生物技术制药复习题（总）

生物技术制药复习题（总） 生物技术制药复习题 第一章 绪论 第一节 生物技术的发展史 1、生物技术:以生命科学为基础，利用生物体的特性和功能，设计构建具有与其性状的新物种或新品系，并与工程结合，利用这样的新物种进行加工生产，为社会提供商品服务的一个综合性技术体系。它的范畴:基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程、生化工程。基因工程是生物技术的核心。P1 2、蛋白质工程----第二代基因工程;海洋生物技术-----第三代生物技术P1 3、生物技术发展史:传统、近代(抗生素、发酵罐)、现代(DNA重组)P3 1974年，Boyer和Cohen建立了DNA重组技术 1975年，Koher 和 Milstein 建立了单克隆抗体技术 1982年，第一个基因工程药物重组人胰岛素被批准上市 1989年，我国第一个基因工程药物干扰素批准上市 2003年，中国的重组腺病毒-p53注射液成为石阶上第一个正式批准的基因治疗药物。 第二节 生物技术药物 1、生物技术制药:生物技术制药:采用现代生物技术人为地创造一些条件，借助某些微生物、植物或动物来生产所需的医药品。P4 2、生物技术药物:采用DNA重组技术活其他生物技术研制的蛋白质或核酸类药物。它与天然生化药物、微生物药物、海洋药物和生物制品共同归为生物药物。 3、现代生物药物分为4类:重组DNA技术制造的基因重组多肽、蛋白质类治疗剂;基因药物;天然药物;合成与部分合成药物。 4、生物药物按用途分为:治疗药物;预防药物;诊断药物。 5、生物技术药物的特征: (1)分子结构复杂;(2)具有种属特异性;(3)治疗针对性强、疗效高;(4)稳定性差 (5)基因稳定性;(6)免疫原性;(7)体内半衰期短;(8)受体效应;(9)多效性和网络性效应;(10)检验的特殊性。 第三节 生物技术制药 1、生物技术制药的特征:高技术、高投入、长周期、高风险、高收益。P5 2、生物技术在制药中的应用有哪些,P7 (1)基因工程制药:? 开发基因工程药物，如干扰素(IFN)、红细胞生成素(EPO)等 ?基因工程疫苗，如乙肝基因工程疫苗 ?基因工程抗体，它可以作为导向药物的载体 ?基因诊断与基因治疗?应用基因工程技术建立新药的筛选模型 ?应用极影工程激活素改良菌种，产生新的微生物药物 ?改进药物生产工艺 ?利用转基因动、植物生产蛋白质类药物。 (2)细胞工程制药?单克隆抗体技术 ?动物细胞培养 ?植物细胞培养生产次级代谢产物。 (3)酶工程制药 :酶与细胞的固定化及酶转化制药 (4)发酵工程制药:发酵工艺改进、新药研制、菌种改造。 第二章 基因工程制药 第一节 概述(略) 第二节 基因工程药物的生产过程P15 1、基因工程技术:将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工程菌(或细胞)，实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。 2、基因工程药物制造的主要程序 (过程)(重点和后面几节联系起来) (1)目的基因的克隆(分离目的基因):通过逆转录、反转录-聚合酶链式反应、化学合成方法来制备cDNA，再通过核酸探针杂交或免疫反应来筛选目的基因(2)目的基因与载体连接构建DNA重组体:通过限制性内切酶DNA连接酶等核酸酶，把目的基因组入载体的相关克隆位点，常用的载体有质粒载体和噬菌体载体(3)将DNA重组体转入宿主菌构建工程菌:常用的宿主菌有大肠杆菌、酵母菌等，先使宿主菌处于感受态，再通过转化、转导等方式把重组DNA导入宿主菌，以构建工程菌(4)工程菌发酵:提供适当的培养基、反应器、控制好发酵过程中的各种参数，如温度、PH、溶氧等，并通过升温来诱导产物表达(5)目的基因表达产物的分离纯化:通过固液分离、初步纯化、高度纯化、成品加工来制备产品;若是胞内产物需要细胞破碎，若是包涵体则需要变性和复性(6)产品的检验:检测产品的质量和性能 。 第三节 目的基因的获得 1、利用基因工程生产蛋白质或多肽需要得到其基因，制备目的基因常用的方法有哪些,P16 (1)逆转录法 以mRNA为模板，经逆转录的到cDNA，构建cDNA文库，从cDNA文库中筛选目的基因。由于RNA转录加工过程中，内含子序列已被剪切掉，因此，cDNA文库中无内含子，适于在原核系统中表达。但是，cDNA只包含蛋白质的结构基因部分，缺少有关的调控序列，因此在原核系统中表达，还需要根据表达载体的结构，配以相应的调控序列。 (2)利用反转录-聚合酶链式反应制备基因 (3)化学合成法:只适用于克隆小分子肽的基因 2、利用逆转录法获得目的基因的基本过程P16 (1)mRNA的纯化 :从表达目的基因的细胞中提取总RNA，用寡聚脱氧胸苷(dT)纤维素柱从总RNA中提取纯化mRNA。 (2)cDNA的合成 :以mRNA为模板，利用逆转录酶合成cDNA第一链，再用DNA聚合酶合成cDNA的双链。 (3)cDNA克隆:利用合适的连接方法，将产生的双链cDNA片段插入到合适的载体中。 (4)构建cDNA文库 :将cDNA与载体连接的重组体转入大肠杆菌中，产生的克隆群体为cDNA文库。 (5)从cDNA文库中筛选目的基因 :得到cDNA文库后，通常采用核酸探针杂交法和免疫反应鉴定法从数以万计的DNA片段中筛选出目的基因。 3、载体分为:表达型载体和非表达型载体。P17 第四节 基因表达 1、基因表达:指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。P20 2、基因高效表达研究:指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下外源基因片段，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得原生物活性又可高产的表达产物。P20 3、基因表达的微生物宿主细胞分为两大类:P21 第一类为原核细胞(常用的有大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌等); ?大肠杆菌(目前仍是基因工程研究中采用最多的原核表达体系):表达基因产物形式多样，大肠杆菌中的表达不存在信号肽，产品多为胞内产物，提取困难。因分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体，表达产物需经变性复性才恢复活性。蛋白质不能糖基化。产物蛋白质N端多余一个蛋氨酸残基。其内毒素很难除去。 ?枯草芽胞杆菌:分泌能力强，蛋白质不形成包含体。产物蛋白质不能糖基化。有很强的胞外蛋白酶对产物降解。 ?链霉菌:作为外源性基因表达受到重视。不致病、使用安全、分泌能力强、表达产物可糖 基化。 第二类为真核细胞(常用的真核微生物有酵母、丝状真菌等) ?酵母:酵母菌是研究基因表达最有效的单细胞真核微生物。其基因组小，世代时间短，有单倍体双倍体两种形式，繁殖迅速，无毒性。能外分泌，产物可糖基化。已有不少真核基因成功表达 ?丝状真菌:分泌能力强，能正确进行翻译后加工(肽剪切糖基化)有成熟的发酵和后处理工艺。 4、目前使用最广泛的宿主菌是大肠杆菌和酿酒酵母。P22 5、大肠杆菌基因表达载体P23 (1)pBV220系统 pBV220系统国内使用最多的载体,其组成:?来源于pUC8多克隆位点;?核糖体rrnB基因终止信号;?pBR322第4225,3735位;?pUC18第2066,680位;?λ噬菌体cIts857抑制子基因及PR启动子;?pRC23的PL启动子及SD序列 (2)pET系统 6、影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素P22 外源基因表达产量与细胞浓度和细胞表达产量呈正相关。单个细胞产量取决于: (1)外源基因的剂量 :一般来说细菌内基因拷贝数增加，基因的表达产物也增加。 (2)外源基因的表达效率 ? 启动子的强弱: 启动子是在转录水平上影响基因表达的因素。需要寻找强的启动子。 ? 核糖体结合位点的有效性:大肠杆菌核糖体结合位点对真核基因在细菌中的高效表达是十分重要的。 ? SD 序列和起始密码ATG的间距 :表达非融合蛋白的关键是原核SD序列和真核起始密码ATG之间的距离，距离过长过短都影响真核基因的表达。 ? 密码子组成:应选择使用大肠杆菌偏爱的密码子。 (3)表达产物的稳定性: (4)细胞的代谢负荷 :必须使宿主细胞的代谢负荷不至过重，又能高效表达出外源基因产物。 (5)工程菌的培养条件 外源基因的高水平表达，不仅涉及宿主、载体和克隆基因三者之间的相互关系，而且与其所处的环境条件息息相关，必须进行优化。 7、真核基因在大肠杆菌中的表达形式P26 ?以融合蛋白的形式表达药物基因 以原核多肽和真核蛋白结合在一起称融合蛋白。 优点:操作简便，表达蛋白在菌体内稳定，易实现高效表达; 缺点:只能作抗原用。 ?以非融合蛋白的形式表达药物基因 非融合蛋白指在大肠杆菌中表达的蛋白质以真核蛋白的mRNA的AUG为起始，在其氨基端不含细菌多肽序列。 优点:保持原有蛋白活性; 缺点:易被蛋白酶破坏。 ?分泌型表达药物基因(外源基因融合到编码原核蛋白信号肽序列的下游) 优点:在周质中稳定，有活性，不 含蛋氨酸残基; 缺点:产量不高， 信号肽不被切割。 8、载体相关定义 载体:在基因工程重组DNA技术中将DNA片段(目的基因)转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。 克隆载体:从病毒、质粒或高等生物细胞中获取的DNA作为载体，在其上插入合适大小的外源DNA片段，将重组后的载体引入到宿主细胞中，并在宿主细胞中大量繁殖。 表达载体:在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件(如启动子、RBS、终止子等)，是目的基因能够表达的载体。 穿梭载体:指含有两个亲缘关系不同的复制子，能在两种不同的生物中复制的载体(例如既能在原核生物中复制,又能在真核生物中复制的载体)。 9、载体的复制系列可分四类: P27 (1)Yep类(酵母附加体质粒)(2)YRp类(酵母复制型质粒) (3)YCp类(酵母着丝粒质粒)(4)YIp类(酵母整合型质粒) 10、影响目的基因在酵母菌中表达的因素 ?外源基因的拷贝数 ?外源基因的表达效率:?启动子 ?分泌信号的效率 ?终止序列的影响 ?外源蛋白的糖基化 ?宿主菌株的影响:?菌体生长力强 ?菌体内源蛋白酶要较弱 ?菌体性能稳定 ?分泌能力强 11、精确表达载体P28 酵母载体有两类:普通表达载体和精确表达载体。 精确表达载体:要求在启动子或前导肽编码序列的适当部位有内切酶位点，以利于接入外源基因，并使它在表达和加工后氮末端氨基酸序列与天然产物相同，既无多余的氨基酸，也无缺失的氨基酸的克隆载体。 第五节 基因工程菌生长代谢的特点 1、碳源物质为细胞提供能量，当菌体生长所需能量大于菌体有氧代谢提供的能量时，菌体会产生乙酸，导致培养基的pH值下降，从而影响菌体的生长。适当提高pH，可减少乙酸的抑制作用;P31 第六节 基因工程菌的不稳定性 1、质粒不稳定分为那两类,P32 工程菌在传代过程中经常出现质粒不稳定的现象，质粒不稳定分为分裂不稳定和结构不稳定。 质粒的分裂不稳定是指工程菌在分裂时出现一定比例的不含质粒的子代菌的现象。与含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率;这两种菌比数率差异的大小有关 质粒的结构不稳定是指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。 基 2、提高质粒稳定性的方法P33 (1)选择合适的宿主菌:遗传稳定(2)选择合适的载体:高拷贝数;(3)选择压力:如加抗生素提高稳定性;(4)分阶段控制培养:先使菌体生长至一定密度;再诱导外源基因的表达 (5)控制培养条件 (6)固定化 第八节 重组工程菌的培养 1、基因工程菌的培养方式P36 (1) 分批培养 (2)补料分批培养:将种子接入发酵反应器中进行培养,经过一段时间后间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的方法。 (3)连续培养 (4)透析培养 (5)固定化培养 2、基因工程菌的培养工艺P37 (1) 培养基的影响(2) 接种量的影响(3)温度的影响(4)溶氧量的影响(5)诱导时机的影响(6)诱导表达程序的影响:一般在对数生长期或对数生长后期升温诱导表达。 (7) pH的影响:生长pH在6.8,7.4左右，后期外源蛋白的表达其最佳pH为6.0,6.5。 第九节 高密度发酵 1、什么是高密度发酵,影响高密度发酵的因素有哪些,可采取哪些方法实现高密度发酵,P41 (1)高密度发酵:一个相对概念，一般指培养基中工程菌的菌体浓度在50gDCW/L以上，理论上的最高值可达200gDCW/L。 (2)影响高密度发酵的因素:培养基;溶氧浓度;pH;温度;代谢副产物 (3)实现高密度发酵的方法P43 ?发酵条件的改进 a.培养基的选择(普遍采用6g/L的甘油为碳源);b.建立流加式培养的方式;c.提高供氧能力 ?构建出产乙酸能力低的工程化宿主菌 a.阻断乙酸产生的主要途径;b.对碳代谢流进行分流;c.限制进入糖酵解途径的碳代谢流;d.引入血红蛋白基因 ?构建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌 第十节 基因工程药物的分离纯化 1、表达的产物都是多肽或蛋白质 ，它的制得具有以下特点:P46 (1)表达产物在初始料中含量较低;(2)含有大量细胞及代谢产物;(3)表达产物稳定性差，易失活变性;(4)表达产物的种类繁多、结构不一、活性各异;(5)对其质量要求纯度高、无菌、无热原。 2、分离纯化的基本过程 若是论述题最好对过程进行一定的介绍 3、建立分离纯化工艺的根据P46 (1)含目的产物的起始料的特点 基因工程菌的发酵产物其上游过程的各种因素对分离、纯化工艺有影响。包括:?菌种的类 型及其代谢特性。?原材料培养基的来源及其质量。?生产工艺及条件。 (2)物料中杂质的种类和性质。 (3)目的产物特性。 (4)产品质量的要求 4、细胞破碎与固液分离 ?细胞收集: 离心法、膜分离法。 ?细胞破碎:机械破碎法、非机械破碎法;物理法、化学法、生物法 ?固液分离:离心、膜过滤、双水相萃取 5、细胞破碎的方法;P47 (1)物理方法:匀浆法、珠磨法、超声波法 (2)化学法:渗透冲击法(高渗+低渗)、增溶法(表面活性剂等) (3)生物法:酶溶法 6、分离纯化常用的色谱分离方法有那些,P50 分离纯化主要依赖色谱分离方法。色谱技术是医药生物技术下游过程精制阶段的常用手段，其优点是该法具有多种多样的分离机制、设备简单、便于自动化控制和分离过程中无发热等 有害效应。色谱技术分为离子交换色谱、疏水色谱、反相色谱、亲和色谱、凝胶过滤色谱、高 压液相色谱等。 (1)离子交换层析P51 离子交换介质由三部分构成:(1)不溶性高分子聚合物—载体;(2)共价键结合于载体上---活性基团或功能集团(3)与活性基团带相反电荷---平衡离子或反离子(决定是阴离子交换树脂还是阳离子交换树脂)如:酸性阳离子交换树脂R-SO3H 蛋白质的等电点和表面电荷的分布主要影响离子交换的性能。 它由平衡、上样、洗脱(分为梯度洗脱和阶段洗脱2种)、再生4个主要步骤构成。 (2)疏水层析P54 利用蛋白质分子表面上的疏水区域和介质中的疏水基团之间的相互作用，无机盐的存在能使相互作用力增强。流动相为pH6,8盐水溶液。常用的介质是多聚糖(如琼脂糖)和硅胶。 (3)亲和层析P4756 亲和层析是利用固定化配基与目的蛋白质之间特异的生物亲和力进行吸附，如抗体与抗原、受体与激素、酶与底物之间的作用。