人巨细胞病毒PPUL44蛋白单克隆抗体CH13抗原
簇位点的
人巨细胞病毒PPUL44蛋白单克隆抗体
CH13抗原决定簇位点的
个随机多肤文库申筛选出能与
CH13结合的克】萱,测定上述克隆随机多肤的DNA序列,用随机多肚的氯基馥同鼎序列与PPUL44蛋白质的氯基
酸序列比较.结果:能与CHI3蛄舍的随机多肤的氨基酸序列显示出高度的一致性}随机多肤同鼎序列NEGEAFG—
PDVSG与PPUL44蛋白位于第32l,332的氨基酸序列高度同源f而随机多肤序列FQ1LVCVESVLR与PPUL44
位于第181~184的氨基酸序列有4个相邻的氨基酸一致.结论{CH13的抗原决定簇位于PPUL44蛋白第32l,
332氨基酸序列附近;CH13与PPUL44位于第181,184氨基畦序列可能有一定反应.随机多肤文库在研究相王
作用蛋白质的氨基酸序列方面具有广泛的应用前景.
关键词全呈PPUL44蛋白f随机多肤文库;氨基醢序列
EpitopeLocalizationofHumanC
Hytomegalov~rusMonoclonalAntibodyCH13
RuanQiang,RipahiA,LandiniP,Guo.1injin,LiuQing,
WeiHongbin.IiYaohua,XChang
(VirusLaboratory.TheSecondClinicalCoLlege,ChinaMedicalUnive~ity,
Shenyang,110003)
ABSTRACTObjective:Ouraimsweretolocalizetheepitopepositionofamonoclonalantibody(MAb)t
CH13,againsthumancytomegalovirus(HCMV)PPUI44onPPUI.44protein,andtofindtheapplicationofaran—
dorapeptidedisplaylibraryinaminoacidsequenceanalysisofproteinthatreacttoaknownprotein.Methods:Pep—
tideclonesthathavereactivitytoCH13wereselectedfromarandompeptidedisplaylibrarybydirectlyusingmono—
clonalantibodyCH13TheDNAsequencesoftheserandompeptidesweredetected.Thehomologyaminoacidse—
quencesoftherandompeptideswerecomparedwiththoseofPPUI.44protein.Results:Theaminoacidsequences
ofpeptidesthatreaciedtoPPUL44MAbCH13showedhighlyhomology.Thehomologousaminoacidsequence
NEGEAFGPDVSGwassimilartothatlocatedatthepositIonfrom321to332aminoacidofHCMVPPUI.44.Se—
quenceFQI1VCVESVI.Rhad4adjacentaminoacidsconsensuswiththoseofHCMVPPUL44fromaminoacid181
to184.Conclusion!TheepitopepositionofHCMVPPUL44MAbCH13waslocatedatregionaroundaminoacid
from321to332ofPPUL44andthepeptidefromaminoacidl81to184ofPPUI.
44mayhavepartiaIreactivityto
CH13.TheRandompepddedisplaylibraryshowedwidelypotentialapplicati
oninaminoacidsequenceanalysisof
proteinthatreacttoaknownprotein.
KEYWORDShumancytomegalovirus;PPUL44protein;randompeptidedi
splaylibrary}aminoacidse—
quence
人巨细胞病毒(humancytomega’lovirus,
HCMV)PPUL44蛋白是一个具有与DNA结合特
性的磷蛋白,分子量为52kd,在HCMV急性感染
患者中主要刺激产生IgM抗体.在HCMV研究中,
HCMVPPUL44蛋白的单克隆抗体CH13是经常
使用的抗体.为确定CH13在HCMVPPUL44蛋白
中的抗原决定簇位置,作者采用CH13在一个随机
多肽文库中筛选出与CH13具有结合能力的克隆,
耄大利Bologna大学微生物研究所病毒研究室
用4色荧光自动测序的
测定了上述克隆编码随
机多肽基因的DNA序列,井比较了这些随机多肽
的氨基酸序列与HCMVPPUL44蛋白氨基酸序列
的同源性,探讨了随机多肽文库在研究相互作用蛋
白质的氨基酸序列等方面的应用.
