乳酸脱氢酶酶活力测定

实验六  乳酸脱氢酶酶活力测定 及紫外吸收法测定蛋白质含量 目的要求 (1) 掌握LDH活性测定原理； (2) 学习用比色法测定酶活性的方法。 实验原理 乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase简称LDH，EC.1.1.1.27, L－乳酸：NAD+氧化还原酶）广泛存在于生物细胞内，是糖代谢酵解途径的关键酶之一，可催化下列可逆反应。 LDH可溶于水或稀盐溶液。组织中LDH含量测定方法很多，其中紫外分光光度法更为简单、快速。鉴于NADH, NAD+ 在340nm及260nm 处有各自的最大吸收峰，因此以NAD+为辅酶的各种脱氢酶类都可通过340nm光吸收值得改变，定量测定酶的含量。本实验测定LDH活力，基质液中含丙酮酸及NADH，在一定条件下，加入一定量酶液，观察NADH在反应过程中340 nm 处光吸收减少值，减少越多，则LDH活力越高。其活力单位定义是：在25℃，pH7.5条件下A340nm/min下降为1.0的酶量为1个单位。可定量测定每克湿重组织中LDH单位。定量测定蛋白质含量即可计算比活力（U/mg）。 利用上述原理，改变不同第五则可测定相应脱氢酶反应过程中A340nm的改变，定量测定酶活力，如苹果酸脱氢酶、醇脱氢酶、醛脱氢酶、甘油－3－3磷酸脱氢酶等，适用范围很广。 试剂和器材 一、试剂 50m mol/L pH6.5磷酸氢二钾－磷酸二氢钾缓冲液母液： A: 50 m mol/L K2HPO4: 称K2HPO41.74g加蒸馏水溶解后定容至200ml。 B: 50 m mol/L KH2PO4: 称KH2PO43.40g加蒸馏水溶解后定容至500ml。 取溶液A 31.5ml ＋ 溶液B 68.5ml, 调节pH至6.5。置4℃冰箱备用。 10m mol/L pH 6.5磷酸氢二钾－磷酸二氢钾缓冲液用上述母液稀释得到。现用现配。 0.1mol/L pH 7.5磷酸盐缓冲液, 用上述母液稀释得到。现用现配。 NADH溶液：称3.5mg纯NADH置试管中，加0.1mol/L pH7.5磷酸缓冲液1ml  摇匀。现用现配。 丙酮酸溶液：称2.5mg丙酮酸钠，加0.1mol/L pH7.5磷酸缓冲液29ml, 使其完全溶解。现用现配试剂。 二、             材料 动物肌肉、肝、心、肾等组织。 三、             器材 组织捣碎机，紫外分光光度计，恒温水浴，移液管(5ml, 0.1ml), 微量注射器（10ul）。 操作方法 一、             制备肌肉匀浆 称取20g 兔肉, 按W/V=1/4比例加入4℃预冷的10m mol/L Ph6.5磷酸氢二钾－磷酸二氢钾缓冲液，用组织捣碎机捣碎，每次10s，连续3次。将匀浆液倒入烧杯中，置4℃冰箱中提取过夜，过滤后得到组织提取液。 二、             LDH活力测定 试验时预先将丙酮酸溶液及NADH溶液放在25℃水浴中预热。取2只石英比色杯，在1只比色杯中加入0.1m mol/L pH 7.5磷酸氢二钾－磷酸二氢钾缓冲液3ml，置于紫外分光光度计中，在340nm处将光吸收调节至零；另一只比色杯用于测定LDH活力，依次加入丙酮酸钠溶液2.9ml, NADH溶液0.1ml，加盖摇匀后，测定340 nm光吸收值（A）。取出比色杯加入经稀释的酶液10μl，立即计时，摇匀后，每隔0.5min 测A340nm，连续测定3min，以 A对时间作图，取反应最初线性部分，计算A340nm/min减少值。加入酶液的稀释度（或加入量）应控制 A340nm/min下降值在0.1－0.2之间。 三、             数据处理 计算每毫升组织提取液中LDH活力单位 LDH活力单位（U）/ml 提取液 ＝（A340nm/min稀释倍数）/ （酶液加入量（10μl）10-1 提取液中LDH总活力单位＝LDH活力（U）/ml 总体积 注意事项 （1）实验材料应尽量新鲜，如取材后不立即用，则应贮存在－20℃冰箱。 （2）酶液的稀释度及加入量应控制A340nm/min下降值在0.1－0.2之间，以减少实验误差。 （3）NADH溶液应在临用前配制。 思考： 1. 简述用紫外分光光度法测定以NAD+为辅酶的各种脱氢酶测定原理。 实验之二：紫外吸收法测定蛋白质含量 实验原理 蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。 紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。低浓度的盐，例如生化制备中常用的（NH4）2SO4等和大多数缓冲液不干扰测定。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测，因为此时只需测定蛋白质浓度的变化，而不需知道其绝对值。 