洗脱时分为特异性洗脱和非特异性洗脱。 (4)凝胶过滤层析P59 凝胶过滤是以具有大小一定的多孔性凝胶作为分离介质，小分子能进入孔内，在柱中缓慢移动，而大分子不能进入孔内，快速移动，大分子量物质先流出，小分子物质后流出。利用这种移动差别可使大分子与小分子分开。 7、用于分离纯化的技术应满足那些要求,P62 (1)技术条件温和，能保持目的产物的生物活性。 (2)选择性好，能从复杂的混合物中有效地将目的产物分离出来，达到较高纯化倍数。 (3)收率要高。 (4)两个技术之间不需要对物料加以处理或调整，这样可以减少工艺步骤。 (5)整个分离纯化过程要快速，能够满足高生产率的要求。 第十一节 变性蛋白的复性 1、外源基因在大肠杆菌中的高表达常常导致包涵体的形成P63 2、包涵体:指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。 3、包涵体的分离和溶解P63 (1)包涵体的分离:重组菌破碎后，离心得沉淀部分，再用低浓度变性剂(脲或盐酸胍)、 去垢剂(Triton X-100)、脱氧胆酸钠洗涤。 (2)包涵体溶解:般用强的变性剂如脲(6-8M)、盐酸胍(6M)，或用去垢剂，如SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物等，溶解涵体蛋白质。 (3)包涵体复性:稀释复性和透析复性;含二硫键的蛋白的复性;封闭蛋白的疏水蔟促进复性;凝胶过滤层析复性;小分子添加剂促进的复性;分子伴侣或折叠酶促进的复性;人工分子伴侣的复性 第十二节 基因工程药物的质量控制 1、由基因重组技术所获得的蛋白质药物产品进行鉴定时，常作那些项目分析,P68 (1)肽图分析 肽图分析是用酶法或化学法降解目的蛋白质后，对生成的肽段进行的分离分析。它是一种可检测蛋白质一级结构中细微变化的最有效方法，该技术灵敏高效的特点使其成为对基因工程 药物的分子结构和遗传稳定性进行评价和验证的首选方法。 (2)氨基酸成分分析 在氨基酸成分分析中，一般含50个左右的氨基酸残基的蛋白质的定量分析是接近理论值的，即与序列分析结果一致。 (3)部分氨基酸序列分析 部分氨基酸序列分析(N端15个氨基酸)可作为重组蛋白质和多肽的重要鉴定指标。 (4)重组蛋白质的浓度测定和分子量测定 蛋白质浓度测定方法主要有凯氏定氮法、双缩脲法、染料结合比色法、福林-酚法和紫外法等。蛋白质分子量测定最常用的方法有凝胶过滤法和SDS-PAGE法，凝胶过滤法是测定完整的蛋白质分子量，而SDS-PAGE法测定的是蛋白质亚基的分子量。 (5)蛋白质二硫键分析 二硫键和巯基与蛋白质的生物活性密切相关，基因工程药物产品的硫-硫键是否正确配对 是一个重要问题。 第三章 动物细胞制药 第一节 概述 细胞工程:是指以细胞为对象，应用生命科学理论，借助工程学原理与技术，有目的地利用或改造生物遗传特性，以获得特定的细胞、组织产品或新型物种的一门综合性科学技术。P79 第二节 动物细胞的形态和生理特点(重点) 1、离体培养的动物细胞分为那些类型,P81 动物细胞适应功能,形态各异。离体培养细胞分两类:贴壁细胞;悬浮细胞 (1)贴壁细胞 生长须有贴附的支持物表面， 自身分泌或培养基中提供的贴 附因子才能在该表面上生长。两种形态: 成纤维细胞型和上皮细胞型 (2)悬浮细胞: 生长不依赖支持物表面，在培养液中呈悬浮状态生长。如淋巴细胞。 (3)兼性贴壁细胞:生长不严格依赖支持物。如中国地鼠卵巢细胞，小鼠L929细胞。 2、什么是接触抑制现象,P84 当细胞在基质上分裂增殖，逐渐汇合成片时，即每个细胞与其周围的细胞相互接触时， 细胞就停止增殖。此时若能保持充足的营养，细胞仍可存活相当一段时间，但细胞密度不再 增加，所以该现象又称之谓接触抑制或密度依赖抑制现象。一旦细胞转化为异倍体后，该现 象随之消失，细胞可多层生长。细胞密度也就可大大增加。 3、动物细胞的生理特点P83 (1)细胞的分裂周期长 动物细胞分裂所需的时间一般为12,48h，它不仅随细胞种属的不同而不同，就是同一种属的，不同部位的细胞其所需的时间也不同。周期=间期+分裂期 间期(G1+S+G2) 分裂期(M) (2)细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象 (3)正常二倍体细胞的生长寿命是有限的 (4)动物细胞对周围环境十分敏感。动物细胞对各种物理化学因素，如渗透压，pH，离子浓度，剪切力，微量元素等的变化耐受力很弱。 (5)动物细胞对培养基的要求高 氨基酸、维生素，多种无机盐和微量元素，细胞生长因子、贴壁因子。 (6)动物细胞对蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同 动物细胞的蛋白质合成除了在游离的核糖体上进行外，还在与糙面内质网上结合的核糖 体上进行。(游离核糖体合成蛋白质用于细胞质基质内。粗面内质网的核糖体合成蛋白质是分泌的和膜中的整合蛋白多为糖蛋白。) 3、动物细胞作为宿主细胞生产药物的特点;P85 (1)优点:产品多分泌在胞外，收集纯化方便，得到较完善的翻译后修饰，特别是糖基化，因此与天然产品更一致，适于临床 (2)缺点:培养条件要求高，成本贵，产量低 第三节生产用动物细胞的要求和获得 1、生产用动物细胞的种类及其特点P86 用于生产的动物细胞有三类，即原代细胞、已建立的二倍体细胞系、以及可无限期传代 的转化细胞系，以及用这些细胞进行融合和重组的工程细胞。 (1)原代细胞 原代细胞是直接取自动物组织、器官，经过分碎，消化而获得的细胞悬液。用得最多的是鸡胚细胞，原代兔肾或鼠肾细胞，以及血液的淋巴细胞。 (2)二倍体细胞系 原代细胞经过传代、筛选、克隆，从而从多种细胞成分的组织中挑选，并纯化出某种具有一定特征的细胞株。该细胞株仍具备“正常”细胞的特点，一般均从动物的胚胎组织中获取。 (3)转化细胞 这类细胞是通过某个转化过程形成的，它常常由于染色体的断裂变成了异倍体，从而失去了“正常”细胞的特点，而获得了无限增殖的能力。由于转化的细胞具有无限生命力，而且常常倍增时间较短，对培养条件和生长因子等要求较低，故更适于大规模工业化生产的需要。 (4)其他:融合细胞系(物理法如高压电场和化学法如仙台病毒、聚乙二醇)和重组工程细胞系 2、真核细胞基因表达载体的构建，使用的载体有两类:(1)病毒载体:牛痘病毒、腺病毒、逆转录病毒、杆状病毒;(2)质粒载体:穿梭质粒载体P88 3、重组DNA导入动物细胞的常用方法:融合法、化学法、物理法、病毒法，最常用磷酸钙沉淀法、 电穿孔法P89 4、生产用的工程细胞必须建立两个细胞库:原始细胞库(MCB)、生产用细胞库(MWCB)或工作细胞库(WCB)P91 第四节 动物细胞的培养条件和培养基 1、动物细胞的培养条件P92 (1)器材的清洗和消毒 ?器材的清洗:浸泡、刷洗、泡酸、冲洗 ?器材的消毒灭菌: 物理消毒/化学消毒 (2)水质 :电阻值大于18MΩ,去热原。 (3) pH:7.2,7.4 (4)渗透压:290,300mOsm/kg (5)温度:哺乳动物37?0.5 C; (6)空气:氧的饱和质60%,氧分压 4,0.7kPa 2、培养动物细胞的培养基的种类和组成P95 动物细胞培养基大致可以分成三类:天然培养基，合成培养基和无血清培养基。 (1)天然培养基:血清、羊水、腹水等,成分复杂、成分不稳定 (2)合成培养基:成分明确、大量供应，DME、MEM、DMEM等(第一个合成培养基是199培养基;?氨基酸:12种必需氨基酸+谷氨酰胺?维生素:形成辅基和辅酶?糖类:能源，用葡萄糖和谷氨酰胺?无机盐:维持渗透压?其它成分:核酸前体和氧化还原剂如谷胱甘肽?添加5%,10%小牛血清:作用是提供生长因子和激素;提供贴附因子和伸展因子;提供结合蛋白;提供必需脂肪酸和微量元素 (3)无血清培养基: 无血清培基的优点如下:? 提高了细胞培养的可重复性，避免了由于血清批间差异的影响。 ? 