1
与方法
1.1材料
HCMVPPUL44蛋白单克隆抗体CH13购自
GoodwinInstitute,Plantation,Fla.随机多肽文库
中国医科大学第29卷
FliTrx”~RandomPeptideDisplayLibrary购自In.
vitrogen公司.DNA提取试剂盒RPM购自Pro—
maga公司.多肽文库中插入的随机多肽基因区上下
游的PCR扩增引物和上下游DNA测序引物由意
大利Primm公司合成如下:PCRPrimerU:ATT
CACCTGACTGACGACAGT;PCRPrimerL:
CCTGATATTCGTCAGCGAT;SeqPrimerU:
GATGTACTCAAAGCGGACG;SeqPrimerL:
GATCATTTTGCACGGACC.PCR扩增产物纯
化试剂盒QIAquickPCRPurificationKit购自QI—
AGEN公司.4色荧光自动测序试剂盒ABIPRISM
BigDyeTMTerminatorCycleSequencingReaction
Kit购自美国PE公司.
1.2方法
1.2.1从随机多肽文库中筛选与HCMVPPUL44
蛋白单克隆抗体CH13具有结合能力的多肽克隆:
方法详见试剂盒使用说明.简述如下:将1x
1O个过夜培养的FliTrxTM文库细菌接种于含有
100~g/ml氨苄青霉素和100~g/ml色氨酸的IMC
培养液中,振荡培养6h,诱导文库中细菌鞭毛末端
随机多肽的
达.同时用CH13单克隆抗体包被6O
mr/a_直径的细胞培养板,井用1脱脂奶粉封闭培
养板.在包被有cH13的培养板中,加入表达的文库
细菌,室温孵育1h.洗涤5次后,将培养板置于磁力
振荡器上振荡30s,收集残存在洗液中的细菌.培养
收集的细菌,重复上述筛选4次.将收集的细菌接种
于含有100~g/ml氨苄青霉素的RMG培养基的培
养皿上,30”C培养过夜.挑出单个克隆,一8O?保存
备用.
1.2.2免疫转印检测筛选克隆多肽与CH13单克
隆抗体的反应n]:
收集用100gg/ml色氮酸诱导培养的挑选克
隆,加入含有SDS和巯基乙醇的裂解液煮沸5
min后,在9的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离
含有随机多肽的蛋白,并将其电转移至硝酸纤维素
膜上.用含有1脱脂奶粉的封闭液封闭硝酸纤维
素膜后,与1:500稀释的CH13室温反应1h.漂洗
3次后,加入辣根过氧化物酶标记的二抗体反应1
h.加入4一氯萘酚底物闭光显色.选择与all13有不
同反应性的克隆14株,无反应性克隆12株备用.
1.2.3克隆菌质粒的提取:
将挑选的克隆分别接种于2ml含有100~g/ml
氮苄青霉素的RM培养液中,30”C振荡培养过夜.
采用RPM试剂盒提取各个克隆菌的质粒DNA.提
取的质粒DNA加入0.8的琼脂塘凝胶电泳中检
测其分子量和纯度,此质粒DNA的大小为5kb.
1.2.4多肽文库质粒中插入随机多肽基因区序列
的扩增:
按下列
配制PCR反应液:引物0.5umol/
L,dNTP0.1mmol/L,MgC122mmol/L,Taq酶
5u,模板5td,1倍浓度的缓冲液.反应条件为:
98?变性2rain,62?退火2Os,72c延伸20s.采
用热启动(HotStart)PCR方法进行35个循环的扩
增.扩增产物为181bp.
1.2.5PCR扩增产物的纯化和定量:
PCR扩增产物采用QIAquickPCRPurifica—
tlonKit进行纯化.纯化的PCR产物加入琼脂糖凝
胶电泳中.采用StratageneEagleEyel测定定量
加入(250ng)的DNA分子量标志物相应区带与
PCR扩增产物带的荧光密度,计算出各纯化的PCR
扩增产物的含量.
1.2,6DNA序列测定:
根据ABIPrismBigDyeTMTerminatorCycle
SequencingReactionKit提供的操作方法,配制
PCR测序反应液如下:3ngDNA模板.8Termi—
natorMixture,3.2pmolPrimers,进行26个循环
的扩增.扩增产物采用异丙醇沉淀法纯化后,加入聚
丙烯酰胺测序凝胶中电泳,采用PE公司ABIPrism
377GeneticAnalyzer读出DNA序列.
1.2.7氨基酸序列分析:
通过计算机互联网比较各个克隆随机多肽氨基
酸序列的同源性,并与HCMVPPUL44蛋白的氨
基酸序列比较.寻找各个随机多肽氨基酸序列问的
同源性,及其同源序列与HCMVPPUL44蛋白氨
基酸序列的关系.
