀释倍数 虾青素(%) = [类胡萝卜素质量(mg)/ 样品质量(mg)]×80% 虾青素(μg?mL-1)= (类胡萝卜素质量(mg) ×80%)/(25 mL×8) - 12 - 4 结果与讨论 雨生红球藻的扩大化培养时期镜检结果如图4所示，从左到右依次是绿色游动细胞(motile cell)、动孢子或游孢子(zoospore)、静孢子或不动孢子(aplanospore)和静细胞或不动细胞(non- motile cell)。镜检结果显示雨生红球藻生长良好，培养物中无其它杂藻的污染，观察到的藻细胞形态也与资料显示的无太大差别，在不同的培养时间里可以观察到生活周期中不同细胞形态的雨生红球藻。 图4 10×100倍下培养期雨生红球藻的镜检照片 Fig 4 Microscopic pictures of Haematococcus pluvialis culture at 10 × 100 times 雨生红球藻的诱导期的镜检结果如图5所示，从镜检结果可以看出，诱导时期雨生红球藻细胞体积明显变大，细胞中的虾青素从细胞中部的细胞核开始逐渐积累，细胞也由原来的游动绿色转变为静止红色。诱导后期大量的雨生红球藻细胞聚集成团。 图5 10×100倍下诱导期雨生红球藻的镜检照片 Fig 5 Microscopic pictures of induced Haematococcus pluvialis under 10 × 100 times 扩大化培养阶段培养物的参数检测结果如表4.1和图4.3、图4.4和图4.5所示。雨生红球藻的生活周期一般为15天，本次试验由于由于培养温度(10?1?)比雨生红球藻的最适生长温度(25?~28?)低很多，所以细胞生长的极其缓慢，培养时间达到25天。从图4.3整体可以看出，培养物的OD值和细胞密度随时间的增减趋势基本保持 - 13 - [36]一致。在不添加新鲜培养基的体系中，典型的细菌生长曲线 包括5个时期，分别为适应期(lag phase)、对数期(logarithmic phase)、减速期(deceleration phase)、平衡期(stationary phase)和死亡期(decline phase)，该生长规律也适合藻类细胞的生长过程。 在培养的前3天，藻细胞密度和OD值增长的很缓慢，该段时间可以视为雨生红球藻生长的适应期，是雨生红球藻细胞适应新生长环境的时期。适应期的长短与藻的种类、接种藻量、藻龄以及营养物质等不同而异，实际生产中为缩短成产时间，降低成本，往往要求适应期应尽量的短。 在培养的第4~17天，藻细胞密度迅速上升，OD值也随时间呈现直线上升的趋势，该段时间可以近似的视为雨生红球藻生长的对数生长期。在对数生长期中若没有抑制或限制细胞生长的因素存在，细胞将保持一个恒定的最大的比生长速度生长，以此，在实际生产中常常将该时期的藻细胞重新接种到新鲜的培养基中进行工业生产，可以有限的缩短细胞的生长的适应期，在短时间内获得高密度细胞培养物。因此对数生长期也是保留藻种的最佳时期，本试验也在10天左右进行了藻种的保存，供以后的实验者培养使用。 理论上来说，雨生红球藻活细胞数在对数生长期时，以稳定的几何级数极快增长，并且培养物的OD值与细胞密度呈正比(详见3.1.5雨生红球藻的生长检测)。以该对数生长期的细胞密度为横坐标以对应的OD值为纵坐标，绘制细胞密度和OD值关系曲线，如图9所示。结果表明，OD值在0.04~0.24，培养物光密度OD值和细胞密度 4之间满足线性关系:OD=0.0076N-0.0008。其中N表示雨生红球藻细胞密度(10个560 2/mL)，相关系数R=0.8839,0.735，说明相关关系显著，可利用培养物的OD值来测 [37]定细胞密度 。需要注意的是，该公式只适合用于测定处于对数生长期的雨生红球藻细胞密度。 5当培养到第18天时，雨生红球藻的游动细胞的细胞密度达到最大值，在5.0×10个/mL左右。第19~23天的细胞密度变化很小，这段时间可以近似的视为雨生红球藻生长的平衡期。这时培养基中营养成分尤其是氮、磷元素的缺乏使雨生红球藻的生长环境从有利状态变为胁迫状态，大部分的雨生红球藻已经停止分裂，游动细胞数目急剧减少，细胞进入休眠状态。此时培养基的营养成分已不能满足雨生红球藻的正常生长，细胞开始自行积累虾青素，镜检观察也发现部分细胞的中间部分已经变红，此时可以进行雨生红球藻诱导。 在整个培养过程中虽然对培养物的pH进行了检测和记录，但忽略了其对雨生红 [33]球藻生长的影响。在后期查阅资料 后也发现，雨生红球藻细胞培养时培养物的pH值会随着细胞的增值而上升，这意味着雨生红球藻正处于对数生长期。但当pH值超过最适范围甚至生长的适应范围时，雨生红球藻的生长达到顶点，随后生长下降。结合图6和图7可以清楚地看出此规律。如果能及时调整培养物的酸碱度，使pH值保持在最适范围，则雨生红球藻能继续生长繁殖，一船采用加酸的办法来降低菌液的酸碱度，醋酸、乳酸和盐酸部可使用，最常用的是醋酸。 雨生红球藻诱导积累虾青素期间，通过对每组的诱导物计数观察可以看出，第1组的两个平行中细胞密度都有不同程度的上升，原因是第1组的培养基是全营养培养 - 14 - 基，在诱导初期，部分还处于游动状态的细胞可以利用新鲜培养基中的营养成分分裂增殖，但随着诱导的进行，长时间的高强度光照抑制了细胞的增值，细胞密度基本保持不变，虾青素开始大量积累。