全长CDNA克隆方法

全长CDNA克隆方法以MITF基因为例,简述全长CDNA克隆的方法.方法分三步:1.克隆中间片段2.克隆3’片段3.克隆5’片段,然后再将3者重复序列删除,拼接起来.1.中间序列克隆提取锦鲤的皮肤组织的mRNA,然后跑胶检测。如果有2根带,则显示mRNA提取成功.然后反转录成CDNA，检测B-actin。首先在NCBI上查找mitf基因,获取该基因的序列,CDS区,基因编号.并且保存,以备以后比对序列用.选取斑马鱼的mitfa为.引物合成:用Primer5设计引物长度:长度一般在18-30个碱基。一般都是18-24个左右。GC含量：一般引物GC含量为40%-60%，一对引物的GC含量和TM值要协调。如果引物存在严重的GC或者AT倾向，可以在引物最后加适当A.T.C.G尾巴退火温度：退火温度需要比解链温度低5度。适当提高引物退火温度可以使PCR的特异性增加。一般设计一对引物的TM值应该要比较接近，一般在0-4度以内，不会影响PCR的产率。温度在55-75度之间。避免扩增模板的二级结构区域，一对引物之间不应该存在4个连续碱基的同源性或者互补性。选取时尽量选取分高的组合。设计引物时，尽量增加克隆的中间片段长度，为避免5‘和3’克隆出现长片段。引物设计好以后，根据引物的TM值，首先设计温度，做梯度PCR.比如TM为65度，设计梯度时可以设计63,64,65,66.4个梯度。然后根据跑胶结果确定大体系的TM值，如有目的带，直接胶回收。然后进行链接，转化。送公司测序。测序结果出来后，用Chmas软件打开，并将其转化为TXT格式的碱基序列。用Jellyfish里面，找特异性的正向，反向引物。找完正向后，将序列反过来再找反向引物。只有都能找到2个引物的序列才能算测序成功。将特异性引物两端的序列全部删除，（那是对应载体的序列）。保存克隆的中间序列，然后跟斑马鱼的序列对比，一般重复性在90%以上。若有几组序列满足要求，用着几组进行对比突变的地方按照重复多的碱基最为标准。尽量选2组以上序列。2.3‘克隆克隆3‘的时候要重新用mRNA做反转录，在做反转录的时候要加上3‘接头。（接头由自己合成）。设计引物：正向的外侧引物和内侧引物反向的UPM和NUP一般设计特异性引物的TM值为接近60度，最后60度以上。首先用外侧引物和UPM做10ul体系的下体系。然后用其PCR产物模板稀释10-40倍。用作内侧引物+NUP的PCR反应模板。做大系统检测最适合TM值。找到以后直接进行胶回收，链接转化，测序。第一轮的TM值需要摸索，第一轮以后通常是弥散的条带。如果多次尝试还是不行，可以更换引物。测序结果出来后，找特异性内侧引物和NUP，找得到才能用于分析。去掉内侧引物和NUP外侧的序列，并且去掉NUP然后和中间序列对比，去掉重复的序列。3.5‘克隆用专门的5’反转录试剂盒得到5‘CDA。这个步骤很重要。然后检测B-antin设计引物：正向的NUP和UPM反向的内侧和外侧特异性引物。5‘的特异性引物TM值最好要在68度以上。特异性才好。用正向UPM和反向外侧引物做pcr，第一轮稀释10-40倍。用作第二轮的模板，第二轮NUP+反向内侧引物。做大体系后胶回收，链接转化。送测序。去掉NUP后比对中间序列，去掉重负的序列，链接起来。