此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正，再进行计算的方法，加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的误差。 此外，进行紫外吸收法测定时，由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化，因此要注意溶液的pH值，测定样品时的pH要与测定标准曲线的pH相一致。 一 、试剂： [1] 标准蛋白质溶液：任选一种。 （1）牛血清清蛋白溶液：准确称取经凯氏定氮法校正的结晶牛血清清蛋白，配制成浓度为1毫克/毫升（mg/mL）的溶液。 （2）卵清蛋白质溶液：将约1克卵清溶于100毫升0.9%氯化钠溶液中，离心，取上清液，按微量凯氏定氮法测其蛋白质含量，用0.9%氯化钠溶液稀释至蛋白浓度为1毫克/毫升。 [2] 待测蛋白质溶液：浓度为1毫克/毫升左右的溶液。 二、器材： [1] 紫外分光光度计  [2] 吸量管  [3] 试管和试管架 操作方法 下面介绍四种紫外吸收法： 1. 280nm的光吸收法 因蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm处具有最大吸收，且各种蛋白质的这三种氨基酸的含量差别不大，因此测定蛋白质溶液在280nm处的吸光度值是最常用的紫外吸收法。 测定时，将待测蛋白质溶液倒入石英比色皿中，用配制蛋白质溶液的溶剂（水或缓冲液）作空白对照，在紫外分光度计上直接读取280nm的吸光度值A280。蛋白质浓度可控制在0.1~1.0mg/ml左右。通常用1cm光径的标准石英比色皿，盛有浓度为1mg/ml的蛋白质溶液时，A280约为1.0左右。由此可立即计算出蛋白质的大致浓度。 许多蛋白质在一定浓度和一定波长下的光吸收值（A1％1cm）有文献数据可查，根据此光吸收值可以较准确地计算蛋白质浓度。下式列出了蛋白质浓度与（A1％1cm）值（即蛋白质溶液浓度为1%，光径为1cm时的光吸收值）的关系。文献值A1％1cm,λ称为百分吸收系数或比吸收系数。 蛋白质浓度 = (A28010 )/ A1％1cm,280nm (mg/ml) (  1%浓度10mg/ml) 例：牛血清清蛋白 ：  A1％1cm=6.3 (280nm) 溶菌酶 ：        A1％1cm=22.8 (280nm) 若查不到待测蛋白质的A1％1cm值，则可选用一种与待测蛋白质的酪氨酸和色氨酸含量相近的蛋白质作为标准蛋白质，用标准曲线法进行测定。标准蛋白质溶液配制的浓度为1.0mg/ml。常用的标准蛋白质为牛血清清蛋白（BSA）。 标准曲线的测定：取6支试管，按下表编号并加入试剂： 管号 1 2 3 4 5 6 BSA（1.0mg/ml） 0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 H2O 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0 A280                           用第1管为空白对照，各管溶液混匀后在紫外分光光度计上测定吸光度A280，以A280为纵座标，各管的蛋白质浓度或蛋白质量（mg）为横座标作图，标准曲线应为直线，利用此标准曲线，根据测出的未知样品的A280值，即可查出未知样品的蛋白质含量，也可以用2至6管A280值与相应的试管中的蛋白质浓度计算出该蛋白质的A1％1cm,280nm 2. 280nm和260nm的吸收差法 核酸对紫外光有很强的吸收，在280nm处的吸收比蛋白质强10倍（每克），但核酸在260nm处的吸收更强，其吸收高峰在260nm附近。核酸260nm处的消光系数是280nm处的2倍，而蛋白质则相反，280nm紫外吸收值大于260nm的吸收值。通常： 纯蛋白质的光吸收比值：A280/A260 1.8 纯核酸的光吸收比值：  A280/A260 0.5 含有核酸的蛋白质溶液，可分别测定其A280和A260，由此吸收差值，用下面的经验公式，即可算出蛋白质的浓度。 蛋白质浓度=1.45×A280－0.74×A260  (mg/ml) 此经验公式是通过一系列已知不同浓度比例的蛋白质（酵母烯醇化酶）和核酸（酵母核酸）的混合液所测定的数据来建立的。 3.  215nm与225nm的吸收差法 蛋白质的稀溶液由于含量低而不能使用280nm的光吸收测定时，可用215nm与225nm吸收值之差，通过标准曲线法来测定蛋白质稀溶液的浓度。 用已知浓度的标准蛋白质，配制成20～100 g/ml的一系列5.0ml的蛋白质溶液，分别测定215nm和225nm的吸光度值，并计算出吸收差：