第2组和第3组的细胞密度自始至终都基本不变，氮元素和磷元素的缺乏抑制了细胞的增值。第4组的细胞密度显著降低，原因是高浓度的含盐培养基使得还未形成厚壁孢子的雨生红球藻细胞失水死亡，仅有小部分成为厚壁孢子的雨生红球藻存活了下来并开始积累虾青素。 本次试验诱导的时间很长，前5天的颜色都没有明显变化，直到第6天第3组才 +2[41]+2表现出红色。原因可能是诱导培养基中含有Fe，有研究显示 ，培养基中Fe的存在会延长雨生红球藻积累虾青素的周期，有时会引起诱导期的雨生红球藻变白死亡。 从图8的结果可以看出，第2组雨生红球藻细胞中的类胡萝卜素的质量和虾青素的百分含量最高，其次是第1组，含量最低的是第4组。由此得出结论，在其它诱导条件一致的情况下，相对于全营养、磷饥饿和盐胁迫来说，氮饥饿更有利于雨生红球藻积累虾青素。 表2 雨生红球藻培养期参数记录表 Table 2 Record sheet of parameters during the culture period of Haematococcus pluvialis 4时间/d pH值 平均细胞密度/(10个/mL) OD值 1 6.0 3.00 0.027 2 6.0 3.10 0.034 3 6.0 3.54 0.043 4 6.0 4.00 0.040 5 6.5 5.16 0.045 6 6.5 6.79 0.046 7 6.5 9.38 0.074 8 7.0 14.00 0.081 9 7.5 15.86 0.090 10 7.0 15.00 0.124 11 7.5 23.79 0.135 12 7.5 20.43 0.147 13 7.0 21.98 0.166 14 8.0 22.54 0.181 15 8.0 20.00 0.201 16 8.5 27.66 0.215 17 8.5 29.58 0.237 18 8.5 45.55 0.235 19 9.0 48.76 0.247 20 9.0 45.00 0.250 21 7.0 44.77 0.259 22 6.5 43.23 0.261 23 6.0 44.78 0.258 24 6.0 43.27 0.254 25 5.5 40.63 0.243 - 15 - 0.30060.00 0.25050.00 0.20040.00 0.15030.00 值OD 0.10020.00 0.05010.00 细胞密度个/(10^4/mL)0.0000.00 02468101214161820222426OD值 平均细胞密度培养时间/d 图6 雨生红球藻培养期细胞密度、OD值随时间变化曲线图 Fig 6 The curves of cell density and OD changes during the cultivation 013.5 -0.513 -112.5 -1.512-2 11.5-2.5 值的对数11OD-3 细胞数的对数 /mL10.5-3.5 -410 02468101214161820222426OD值的对数 细胞数的对数培养时间/d 图7 雨生红球藻培养期细胞的生长曲线图 Fig 7 The growth curve of Haematococcus pluvialis 10.0 9.0 8.0 值pH7.0 6.0 5.0 02468101214161820222426 培养时间/d 图8 雨生红球藻培养期pH值随时间变化曲线图 Fig 8 The curves of pH changes during the cultivation of Haematococcus pluvialis - 16 - 0.250 y = 0.0076x - 0.00080.2002 = 0.8839R 0.150 值OD 0.100 0.050 0.000 0.005.0010.0015.0020.0025.0030.0035.00 细胞密度/(10^4个/mL) 图9 雨生红球藻培养期OD值与细胞密度关系曲线图 Fig 9 The curves of OD changes with the cell density 表3 虾青素含量测定结果表 Table 3 The determination results of astaxanthin content 第1组 第2组 第3组 第4组 平行1 平行2 平行1 平行2 平行1 平行2 平行1 平行2 干藻粉总重 333 325 234 253 330 303 64 74 /mg 总体积/mL 490 480 470 460 430 460 435 445 干重/(mg/L) 679.592 677.083 497.872 550.000 767.442 658.696 147.126 166.292 A 1.083 1.074 0.895 0.450 0.548 0.556 0.286 0.252 474 稀释倍数 10 10 15 30 10 10 10 10 样品质量 31 31 31 31 31 31 31 31 /mg 丙酮用量 25 