减少了由血清带来病毒、霉菌和支原体等微生物污染的危险。? 供应充足，稳定。? 细胞产品易于纯化。? 避免了血清中某些因素对有些细胞的毒性。? 减少了血清中蛋白对某些生物测定的干扰，便于对实验结果的分析。(简答题时候可以不写优点) 无血清培养基加入添加剂:生长因子和激素(胰岛素);结合蛋白(鉄传递蛋白和白蛋白);贴附因子和伸展因子(胶原等);有利细胞生长的因子和元素(谷胱甘肽) 第五节 动物细胞培养的基本方法 1、细胞传代;P101 原代培养形成的单层细胞汇合以后，需要进行分离培养，否则细胞会因生成空间不足或由于细胞密度过大引起营养枯竭，都将影响细胞的生长，这一程序常称为传代或传代培养。 传代方法: (1)悬浮细胞:加生长液，然后分种 (2)贴壁生长细胞传代:采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25,的胰蛋白酶液。 第六节 动物细胞大量培养方法和操作方式 1、动物细胞大规模培养的方法P103 (1)悬浮培养 悬浮培养即让细胞自由地悬浮于培养基内生长增殖。优点是操作简便，培养条件比较均一，传质和传氧较好，容易扩大培养规模，不但细胞体积较小，较难采用灌流培养，因此细胞密度一般较低。 (目前在生产中用于悬浮培养的设备主要是通气搅拌罐式生物反应器和气升式生物反应器。) 2(贴壁培养 贴壁培养是必须让细胞贴附在某种基质上，细胞才能生长繁殖的培养方法。较容易采用灌流 培养的方式使细胞达到高密度。但操作比较麻烦，需要合适的贴附材料和足够的面积，培养条件不易均一，传质和传氧较差。 3(贴壁—悬浮培养 ? 微载体培养:可创造相当大的贴附面积供细胞贴附生长增殖，载体的体积很小，比重较轻，在轻度搅拌下即可携带细胞自由地悬浮在培养基内。 ? 包埋和微囊培养:包埋和微囊培养培养细胞不是贴附在载体表面，而是被包埋或包裹在凝胶载体或微囊内。 包埋或包裹在载体或微囊内的细胞可获得保护，避免了剪切力的损害; 可以获得较高的细胞密度;可采用多种生物反应器进行大规模培养。 (目前最普遍的是琼脂糖和海藻酸钙凝胶) ? 结团培养 :结团培养的实质是用细胞本身作为基质，相互贴附后，再用悬浮的方法进行培养，所以它也是一种贴附—悬浮培养。该培养方法操作简便，节省了微载体的成本。 2、动物细胞培养的操作方式;P106 动物细胞培养的操作方式一般可分为分批式、加料—分批或流加式、半连续式、连续式和灌流式。 (1)分批式操作 (一种是将细胞和培养基一次性加入反应器内进行培养，此后细胞不断增长，产物不断形成和积累。最后将条件培养基，即经培养已含有细胞产物的培养基，或连同细胞一并取出，培养结束。另一种是先将细胞和培养基加入反应器，待细胞生长至一定密度后，往反应器内加入诱导剂或病毒等，经一段时间作用后，将反应物取出。) (2)半连续式操作 (该方式是当细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一 段时间，取出部分培养物，或单纯是条件培养基，或连同细胞、载体一起，然后补充同样数 量的新鲜培养基，或另加新鲜载体，继续培养。该操作方式在动物细胞培养和药品生产中被 广泛采用。) (3)灌流式操作 (该方式是当细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，不断地将 部分条件培养基取出，同时不断地补充新鲜培养基。它与连续式操作不同处，在于取出部分 条件培养基时，绝大部分细胞仍保留在反应器内，而连续式培养则同时也取出部分细胞。) 括号部分的内容重在理解 第七节 动物细胞生物反应器 1、动物细胞生物反应器必需具备的基本要求;P107 (1)一切材料，对细胞必须无毒性。(2)具有良好的传质、传热和混合的性能。(3)密封性能良好(4)对多种物理化学参数能自动检测、调节和高精度控制(5)可长期连续运转 (6)容器内面光滑，无死角(7)拆装、连接和清洁方便，能耐高压蒸汽消毒，便于操作维修。设备成本尽可能低。 2、动物细胞生物反应器的类型及特点;P108 (1)搅拌罐式生物反应器(目前最广泛应用的动物细胞反应器):靠搅拌桨提供液相搅拌的动力，它有较大的操作范围、良好的混合性和浓度均匀性 (2)气升式生物反应器:其特点是结构简单，操作方便。 (3)固定床式生物反应器:结构简单、装填材料无毒且利于细胞贴壁，剪切力小的特点 (4)流化床式生物反应器 :可连续操作 (5)袋式或膜式生物反应器:可取出某些有害代谢物 (6)中空纤维生物反应器:用途较广，既可培养悬浮生长的细胞，又可培养贴壁依赖性细胞，细胞的密度高，如果控制系统不受污染，能长期运转。 3、反应器及检测;P114 (1)温度检测元件:电阻温度计;(2)PH:复合式参比电极 (3)溶氧:极普电极或电流式覆膜电极 第十节 动物细胞制药的前景与展望 1、动物细胞制药有哪些新进展,P135 (1)改进表达载体，提高表达水平和产量:?采用更强的启动子和增强子?更好的利用扩增系统或寻找高表达位点?采用和改造更好的宿主细胞 (2)利用代谢工程，改进培养工艺，降低生产成本:?采用代谢工程改造工程细胞?改进 培养工艺，降低生产成本 (3)抑制细胞凋亡，延长培养周期 (4)采用糖基化工程，提高产品质量 (5)转基因动物的研究 (6)组织工程的研究 2、代谢工程:采用基因工程的手段，使工程细胞增加或减少某种酶，改造它的代谢能力和途径，使其降低对某些营养物质的需求，减少某些代谢产物的产生和无害，以及控制工程细胞的增殖速度和制造产品的能力。P137 第四章 抗体制药 第一节 概述P143 1、抗体:即Ig，指能与相应抗原特异性结合具有免疫功能的球蛋白。 2、1975年Kohler和Milstein首先利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备出单克隆抗体(McAb)。 3、单克隆抗体:将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞相融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而产生的特异性完全相同的高纯度抗体。 单克隆抗体有缺陷:分子量过大;鼠源性抗体;所以要改造:降低单克隆抗体的免疫源性和降低其相对分子量。P144 第二节 单克隆抗体及其制备(重点) 1、克隆化:指单个细胞通过无性繁殖而获得细胞集团的整个培养过程。P148 2、什么是单克隆抗体,它是如何制备的,P144 (1)抗原与动物免疫 ?制备高纯度抗原:抗原可以用化学合成，如精制地高辛。 多数抗原物为混合物须经免疫、筛选、克隆化。 ?用抗原免疫脾细胞的制备 :有体内免疫法和体外免疫法 。体内免疫就是将抗原注射到小鼠腹腔，使小鼠产生免疫反应，B细胞迅速增殖;体外免疫小鼠脾细胞的悬浮液与抗原一起培养后，再分离脾细胞。 (2)细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养 ?骨髓瘤细胞:和免疫动物同源，目前常用的骨髓瘤细胞系多来自BALB/c小鼠(最常用)和 LOU大鼠。 87?脾细胞和骨髓瘤细胞融合:脾细胞(1×10)和骨髓瘤细胞(2×10)混合，在聚乙二醇诱导下融合2分钟，然后用培养液将融合液缓慢稀释。(常用PEG相对分子量4000，浓度为40-50%， 二甲基亚砜增加融合率) ?选择性培养:选择培养基 为HAT培养液。 次黄嘌呤(H)氨甲喋呤(A)胸腺嘧啶(T)配制。其上脾—瘤融合细胞可以生长，脾—脾、、瘤—瘤融合细胞死亡。(培养基中需要加入饲养细胞才能繁殖，常用饲养细胞是小鼠腹腔巨噬细胞、脾细胞、胸腺细胞等) (3)筛选阳性克隆与克隆化 ?筛选阳性克隆常用检测方法:免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫技术等。 ?克隆化:有限稀释法(将对数生长期的杂交瘤细胞用培养液作一定的稀释后，按每孔1个细胞接种在培养皿中，细胞增值后成为单克隆细胞系。)