2结果
2.1随机多肽文库FliTrxTMRandomPeptideDis—
playLibrary中与HCMVPPUL44蛋白单克隆抗
体CH13有反应性克隆随机多肽的氨基酸序列见表
1;与CH13无反应性克隆随机多肽的氨基酸序列见
表2.
2.2与HCMVPPuL44蛋白单克隆抗体cH13具
有反应性克隆随机多肽的氪基酸同源序列与
HCMVPPUL44蛋白氨基酸序列的比较结果见图
1.
随机多肽克隆氨基酸同源序列NEGEAFG—
PDVSG与HCMVPPUL44蛋白位于第321,332
的氨基酸具有高度同源性而随机多肽克隆序列
FQILVCVESVLR与HCMVPPUL44位于第181
第5期阮强等.人巨细胞病毒PPUI44蛋白单克隆抗体CHI3抗原决
定髌位点的确定
,184的氨基酸序列有4个相邻的氨基酸一致.
表l与单克隆抗体CH13具有反应性克隆
随机多肽的氨基酸序列
Tab.1Aminoacidsequencesofrandompeptidesofclones
withreactivitytomonoclonalantibodyCHI3
表2与CHI3无反应性克隆随机多肽的氨基酸序列
Tab.2AminoacidsequencesofrandompeptJdesofclones
withoutreactivitytomonoclonalantibodyCHI3
克隆序号随机多肽氨基酿序列
VPH0一GAEAG,M
0K—VLDRMLS1P
PTGESSRSWSAR
RPLVLK—ISFGG
VPH0一GAEAG—
RGSHGFATLP
EAGwLwlVVLQ—
W QGGSNGLVRW—
ARAGGTSWVFV?
DDRGWYDPMEYE
LRTQRDGRR—RG
L+SFDQTLLARs
HCMCPPUL44
AaI81,l84321332
克隆18FQILVCVESVLR
同源序列NEGEAFGPDVsG
图1与CHI3具有匣应性随机多肽的氨基酿同源序列
与HCMVPPUL44蛋白氨基酿序列的比较结果
Fig.1Comparisonresultsbetweenhomologousaminoacid
sequenceofrandompeptideswithreactivitytoCHI3
andaminoacidsequenceofHCMVPPUL44protein
3讨论
HCMVPPuL44蛋白是一个具有与DNA结合
特性的磷蛋白[,分子量为52kd,在HCMV感染患
者中主要刺激IgM抗体的产生.在HCMV感染过
程中,PPuL44对于病毒DNA聚合酶起加工因子
(Processingfactor)的作用,是病毒依赖于0riLyt
的DNA复制所必需的蛋白口],对于病毒在细胞培
养中的繁殖非常重要].
HCMVPPUL44蛋白单克隆抗体CH13与
HCMVPPUL44蛋白具有较强的反应性,同时表现
出较高的特异性,是HCMV感染的诊断和研究中
经常使用的单克隆抗体,其在PPUL44蛋白上的确
切抗原决定簇位点尚未确定.本研究采用CH13单
克隆抗体在随机多肽文库中筛选克隆,井对其随机
多肽基因编码区进行DNA测序,比较了在免疫转
印实验中与CH13单克隆抗体具有反应性的随机多
肽氨基酸序列与HCMVPPUL44蛋白氨基酸序列
的同源性.结果表明,CH13单克隆抗体在HcMV
PPUL44蛋白上的抗原决定簇位于其第32l,332
氨基酸序列附近,井可能与其位于第181,184的氨
基酸序列有一定的反应性.作为对照的与CH13无
反应性克隆的随机多肽氨基酸序列则无同源序列,
且在其随机多肽基因序列中常出现终止密码.
在各种生物的生命活动中,各种生命现象都是
以蛋白质具体功能的形式表现出来的.在蛋白质功
能表现中,蛋白质与蛋白质之间的相互作用起到极
其重要的决定性作用.因此,对蛋白质之间相互作用
的研究成为分子生物学研究的一个重要领域.采用
随机多肽文库结合DNA测序的方法,可以研究与
已知蛋白具有结合能力的蛋白质的氨基酸序列,再
结合与蛋白质文库(ProteinBank)中已知氨基酸序
列的比较,可以推测出与所研究蛋白具有反应性的
蛋白质种类.这一方法将为分子生物学研究的发展
起到推动作用.
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