限制性内切酶使用

用Universal Buffer和Basal Buffer进行限制酶活性示 TaKaRa公司，为了方便限制酶的统一使用，采用了通用缓冲液 (Universal Buffer) 测定限制酶活性的体系 (5种通用缓冲液中， 用 标注的)，以此时的活性值作为100%。并把在其它通用缓冲液中的相对活性表示如下表。有 ( ) 标记的是易受Star活性影 响的缓冲液，为了避免Star活性的影响，希望尽量使用 或 标注的缓冲液。每种限制酶都有其自身的基本缓冲液 (Basal Buffer)，其中Acc Ⅲ、BalⅠ、BcnⅠ、BglⅠ、Bpu1102Ⅰ、Cfr10Ⅰ、Eam1105Ⅰ、Eco52Ⅰ、NruⅠ、PshBⅠ、SnaBⅠ、SspⅠ、TaqⅠ、VpaK11B Ⅰ(共14种)由于没有十分合适的通用缓冲液，只能使用基本缓冲液(Basal Buffer)。各种限制酶的基本缓冲液组成不同，相互之间不能通用。各种限制酶在基本缓冲液中的相对活性也被列于下表，供参考。 限制酶在各种缓冲液中的相对活性   附带·活性测定用Buffer     推荐使用的Buffer  *1 +0.01%BSA→100%: Afl II, Aor13H I, EcoO65 I, Fok I, Hin1 I, Mun I, Nco I, Pvu I, Sse8387 I, Xba I  *2 +0.01%BSA+0.01%Triton X-100→100%: Not I 按Universal Buffer分类的限制酶     各Universal Buffer的组成     ■ 使用注意事项 10×Buffer都为10倍浓度的缓冲液。此外，10×T溶液中不含BSA， 在使用时将BSA添加进去，使最终浓度为0.01%，有些限制酶(带有*1或*2标记)的反应体系中需加BSA或Triton X-100，添附的溶液是10倍浓度 (0.1%) 的液体，使用时，请在反应体系中添加1/10量进行反应。   ■ 保存 -20℃   反应停止液组份表 (10 × Loading Buffer) 1%         SDS 60%         Glycerol 0.05%         Bromophenol Blue   ■ 使用方法 本公司的酶包装中全部附带有反应停止液。使用时请添加反应液量的1/10，即可停止反应，进行电泳。-20℃保存时，会出现SDS沉淀，请于温水浴中溶解后使用。在室温下保存时，SDS有时也会出现沉淀，此时同样请于温水浴中将其溶解后使用。   ■ 保存 开封后室温保存。 Double Digestion(双酶切反应)时Universal Buffer(通用缓冲液)的使用表 ■ 说明 使用二种酶同时进行DNA切断反应 (Double Digestion) 时，为了节省反应时间，通常希望在同一反应体系内进行。TaKaRa采用Universal Buffer表示系统，并对每种酶表示了在各Universal Buffer中的相对活性。尽管如此，在进行Double Digestion时，有时还会难以找到合适的Universal Buffer。 本表以在pUC系列载体的多克隆位点处的各限制酶为核心，显示了在Double Digestion可使用的最佳Universal Buffer条件。在本表中，各Universal Buffer之前表示的 [数字×] 是指各Universal Buffer的反应体系中的最终浓度。TaKaRa销售产品中添附的Universal Buffer全为10倍浓度的缓冲液。终浓度为0.5×时反应体系中的缓冲液则稀释至20倍，1×时稀释至10倍，2×时稀释至5倍进行使用。   ■ 注意 ◇ 1 μg DNA中添加10 U的限制酶，在50 μl的反应体系中，37℃下反应1小时可以完全降解DNA。 ◇ 为防止Star活性的产生，请将反应体系中的甘油含量，尽量控制在10%以下。 ◇ 根据DNA的种类，各DNA的立体结构的差别，或当限制酶识别位点邻接时，有时会发生Double Digestion不能顺利进行的可 能。 pUC18/19/118/119载体多克隆位点处的限制酶双酶切效果 在基因工程实验中，经常要对DNA片段进行多种限制酶的酶切反应。但经过实验验证，对在DNA片段上相邻或相近的两个限制酶切位点进行双酶切反应时，往往达不到预期的效果。例如，对pUC18/19/118/119载体多克隆位点处的Kpn I 和Sma I 进行双酶切时，酶切反应难以进行。而针对有些酶切位点进行双酶切时，酶切效果与酶切反应所用限制酶的顺序还有关系。例如，要对Sac I 和Kpn I 这两个酶切位点进行双酶切时，如果先用Sac I 进行酶切，然后再用Kpn I 进行酶切，双酶切反应则无法进行。但是如果先用Kpn I 进行酶切，然后再用Sac I 进行酶切，双酶切反应则可以进行。造成这些结果的原因是因为进行限制酶的双酶切反应时，由于受到酶切位点周围碱基数量的影响，从而影响了酶切效果。 本公司对pUC18/19/118/119载体多克隆位点处的限制酶进行双酶切时的效果，进行了实验验证，结果见表1和表2。表1是用两种限制酶进行分步酶切时的结果，表2是用两种限制酶进行同步酶切时的结果。 为了保证实验的顺利进行，对载体多克隆位点上的限制酶进行双酶切时，应该考虑各限制酶之间的位置关系。 下表中记号：“O”表示限制酶酶切效果较好；“△”表示限制酶的酶切效果不太好；“X”表示限制酶酶切效果很差。   表1 分步酶切效果   表2 同步酶切效果 注： 1. 对相邻酶切位点的限制酶进行双酶切反应时，同时加入限制酶进行双酶切反应的切断效果都不太理想，建议按先后顺序加入相应的限制酶进行酶切反应。 2. 使用EcoR I进行酶切反应时，酶切体系为20 μl，将酶的添加量控制在10 U左右，反应时间控制在2小时左右，双酶切效果较好。 PCR产物末端限制酶切位点的切断情况 克隆PCR产物的方法之一，是在PCR产物两端设计一定的限制酶切位点，经酶切后克隆至用相同酶切的载体中。但实验证明，大多数限制酶对裸露的酶切位点不能切断。必须在酶切位点旁边加上一个至几个保护碱基，才能使所定的限制酶对其识别位点进行有效切断。 下表列举了15种限制酶，分别比较了各种限制酶在其酶切位点旁边分别加0、1、2、3个保护碱基后的切断情况。表中的：(-) 为不能切断；(±) 为不能完全切断；(+) 为能完全切断。 结果显示，基本上所有限制酶，在其酶切位点旁边加上3个以上的保护碱基后，可以对其酶切位点进行有效切断。