和软琼脂法(将杂交瘤细胞稀释到一定密度，然后与琼脂混悬。在琼脂中的细胞不能自由移动，彼此互不相混，从而达到单细胞培养的目的) (4)杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定 杂交瘤细胞鉴定:染色体分析。另外还检测抗体特异性、纯度、分子量等。 (5)单克隆抗体的大量制备 ?体外培养法和体内诱生法，多采用后者 ?体内诱生法:降脂烷注射小鼠腹腔后再接种杂交瘤细胞，取腹水，离心 ，取上清。 (6)单克隆抗体的纯化 依单抗IgG类和亚类不同，选各种不同的纯化方法。 体内诱生法单克隆抗体的纯化方法: ?离心 取上清，超滤，盐析。 ?分离:凝胶过滤用于IgG IgM单抗纯化;阴离子交换层析IgG单抗纯化;亲和层析 IgG单抗纯化。 3、ELISA法:酶联免疫吸附试验，基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体 ( 聚苯乙烯微量反应板 ) 表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。原理:酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。此种酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。P147 第三节 基因工程抗体及其制备 (即鼠源性单克隆抗体的改造) 1、基因工程抗体:过 PCR 技术获得抗体基因或抗体基因片段，与适当载体重组后引入不同表达系统所产生的抗体，被广泛应用于疾病的临床临床诊断、预防、治疗及基础理论研究等领域。 P150 2、Ig分子结构P150 (1)由2条重链(简称H链)和2条轻链(简 称L链)组成"Y"字型结构分子，链与链之 间由一对或一对以上的二硫键互相连接 (2)Ig分子氨基酸端L链的1/2与H链的 1/4的氨基酸组成及顺序多变，构成可变区 (简称V区)，V区中某些特定位置构建抗体 和抗原特异结合的关键部位，称为互补决定 区(CDR)它赋于抗体以特异性。 (3)羧基端L链的1/2与H链的134的氨 基酸组成及顺序较恒定，构成恒定区(简称C 区)，它决定Ig分子的异种抗原性。 (4)L链有V和C连个功能区，H链有LL V、C、C、C四个功能区，V和V的CDR区共同构成一个抗原结合部位。 HH1H2H3LH 3、基因工程抗体及其特性和制备方法(P152图4-4) (1)人鼠嵌合抗体:在基因水平上将鼠源单抗的H 和L链可变区(V区)基因分离出来，分别与人Ig的H 和L链的稳定区(C)基因连接成人-鼠嵌合抗体的H 和L链基因，再共转染骨髓瘤细胞，就能表达完整人-鼠嵌合抗体。人IgC-小鼠IgV (2)改形抗体(CDR移植抗体):用鼠源单抗的CDR序列替换人Ig 分子中CDR序列，则可使人的Ig 分子具有鼠源单抗的抗原结合特异性。可消除免疫源性。小鼠CDR替代人CDR (3)Fab抗体:重链V区及CH1功能区与整个轻链以二硫键形式连接而成，主要发挥抗体的抗原结合功能。Fab抗体只有完整IgG的1/3。(Fd:重链V区及C功能区)完整L链+H1 重链V区+C功能区 H1 (4)Fv抗体:由V和V组成的具有完整抗原结合位点的最小抗体片段;V+V HLHL(5)单链抗体:即scFv，由V和V通过连接肽(接头)重组并表达而成的一种小分子抗HL 体，其分子量为整个Ig分 子的1/6具有较好的抗原结合能力，且分子量小、穿透力强、免疫原性低等特性。V-多肽-V HL (6)单域抗体:只有V或V一个功能结构域，也能保持原单克隆抗体的特异性。其分子HL 量仅为整个Ig分子的1/12。V或V HL (7)最小识别单位:即MRU，只含有一个CDR多肽的抗体，也为超变区多肽。 第四节 多功能抗体及其制备 1、双功能抗体:bisFvs，即双特异性单链抗体，(天然Ig是由两个完全相同的V和V区HL域构成，该区域是特异性识别并结合抗原的关键部位)经人工设计构建的双特异性抗体由两个不同的抗原结合位点组成，可同时与两种不同的抗原决定簇结合，并可将其偶连的药物、酶或放射性核素等导向到靶部位，这种具有双价双特异性的抗体又称为双功能抗体。P155 2、多功能抗体:在scFv的基础上，可以把两个或两个以上的scFv重组在一起，由此可制备成多价小分子抗体即微型抗体(简称多价微抗)。P157 3、抗体融合蛋白:抗体的一部分被非抗体序列替代，所形成的融合蛋白具有新的特性，称之为抗体融合蛋白。P158 第五节 抗体工程 1、抗体工程:指利用重组DNA和蛋白质工程技术， 对抗体基因进行加工改造和重新装配，经转染适当的 受体细胞后，表达抗体分子，或用细胞融合、化学修 饰等方法改造抗体分子的工程。P159 现在普遍使用噬菌体作为抗体库技术的载体。 6(噬菌体抗体库技术基本方法(过程)P159 噬菌体抗体库技术:它是将体外克隆的抗体基因 片段插入噬菌体载体，转染工程细菌进行表达，然后 用抗原筛选即可获得特异的单克隆噬菌体抗体。 基本过程:噬菌体抗体库技术基本路线为用 RT-PCR方法扩增抗体全套可变区基因(V+ V)，HL 重组到噬菌体载体中，并通过与丝状噬菌体的外壳蛋 白形成融合蛋白，把Fab段或ScFv表达到噬菌体表 面。通过“吸附,洗脱,扩增”的富集过程，从中筛 选出特异性抗体的可变区基因。(右图) 第六节 抗体诊断试剂 一、三大类抗体诊断药物:血清学鉴定用抗体制剂、 免疫标记技术用抗体制剂、体内导向诊断药物。P161 二、抗体诊断药物有哪些类型,P161 1. 血清学鉴定用的抗体类试剂 (1)鉴定病原菌用的抗体试剂 (2)乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的反向被动血凝诊断试剂 (3)妊娠诊断试剂 (4)抗ABO血型系统血清 2、免疫标记技术用的抗体类试剂P164 给抗体标记放射性核素、荧光素或酶活性，能将抗原抗体反应放大，使常规不能观察的反应 得以显现，可对微量抗原进行定性定量测定，灵敏度提高。结合显微镜技术，还可对抗原物质作出组织内或细胞内的定位测定。 (1)荧光抗体诊断试剂:荧光抗体是用荧光色素,如异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明(RB200)、藻红素(PE)等标记抗体蛋白，即成荧光抗体。用荧光抗体浸染含有抗原物质的组织切片或细胞，荧光抗体就与抗原结合，在荧光显微镜下成为发光的可视物，从而达到诊断和定位的目的。 (2)免疫酶抗体诊断试剂:酶标诊断试剂 a、 HBsAg(乙型肝炎表面抗原)酶标诊断试剂 b、HBeAg(乙型肝炎e抗原)酶标诊断试剂 c、HAVAg(甲型肝炎病毒抗原)酶标诊断试剂 d、测定HIV(人免疫缺陷病毒)抗原的酶标诊断试剂 e、AFP(甲胎蛋白)酶标诊断试剂 f、CEA(癌胚抗原)酶标诊断试剂 (3)放射免疫用抗体诊断试剂 把放射性核素分析的高灵敏性与抗原抗体反应的特异性两大特点结合起来建立的检测技术。能测出ng/ml，甚至pg/ml水平的微量抗原物质。 常用的标记抗体试剂: a、 HBsAg放射性核素标记抗体诊断试剂: 125 I 标记，灵敏度0.1 ng/ml b、HBeAg放射性核素标记抗体诊断试剂: 125 I 标记，灵敏度0.1 ng/ml c、HAV抗原放射性核素标记抗体诊断试剂: 125 I 标记 d、 AFP放射性核素标记抗体诊断试剂: 125 I 标记，灵敏度1~5 ng/ml e、 CEA放射性核素标记抗体诊断试剂: 125 I 标记，灵敏度1 ng/ml 3、导向诊断药物 由于肿瘤的特异性小分子抗体尚在研究之中，所以导向药物还未爱临床广泛应用。 三、CD单克隆抗体系列P169 应用以单克隆抗体鉴定为主的方法，将来自不同实验室的单克隆抗体所识别的同一种白细胞分化抗原归称为CD(cluster of differentiation)。