实验十四血清甘油三酯(TG)的测定
实验十二 血清甘油三酯(TG)的测定
血清甘油三酯测定方法较多,但主要包括提取、吸附、皂化、氧化,还原及显色等步骤。近年发展的酶学方法测定操作步骤虽然简单,但要许多纯酶制剂,此外还有光散射测定法,亦需要特点器材,故不易推广使用,现介绍两种常用的方法:
一、酶法测定甘油三脂
【原 理】
甘油三酯经脂肪酶水解为甘油和脂肪酸,甘油和ATP在甘油激酶(GK)的作用下生成3,磷酸甘油和ADP,3,磷酸甘油经磷酸甘油氧化酶作用生成磷酸二羟丙酮和过氧化氢。过氧化氢、4,氨基替吡啉和苯酚在过氧化物酶(POD)的微化生成红色的醌类化合物,颜色的深浅与含量成正比。反应过程如下:
、TG 甘油,脂肪酸 1
2、甘油,ATP 3,磷酸甘油,ADP
3、3,磷酸甘油,O 磷酸二羟丙酮,HO 222
4、HO,4,氨基安替吡啉,苯酚 红色醌类化合物 22
【试 剂】
TC酶试剂盒(商品)
【操 作】
取三支试管,按下表操作:
标准管 测定管 空白管 血清(μl) — 20 — TG标准液(μl)(2mg/ml) 20 — — TG酶工作液(ml) 1.0 1.0 1.0 HO(μl) — — 20 2
混匀,37?水浴15分钟,保温结束后,以空白管调零,520nm处比色测定光密度。 【计 算】
TG(mg%) ×2×0.02×
正常值:50,150mg,
【注意事项】
1、清晨空腹血清为好。
2、干粉配成酶工作液后,在2—8?条件下可保存7天。
【临床意义】
血清TG随进食脂肪后即见上升并出现混浊。空腹脂肪餐后2—4小时内,血清混浊度及甘油三酯含量达高峰,8小时后,基本恢复空腹水平。血清TG有随年龄而上升的趋势,体重超过标准者也往往偏高。
家庭性脂质代谢紊乱、糖尿病、肾病综合症、粮原累积病、动脉粥样硬化、酒精中毒、垂体、甲状腺功能低下者、胰腺炎等疾病TG可增高。
原发性β,脂蛋白缺乏、甲状腺机能亢进、肾上腺皮质机能不全等疾病TG均可降低。
二、乙酰丙酮法
【原 理】
血清中甘油三酯经正庚烷一异丙醇混合溶剂抽提后,用氢氧化钾溶液皂化成甘油,并进一步用过碘酸氧化成甲醛,在NH4,的存入下,甲醛与乙酰丙酮反应生成3,5—二乙酰—1,4—二氢二甲基吡啶,后者为带荧光的黄色物质。与同样处理的标准液比色计算,即得血清中甘油三酯的含量,反应式如下:
【试 剂】
1、抽提剂:正庚烷/异丙醇,2/3.5(v/v)
2、0.04MHSO 24
3、异丙醇(A.R)
4、皂化试剂:取6.0gKOH溶于60ml蒸馏水中,然后取异丙醇40ml混合,置棕色瓶中室温保存。
5、氧化试剂:称取65mg过碘酸钠溶于约50ml蒸馏水,然后加入7.7g无水醋酸铵溶解,再加6ml冰醋酸,并加水至100ml。贮棕色瓶内室温保存。
6、乙酰丙酮试剂:0.4ml乙酰丙酮加到100ml异丙醇中,混匀,置棕色瓶内室温保存。
7、三油酸甘油酯标准液:
贮存液(10mg/ml):精确称取三油酸甘油酯1.000g,溶解于抽提剂中,定容至100ml,置冰箱存。
应用液(1mg/ml):贮存液用抽提剂10倍稀释,置冰箱保存。
【操 作】
带塞试管3支,编号,按下表操作:
测定管 标准管 空白管 血清(ml) 0.2 — — 应用标准液(ml) — 0.2 — 蒸馏水(ml) — 0.2 0.2 抽提剂(ml) 2.5 2.3 2.5
0.04MHSO(ml) 0.5 0.5 0.5 24
边加边摇,加好后,剧烈振摇15分钟,静置分成二相后,准确吸取各管上层清液0.3ml,分别加至另外三支试管中。按下表操作:
异丙醇(ml) 1.0 1.0 1.0 皂化试剂(ml) 0.3 0.3 0.3
充分混匀,置65?水浴中3分钟
氧化试剂(ml) 1.0 1.0 1.0 乙酰丙酮试剂(ml) 1.0 1.0 1.0
混匀,置65?水浴中15分钟,取出后冷却,于420nm处,以空白管调零点,读取各管光密度。
【计 算】
甘油三酯mg= ×0.2× = ×100
【注意事项】
1、应空腹采血,否则结果偏高。
2、显色后光密度随时间延长而略增高,故应立即比色。标本多时,可置冷水浴中逐管比色,这样对结果影响不大。