25 25 25 25 25 25 25 /mL 类胡萝卜素 1.183 1.174 1.343 1.350 0.548 0.556 0.286 0.252 质量/mg 虾青素百分 2.795 2.772 3.465 3.484 1.414 1.435 0.738 0.650 含量/% 3.5 类胡萝卜素质量/mg3 虾青素百分含量/%2.5 2 1.5 1 0.5 0 平行1平行2平行1平行2平行1平行2平行1平行2 第1组第2组第3组第4组 图10 虾青素含量测定结果图 Fig 10 The determination results of astaxanthin content - 17 - 结 论 本次试验主要是初步探究在其它诱导条件一致的情况下，氮饥饿、磷饥饿和盐胁迫哪一个因素更有利于诱导雨生红球藻积累虾青素，现对整个试验总结如下: (1) 红光有利于雨生红球藻的生长，蓝光有利于虾青素的积累，并且有研究显示，用LED灯作为光源，红光与白光的混合光照比单纯使用一种光质的光更有利于雨生红球藻的生长。同理，蓝光与白光的混合光照也更有利于诱导雨生红球藻积累虾青素。所以，以后的实验人员可以尝试采用混合光照培养和诱导雨生红球藻。 (2) 前面也提到过，在雨生红球藻的扩大化培养期间，忽视了培养物的pH变化和调控。查阅之前的毕业实验记录，也几乎看不到对培养物pH调控的相关描述。希望以后的实验人员可以注意到这点。 (3) 试验中的通气是通入的空气，严格来说，通二氧化碳气体比通入空气更有利于藻细胞的增长。 (4) 本试验雨生红球藻诱导期间的对照组是第1组诱导培养基是全营养的，后期看来这样的有些不妥。因为前言中也介绍过，生存环境越恶劣越有利于雨生红球藻积累虾青素，全营养的培养基的加入显得有些多余，因此，对照组应当是不添加任何营养物质的诱导物。 (5) 本试验对于虾青素的分析几乎没有涉及，主要原因是时间仓促，没有获得高生物量的雨生红球藻藻液，诱导得到的虾青素总量很少，无法在现有的纯化和结晶条件下提取出较纯净的虾青素成品。 (6) 雨生红球藻的培养期间测定OD值时选用的波长是560 nm，是根据前人经验来确定的，严格来说为了减少误差，试验前应该测定一下培养物的悬浮液在200~700 nm波长范围内的最大吸吸收峰，从而确定测定波长。 (7) 本次试验是第一个自己独立设计并完整完成的试验，综合看来，整个试验过程进行的还是比较顺利的，最大的不足是时间利用很不合理，试验的每个阶段都耗时很长。主要原因还是试验开始前没有做好充足的准备，没有合理分配好时间。希望本试验能为以后的实验者提供一定得参考依据，也为雨生红球藻的实际生产提供帮助。 - 18 - 参考文献 [1] 陈峰, 姜悦. 微藻生物技术[M]. 北京: 中国轻工业出版社, 1999: 174-178. [2] 翟兴文. 雨生红球藻的基础生物学和诱变育种研究[D]. 宁波: 宁波大学. 2003: 6-7. [3] 刘建国, 殷明焱, 张京浦等. 雨生红球藻的细胞周期初探[J]. 海洋与湖沼, 2000, 31(2): 145-150. [4] Ding S. Y. and Lee Y. K.,Growth of entrapped Haematococcus lacustris in alginate beads in a fluidized bed airlift bioreactor system, First Asia-Pacific Conference on Algal Biotechnology, Malaysia, Kuala Lumpur, 1994. [5] 李颖逾, 刘建国, 林伟等. 雨生红球藻细胞转化虾青素积累与光照强度的关系及不同品系间 的差异性[J]. 海洋科学, 2006, 30(9): 36-41. [6] Lee Y. K. and Ding S. Y., Effect of dissolved oxygen partial pressure on the accumulation of astaxanthin in chemostat cultures of Haematococcus lacustris, Journal of Phycology, 1995, 31(6): 922-924. [7] 应巧兰, 叶勇. 影响雨生红球藻797 株生长和虾青素积累的某些因素[J].应用与环境生物学报, 2002, 8(1): 56-60. [8] 孟春晓, 高政权, 王依涛等. 影响雨生红球藻中虾青素积累条件的研究进展[J]. 水产科学, 2011, 30(002): 118-121. [9] 郑裕国, 沈寅初. 微生物发酵生产虾青素[J]. 生物工程进展, 2002, 22(2): 19-22. [10] 吴彩娟. 天然虾青素提取和纯化工艺研究[D]. 浙江. 浙江大学材料与化学学院, 2003. [11] Odai Y,Higashi—Kdal K.Possible immunomodulating activities of carotenods in vitro cell culture experiments[J]. Int J Immunopharmacol, 1996, 18(12): 753. [12] Andrewes, Phaff. Carotenoids of bacteria–structure and biosynthesis. Arch Microbiol, 1976, 17, 79-88. [13] 董庆霖, 赵学明, 邢向英. 