人CD的编号已从CD1命名至CD247，大致分为13组。 第七节 抗体治疗药物 1、抗体治疗药物有哪些,P173 以抗体为载体的导向治疗药物，还不成熟。 (1)放射性核素标记的抗体治疗药物 抗体作为放射性核素的导向载体，标记操作简便用量小。放射性核素标记的抗体对肿瘤细胞杀伤较大。 (2)抗癌药物偶联的抗体药物 ?常用的抗癌药物 氨甲喋呤(MTX)、阿霉素(ADM)、丝裂霉素(MMC)等。以人血浆白蛋白作为中间载体，可明显提高每分子抗体所携带的MTX量，使体外细胞毒性体高二倍。 ?抗体类药物逆转耐药性 (3)毒素偶联的抗体药物 在导向药物中，毒素和抗体的交联物称为免疫毒素。 ? 第一代免疫毒素是包含有A、B链完整毒素和抗体的交联物，其中B链非特异性结合，使其仅在体外应用。 ? 第二代免疫毒素是利用抗体或抗体片段与毒素的A链或与A链相似的单链核糖体失活蛋白的结合物。因避免了第一代免疫毒素的非特异性，故能在体内有一定的抗肿瘤作用。 ?第三代免疫毒素重组免疫毒素用基因克隆方法改造毒素基因和小分子抗体基因重组表达。特异性好、稳定性强、渗透性佳、免疫源性低、可大量制备。 (3)免疫毒素的临床应用 治疗肿瘤、自身免疫病，并能克复组织移植排斥反应，可单独给药也可包裹在脂质体及其它微粒中给药。 第五章 植物细胞制药 第一节 基本概念 1、植物细胞的全能性。P177 植物体中任何一个具有完整细胞核(完整染色体组)的细胞，在一定条件下都可以重新再分化形成原来的个体。 第二节 植物细胞工程发展简史(略) 第三节植物细胞的形态及生理特性 1、植物细胞是由细胞壁、原生质体、后含物三大部分组成P181 2、细胞壁、质体、液泡三部分是植物细胞特有的结构，动物细胞没有 3、植物培养细胞重量的增加主要取决于对数期，而次级代谢产物的积累主要在稳定期(植物细胞培养时期:延迟期、加速期、对数期、稳定期四个时期) 4、植物培养细胞的生理特性;P183 (1)生长阶段特征 , 延迟期:细胞数量不变，核酸及蛋白合成较快 , 加速期:最大生长期，最大细胞浓度 , 对数期:细胞数呈对数增加 , 稳定期:细胞高液泡化，非常脆弱 (2)植物细胞与动物细胞、微生物细胞比较 特征 哺乳动物细胞 植物细胞 微生物细胞 大小(μm) 10~100 10~100 1~10 生长 悬浮、贴壁 悬浮 悬浮 营养要求 很复杂 较复杂 很简单 生长速度(倍增时间:慢;15~100 慢;20~120 快;0.5~5 h) 细胞分化 有 有限分化 无 环境影响 非常敏感 敏感 一般 细胞壁 无 有 有 产物存在部位 胞内或胞外 胞内或胞外 胞内或胞外 产物浓度 低 低 高 含水量 - 约90 约75 供氧需求 1~25 20~30 100~1000 产物种类 疫苗、单抗、酶、生酶、天然色素、发酵食品、抗生素、 长因子、激素、免疫天然有机化合有机化合物、酶等 调节剂 物等 第四节 植物细胞培养的基本技术 1、植物材料的准备;P185 植物组织培养的外植体必须是无杂菌材料。植物组织培养时表面处理的常用灭菌剂是次氯酸钙、次氯酸钠、氯化汞。 2、植物细胞培养的培养基组成P186 (1)无机盐: ?大量元素:N, S, P, K, Mg, Ca, Cl, Na ?微量元素:Fe, Mn, Zn, Cu, Co, Ni等 (2)碳源:糖类，肌醇等;也可直接通过光合作用吸收CO2 (3)植物生长调节物质P189 ?生长素类: 吲哚乙酸(IAA)、 ?分裂素:6-苄基腺嘌呤(6-BA) 植物组织和细胞培养物的生长主要取决于生长素和分裂素的比例。高浓度生长素和低浓度分裂素刺激细胞分裂，而低浓度生长素和高浓度分裂素刺激细胞生长。 (植物激素:指植物代谢过程中形成的生长调节物质，在极低浓度(<1M)时即能调节植 物的生育过程，并能从合成部位转运到作用部位而发挥作用。植物激素是目前已发现植物组织中可以形成5种植物激素，即生长素、分裂素、赤霉素、脱落酸和乙烯。) (4)氮源:蛋白质水解产物或各种氨基酸。 (5)维生素:B族维生素、生物素、肌醇。 3、植物细胞大规模培养的方法及特点;P191 (1)大规模植物细胞悬浮培养 ?成批培养法(分批):最适于植物细胞培养的反应器是气升式反应器 将培养基一次性加入反应器中，接种、培养一定时间后收获细胞的操作方式 ?半连续培养:在反应器中投料和接种培养一段时间后，将部分培养液和新鲜培养基进行家换。 ?连续培养:利用连续培养反应器，在投料和接种培养一段时间后，以一定速度连续采集细胞和培养液，并以同样速度供给新鲜配演技以使细胞生长环境维持稳定。 (2)固定化培养 将细胞固定在固定化反应器上(内)，放入新鲜培养基中进行培养，或连续流入新鲜培养基，进行连续培养及收集产物，因将细胞固定，易于获得高密度细胞群体及维持细胞间物理化学梯度，易于细胞组织化，易于控制条件和获得较高含量次级代谢产物。 第五节 影响植物次级代谢产物激积累的因素 1、影响植物次级代谢产物积累的因素有哪些,P192 (1)生物条件:外植体、季节、休眠、分化等 (2)物理条件:温度、光(强度、时间、光质)、通气、PH和渗透压 (3)化学条件:无机盐、碳源、生长调节剂、维生素、氨基酸、核酸、抗生素、天然物质、前体等 (4)工业培养条件:培养罐类型、通气、搅拌、培养方法等 2、重要影响因素P193 (一)外植体选择:不同外植体的悬浮细胞培养物，其最大次级代谢产物的累积时间各异。 (二)培养条件的影响 (1)内在因素 ? 接种和诱导:次级代谢产物的产率与外肢体的大小、细胞密度与营养成分相关 ? 培养基的基本组成:培养基的各种成分是愈伤组织和悬浮培养细胞的物质基础，尤其是 稳定期的次级代谢产物的积累。(磷、氮;铜是次级代谢产物积累的必要元素) ? 碳源:糖是使用最广、作用最强的碳源，对次级代谢产物影响主要取决于使用的糖种类、糖浓度及其次级代谢产物的生物合成过程。 ? 植物生长调节剂:不同植物激素及其不同组合形式均可显著影响次级代谢产物的产生。 ? O和PH:植物细胞正常呼吸需要氧气，所以需要供氧;一般最利于培养植物细胞的PH2 在5~6 ? 渗出物:其它代谢产物也会影响产物产量 (2)外在因素 ?温度:代谢产物产生最佳温度是20~28?;? 搅拌频率:适宜 ? 培养容器 ?光:光照时间、光质、强度都有影响 (三)两步法培养:第一步 使用适合细胞生长的培养基(生长培养基)，第二步使用适合次级代谢产物合成的培养基(生产培养基)。P197 第六节 植物细胞培养的生物反应器 1、植物细胞反应器的选择取决于:生产细胞的密度、通气量、提供的营养成分的分散程度。P199 2、植物细胞大规模培养的生物反应器P201 (1)机械搅拌式生物反应器:反应器内温度、PH、溶氧及营养物物浓度易控制。 (2)鼓泡塔生物反应器:没有运动部件，操作不易染菌，有较高的热量和质量传递，容易放大，但是流动形式难以确定，混合不均。 (3)气升式生物反应器:低剪切力，混合与氧传递效果好，运动部件不易染菌，操作费用低，但是高密度培养时候混合不够均匀。 (4)转鼓式生物反应器:比较适合高密度培养，但是难于大规模操作，放大困难。 (5)固定化细胞生物反应器:细胞可长时间重复使用，保护细胞免受剪切力，以实现高密度培养，有利于次级代谢产物合成，易于连续化操作。 第七节 进展与展望 1、植物细胞培养有哪些新进展,P204 (1)诱导子在植物细胞工程中的应用:利用诱导子进行有目的次级代谢产物调控及生物合成。(诱导子:植物抗毒素是在植物防御系统内能对抗微生物进攻的某些次级代谢产物，触发形成植物抗毒素信号的物质称为诱导子。诱导子有两种分类，一种是根据在细胞内或细胞外形成而将其分为内源性诱导子和外源性诱导子;另一种是根据其来源分为生物诱导子和非生物诱导子。) (2)前提饲喂 (3)两相法培养:水相培养的基础上，加入固相或疏水相，形成两相培养系统，从而达到收集分泌物的目的。 (4)转基因技术 (5)植物生物转化技术与生物制药:生物转化既可以生产新的化合物，又可以改造已有化合物、增加目标产物产量。 (生物转化:利用离体培养细胞或器官及细胞器等对外源化合物进行结构修饰而获得有价值产物的生理生化反应) 第六章 酶工程制药 第一节 概述 1、酶工程:从应用的目的出发研究酶、应用酶的特异催化性能，并通过工程化将相应原料转化成有用物质的技术。P216 2、酶工程主要研究内容是什么,P216 (1)酶的分离、提纯、大批量生产及新酶的应用开发。(2)酶和细胞的固定化及酶反应器的研究。(3)酶生产中基因工程的应用及遗传修饰酶的研究。(4)酶的分子改造与化学修饰、以及酶的结构与功能之间关系的研究(5)有机相中酶反应的研究。(6)酶的抑制剂、激活剂的开发和应用研究。(7)抗体酶、核酸酶的研究。(8)模拟酶、合成酶及酶分子的人工设计、合成的研究。 3、目前工业上应用的酶大多采用微生物发酵法来生产。P217 4、应用最广泛的产酶菌:大肠杆菌、枯草杆菌、啤酒酵母、曲霉(黑曲霉和黄曲霉)。P218 5、酶法检测可分为:单酶反应、多酶偶联反应、酶标免疫反应。P218 第二节 酶和细胞固定化 1、固定化酶的特点和优点各是什么,P219 (1)固定化酶:限制或固定于特定空间位置的酶。 (2)固定化酶的特点:既具有生物催化剂的功能，又具有固相催化剂特性。 (3)优点:?可多次使用; ?反应后，酶底物产物易分开，产物中无残留酶，易纯化，产品质量高;?反应条件易控制;?酶的利用效率高;?比水溶性酶更适合于多酶反应。 缺点:?酶活力有损失?成本增加?只适应可溶性第五，且小分子底物?胞内酶需分离纯化?与完整菌相比不适宜多酶反应。 2、固定化细胞的特点和优缺点各是什么,P225 (1)固定化细胞:将细胞限制或定位于特定空间位置的方法。 (2)特点:有细胞特性，既有生物催化剂功能，又有固相催化剂特点。 (3)优点: ?无须进行酶的分离纯化?保持酶的原始状态，酶回收率高;?比固定化酶稳定性高;?细胞内酶附助因子可再生;?细胞本身含多酶体系;?抗污染能力强 缺点:?副产物多?细胞的壁、膜和载体都存在扩散限制作用?载体的空隙大小影响高分子底物的通透性 3、酶和细胞的固定化方法P220 (1)载体结合法:将酶结合于不溶性载体上的固定化方法 ?物理吸附法:用物理方法将酶吸附于不溶性载体(如活性炭等)上的固定化方法。 ?离子结合法:酶通过离子键结合于具有离子交换基的水不溶性载体上。 ?共价结合法:酶以共价键结合于载体上。即将酶分子上非活性部位功能团与载体表面反应基团进行共价结合的方法。 (2)交联法: 用双功能或多功能试剂使酶与酶或细胞与细胞之间交联的方法。交联法又分:交联酶法、酶与辅助蛋白交联法、吸附交联法和载体交联法。 常用的交联剂:戊二醛、双重氮联苯胺-2、2-二磺酸、1,5-二氟-2,4-二硝基苯。 (3)包埋法: ?网格型:将酶或细胞包埋在高分子凝胶细微网格中。常用合成高分子化合物有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、光敏树脂。天然高分子化合物有淀粉、明胶、胶原、海藻胶、角叉菜胶。多用于固定化细胞。 ?微囊型:将酶或细胞包埋在高分子半透膜中。通常为直径几微米到几百微米的球状体。 (4)无载体法(选择性热变性法):在适当温度下处理使细胞膜蛋白变性，但酶不变性使酶固定于细胞内。此法只适用于细胞固定化。 4、固定化酶的性质(变化)P228 (1)酶活力的变化:酶经过固定化之后活力大都下降。 (2)酶稳定性的变化:包括对温度、pH、蛋白酶变性剂和抑制剂的耐受程度。固定化后，稳定性提高，有效寿命延长。其原因是限制了酶分子之间的相互作用，阻止了其自溶，增加 了酶构型的牢固程度。 (3)酶学特性的变化 ?底物专一性:对底物的专一性下降。?最适pH:最适pH可能变大，也可能变小;?最适温度:一般升高。原因是固定化后空间结构更为稳定。?米氏常数(Km):Km值均发生变化，有的增加很小，有的增加很大，但不会变小。?最大反应速度(Vm):变化很小或不变。 6、固定化酶活力测定方法:分批测定法和连续测定法。P231 第三节 固定化酶和固定化细胞的反应器 1、反应器的类型和特点P232 (1)间歇式搅拌罐反应器:用于游离酶反应后随即放料。 (2)连续流动搅拌罐反应器:连续进料、连续出料 (3)填充床反应器: 固定化酶填充于床层内。反应器内的流体的流动形态为平推流形。 底物以恒定流速通过反应床。 (4)流化床反应器:底物以足够大的流速向上通过固定化酶床层，使固体颗粒处于流化状态，达到混合的目的。 (5)循环反应器:部分反应液流出和新加入底物流入液混合，在进入反应床进行循环。 (6)连续流动搅拌罐-超滤膜反应器 (7)其它反应器 第四节 酶的人工模拟 1、人工模拟酶:根据酶的作用原理，用各种方法人为制造的均有酶性质的催化剂。它们一般具有高效和高适应性的特点，在结构上相对天然酶简单。P235 2、主-客体化学和超分子化学是酶人工模拟的重要理论基础。P236 3、模拟酶的分类P236 (1)根据Kirby分类法:单纯酶模型、机理酶模型、单纯合成的酶样化合物 (2)主-客体酶模型:主-客体酶(环糊精CD)、胶束酶模型、肽酶、、分子印迹酶模型、半合成酶 4、何谓分子印迹,分子印迹的应用范围有哪些,P238 分子印迹:指制备对某一特定分子具有选择性的聚合物的过程，该特定分子称为印迹分子或模板。 分子印迹的应用范围有:? 分子印迹聚合物可作为裁剪分离物质的材料，如手性药物的分离，也可以分离大分子物质。? 在酶技术和有机合成中，分子印迹聚合物可作为模拟抗体，模拟酶或具有催化活性的聚合物。? 分子印迹聚合物还可在生物传感器的构建中作为传感器，这种聚合物可作为通常使用的生物材料的替代物。 第五节 酶的化学修饰 1、为什么要对酶进行化学修饰? P242 酶作为生物催化剂，其高效性和专一性是其他催化剂所无法比拟的。但是，酶是蛋白质，存在其异体蛋白的抗原性、受蛋白酶水解和抑制剂作用、在体内半衰期短等缺点，严重影响使用效果。工业用酶常常由于酶蛋白抗酸、碱、有机溶剂变性及抗热失活能力差，容易受产物和抑制剂的抑制，工业反应要求的pH和温度不总在酶反应的最适pH和最适温度范围内，底物不溶于水或酶的Km值过高等弱点，限制了酶制剂的应用范围。酶的化学修饰就是对酶在分子水平上用化学方法进行改造，从而提高酶的稳定性、解除酶的抗原性、改变酶学性质、扩大酶的应用范围。 2、酶化学修饰:通过化学方法对酶分子的主链进行切割、剪接和侧链基团的化学修饰改造，以改变其理化性质和生物活性。P242 3、化学修饰的目的:人为地改变天然酶的一些性质，创造天然酶所不具备的某些优良特性 甚至创造出新活性，来扩大酶的应用领域，促进生物技术的发展。?提高生物活性?增强在不良环境(非生理条件)中的稳定性?针对异体反应，降低生物识别能力。 4、酶化学修饰的方法P243 (1)酶的表面化学修饰 ?大分子修饰:可溶性大分子，如PEG、葡聚糖等通过共价键连接(其中分子量500-20000的PEG使用最广);?小分子修饰:小分子对其活性部位或侧链基团修饰，如氨基葡萄糖等;?交联修饰:双功能试剂如戊二醛等将酶分子之间、亚基之间或分子内不同肽链部位进行共价交联;?固定化修饰:酶共价连接惰性载体 (2)酶分子内部修饰 ?非催化活性基团修饰:改变酶对特殊底物的束缚能力;?蛋白主链修饰;?催化活性基团修饰;?与辅助因子有关的修饰?肽链延伸后修饰 (3)结合定点突变的化学修饰:得到新的酶制剂 5、修饰酶的特性;P244 ?热稳定性提高;?抗各类失活因子能力提高;?抗原性消除;?体内半衰期延长;?最适改变;?酶学性质变化:Km会增大，专一性改变等;?对组织分布能力改变 第六节 酶工程研究的进展 (有机相酶反应、核酶和脱氧核酶、抗体酶) 1、有机相酶反应的定义及其优点是什么 ,P247 (1)有机相酶反应是指酶在具有有机溶剂存在的介质中所进行的催化反应。 (2)有机相酶反应的优点:? 增加疏水性底物或产物的溶解度;? 热力学平衡向合成方向移动，如酯合成、肽合成等;? 可抑制有水参与的副反应;? 