强光照对雨生红球藻合成虾青素的影响[J].高校化学工程学报, 2007, 21(4): 685-688. [14] 陆开形, 蒋霞敏. 叠氮钠 (NaN3) 诱变对雨生红球藻的生理效应[J]. 科技通报, 2007, 23(3): 351-355. [15] Bjorndahl T. The economics of salmon aquaculture Blackwell scientific. Oxford, 1990, 1. [16] Toshiki N J. Agri Food Chem, 1995, 43(6): 1570 -1573. [17] Johnson E A, Lewis M J, Crau C R.Pigmentation of eggyolk with astaxanthin from the yeast Phaffia Rhodozyma.Poultry Science, 1980, 59: 1777 - 1782. [18] Vernon C, Ponce p, Pedroza I, ct al. Arch Latinoam Nutr, 1996, 46(3): 243-246. [19] Di M P, Devasagayam T P, Kaiser S et a1. Biochem.Soc. Trans., 1990, 18(6): 1054-1056. [20] Cornnor I, Brien N.J. DermaI Sci., 1998, 16(3): 226-230. [21] Astorg P, Gradelet S. Berges Retal Nutr Cancer, 1997, 29(1): 60-68. - 19 - [22] Jyonouchi H, Sun S, Gross MD. Astaxanthin, a carotenoid without vitamin a activit augments antibody responses in cultures including T-helper cell clones and suboptimal doses of anfigen[J]. Nutr, 1995, 125(10): 2483. [23] Tanaka T. Makita H. Ohnishi Met. Cancerres., 1995, 55(18): 4059-4064. [24] Bendich A. Carotenoids and the immune system. In: Carotenoids[M]. Krinsky NI, eds. New Yirk: P1enum Press, 1990. [25] Odai Y, Higashi-Kdal K. Possible immunomodulating activities of carotenods in vitro cell culture experiments[J]. Int J Immunopharmac01, 1996, 18(12): 753. [26] Timothy J Maher. Ph D.Astaxanthin: continuing education module, 2000. 71. [27] 陈晓琳, 汲霞, 钟志梅,等. 虾青素的应用前景[J]. Marine Sciences, 2008, 32(5): 87. [28] 张雯雯. 世界首例超级营养番茄问世 富含虾青素[J]. 北京农业:中旬刊,2012(5): 52-52. [29] 魏东, 臧晓南. 大规模培养雨生红球藻生产天然虾青素的研究进展和产业化现状[J]. 中国海 洋药物, 2001(5): 4-8. [30] 陈晓飞等. 红球藻虾青素含量测定方法的探讨[J]. 宁波大学学报(理工版), 2007, 20(4). [31] 张仁梁. 从雨生红球藻中提取虾青素的初步研究[D]. 烟台: 烟台大学生命科学学院生物技术 实验室, 2007: 13-14. [32] 张涛. 雨生红球藻培养条件探索[D]. 烟台:烟台大学生命科学学院生物技术实验室, 2006:6-7. [33] 欧阳琴. 雨生红球藻的培养及其虾青素提取 [D]. 福建: 福州大学侨兴轻工学院, 2004:24-25. [34] 沈萍，陈向东等.微生物学实验(第4版)[M].北京: 高等教育出版社, 2000: 52-53. [35] SC/T 9402-2010. 淡水浮游生物调查技术 [S]. [36] 梁世中. 生物工程设备(第2版)[M]. 中国轻工业出版社, 2011: 4-5. [37] 蒋霞敏, 柳敏海, 任凯来. 化学因子对雨生红球藻诱变株虾青素积累的调控[J]. 宁波大学学报: 理工版, 2005, 18(3): 306-312. - 20 -