酶不溶于有机介质，易于回收再利用;? 容易从低沸点的溶剂中分离纯化产物; ? 酶的热稳定性提高，pH的适应性扩大;? 无微生物污染;? 能测定某些在水介质中不能测定的常数;? 固定化酶方法简单，可以只沉淀在载体表面。 2、有机相酶反应的溶剂体系各是什么,如何选择溶剂体系和有机溶剂的种类,P248 按照溶剂体系的组成和特点，目前有机相酶反应主要有4种溶剂体系。 (1)水—水溶性溶剂均相体系:由水和水溶性有机溶剂相互溶解而形成的均一体系。 (2)水—水不溶性溶剂两相体系:有机溶剂在水中的溶解度尽可能小。在该体系中，要求底物在水和有机溶剂中的溶解度尽可能大，而产物在水中的溶解度要小。 (3)反相胶团体系:由两性化合物在占优势的有机相中形成的一系列包围水滴的体系。 (4)单相有机溶剂体系:在该体系中，不存在单独的水相，只含极微量的水，即在酶分子周围存在着一层水分子膜，以维持催化反应所必需的构象。 选择溶剂体系和有机溶剂的种类要根据酶的性质、底物和产物的溶解度及反应器的型式 等具体情况而定。 3、核酶:(1)剪切性核酶:锤头型核酶、发夹型、丁型肝炎病毒(HDV)核酶、蛋白质-RNA复合酶(RNaseP)(2)剪接型核酶:?内含子、?内含子;P250 4、抗体酶:一种新型人工酶制剂，是一种具有催化功能的抗体分子，在其可变区赋予了酶的属性。它是利用现代生物学与化学的理论与技术交叉研究的成果，是抗体的高度选择性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物。P252 第七章 发酵工程制药 第一节 概述 1、发酵工程:微生物工程，利用微生物制造工业原料与工业产品并提供服务的技术。P259 2、发酵工程发展4个阶段:发酵工程发展4个阶段:(1)20世纪前，传统发酵(酒、醋等) (2)1900-1940，揭示发酵本质-微生物引起，诞生许多新的发酵产品(甘油、丙酮等)，纯培养技术;(3)发酵大发展，青霉素工业推动发酵，深层培养技术;主要标志有:抗生素、氨基酸、核酸、甾体的微生物转化(4)基因工程应用于发酵;P260 3、发酵工程内容:菌种培养和选育、菌的代谢与调节、培养基灭菌、通气搅拌、溶氧、发酵条件优化、发酵过程各种参数与动力学、发酵反应器的设计和自动控制、产品的分离纯化和精制等。P261 4、发酵工业的生产水平取决于三要素:生产菌种、发酵工艺、发酵设备。P261 第二节 优良菌种的选育 自然菌种有时不能满足生产需求，要想得到性能更优良的高产菌种，就必须选育突变株。 1、菌种选育;P261 菌种选育包括:自然选育、诱变育种、杂交育种等经验育种方法，还包括控制杂交育种、原生质体融合、基因工程等定向育种方法。 2、诱变机制;P262 诱变会使生物遗传物质DNA发生变化: 转换:嘌呤与嘌呤、嘧啶与嘧啶之间置换 碱基置换(点突变) 微小损伤突变 颠换:嘌呤与嘧啶之间置换，少见 突变 码组移动突变(移码突变): 碱基缺失或增加非3地倍数 染色体畸变:染色体遗传物质发生易位、倒位、缺失、重复 染色体组突变:染色体数目改变 2、诱变剂及其作用方式P264 (1)物理诱变剂 ?机理:引起生物DNA损伤或断裂，修复时发生错误拼接与复制 ?种类:紫外线、X 射线、γ射线、快中子、激光 (2)化学诱变剂 ? 与碱基发生反应，使DNA复制时使碱基配对错误:烷化剂，如硫酸二乙酯(DES)、甲基磺酸乙酯( EMS)、亚硝基胍(NTG)、氮芥(NM)等 ?碱基的类似物，掺入到DNA中引起变异:5-溴尿嘧啶(5BU)是胸腺嘧啶(T) 的类似物 ? 移码突变:吖啶类物质 (3)生物诱变剂:噬菌体(码组移动) 3、原生质体融合;P266 原生质体融合:脱壁细胞通过物理、化学等因子的诱导，两个亲本原生质体合并在一起形成融合细胞的过程。 过程:(1)标记菌株(细胞):通过诱变使菌株(细胞)具备遗传标记(如:营养缺陷)以便筛选 (2)制备原生质体:将两亲株分别用酶(细菌用溶菌酶，酵母菌和霉菌用蜗牛酶或纤维素酶)处理，使细胞壁全部消化或使之破裂，原生质体即可从细胞内逸出。为了防止原生质体的破裂，要把原生质体释放到高渗缓冲液或培养基中。 (3)原生质体融合和再生:制备好的二亲本原生质体可通过化学因子(PEG)诱导或电场诱导进行融合。两个原生质体融合后，必须涂布于再生培养基上，使其再生。 (4)融合子的筛选:依靠在选择培养基上的遗传标记，有二个遗传标记互补，就可确定其为融合子。 第三节 发酵的基本过程(重点) 1、发酵的基本过程是怎样的,P267 培养基 菌种?种子制备?发酵?发酵液预处理?提取精制 (1)菌种:经过人工选育的高产优良菌种。为防止菌种衰退，需把菌种进行保藏，并且还需不断纯化。 (2)种子制备:菌种的扩大化培养。一般 保藏菌种?斜面培养(活化)?摇瓶培养?种子罐培养?发酵罐，以便得到足够数量和质量的纯种。 (3)发酵 ? 培养基和发酵设备灭菌 ?接入5%-20%的菌种 ? 在发酵罐内进行发酵 ?需对发酵罐内各种条件进行控制以保证发酵正常进行:溶氧(通气搅拌)、罐压、温度、PH 、泡沫等 发酵周期因品种而异 (4)产物提取 ?发酵液的预处理和过滤;?提取;?精制 第四节 发酵方式 1、发酵的操作方式和特点;P268 (1)分批发酵 ?定义:营养物和菌种一次加人进行培养，直到结束放出，与外部没有物料交换的培养方式。在这一过程中，除了氧气、消泡剂及控制pH的酸或碱外，不再加入任何其它物质。 ?特点:微生物所处的环境在发酵过程中不断变化，其物理，化学和生物参数都随时间而变化，是一个不稳定的过程。 ? 优点:操作简单;操作引起染菌的概率低;不会产生菌种老化和变异等问题 缺点:非生产时间较长、设备利用率低。 (2)连续发酵 ? 定义:培养基料液连续输入发酵罐，并同时放出含有产品的相同体积发酵液，使发酵罐内料液量维持恒定，微生物在近似恒定状态下生长的发酵方式。 ?特点:发酵罐内料液量维持恒定，微生物在近似恒定状态 ?优点:能维持低基质浓度;可以提高设备利用率和单位时间的产量;便于自动控制。 缺点:菌种发生变异的可能性较大;要求严格的无菌条件。 (3)补料分批发酵 ?定义 :补料分批发酵又称半连续发酵或流加分批发酵，是指在分批发酵过程中，间歇或连续地补加新鲜培养基的发酵方式。 ?优点:使发酵系统中维持很低的基质浓度;和连续发酵比、不需要严格的无菌条件;不会产生菌种老化和变异等问题。 缺点:存在一定的非生产时间;和分批发酵比，中途要流加新鲜培养基，增加了染菌的危险。 第五节 发酵工艺控制 1、影响发酵的主要因素有哪些,如何对发酵过程进行控制,P269 (1)培养基的影响及控制:配制合适成分的培养基(碳源、氮源、无机盐、微量元素和水)，特别是碳氮比要适宜 (2)温度的影响及控制:有最适生长温度和最适发酵温度;通过在发酵罐夹套或蛇管中流冷、热介质进行控温。 (3)PH的影响及控制:有最适生长PH和最适发酵PH;通过加酸性物质或碱性物质调节PH，也可补料来调节 (4)溶氧的影响及控制:根据微生物对氧的需求来控制溶氧浓度;调节通气速率和搅拌速率来调节溶氧 (5)泡沫的影响及控制:需要消泡;通过机械消泡和消泡剂来消泡 第六节 发酵产物的提取 1、提取的方法一般有:沉淀法、溶剂萃取法、吸附法、离子交换法。P275 第七节 发酵设备 1、搅拌釜式反应器是最早采用也是至今应用最广的一种微生物发酵设备。P277 第八节 发酵工程产品制造实例P278 1、青霉素发酵需要添加前体物质，如苯乙酸(或其盐类)、苯乙酰胺等，浓度,0.1% 2、发酵法是当前氨基酸工业主要生产方法。 第九节 基因工程在发酵工程中的应用 1、克隆抗生素生物合成基因的策略和方法有哪些,P283 (1)在标准宿主菌中克隆检测单基因产物。(2)阻断变株法。(3)突变克隆法。(4)直接克隆法。(5)克隆抗生素抗性基因法。(6)寡核苷酸探针法。(7)同源基因杂交法。 2、基因工程技术在抗生素中有那些应用, (1)提高抗生素的产量 ; (2)改善抗生素组分 ; (3)改进抗生素生产工艺; (4)产生杂合抗生素