【doc】农村地区RVVC病人阴道内所分离的假丝酵母菌分型和药敏分析

【doc】农村地区RVVC病人阴道内所分离的假丝酵母菌分型和药敏 农村地区RVVC病人阴道内所分离的假丝 酵母菌分型和药敏分析 ? l58?中国妇幼保健2005年第2O卷 农村地区RVVC病人阴道内所分离的假丝酵母菌分型和药敏分析 肖敦振赵丁源高俊姚念华中科技大学同济医学院计划生育研究所430030 中国图书分类号R711.31文献标识码A文章编号1001-4411(2005)02-0158-03 【摘要】目的:了解农村地区复发性假丝酵母菌外阴阴道炎(RVVC)病人假丝酵母菌菌型分布情况及其对常见抗真菌 药物的敏感性.:对农村地区RVVC患者阴道内分离到的菌株分别采用科玛嘉显色培养基和ATBFungul药敏试剂盒进行分 型鉴定和药敏分析.结果:所得30个菌株中自假丝酵母菌,光滑假丝酵母菌,热带假丝酵母菌,中间假丝酵母菌的构成比分别 为13.33%,33.33%,26.67%,10.00%;菌株对5一FC,AMB,NYS,MIC,KET,ECO6种药物的敏感性分别为52%,48%, 64%,16%,16%,16%.结论:农村地区RVVC病人假丝酵母菌呈明显非白念化趋势,菌株对常见抗真菌药物敏感性降低, 而且不同菌型有不同的药敏谱. 【关键词】复发性假丝酵母菌外阴阴道炎(RVVC)真菌药敏实验念珠 菌菌型分布 Theclassificationandantifungalsusceptibilitytestingofcandidaisolatedfrom RVVCpatientsofrural XIAODun—zhen,ZHAODing—yuan,GAOJun,eta1.FamilyPlanningRe searchInstitute,TongfiMedicalCollege, HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan,Hubei430030,China (Abstract]Objective:ToacquainttheclassificationandsensitivitytoantifungalagentsofcandidaisolatedfromRVVCpatientsof rura1.Methods:TousetheChromogenicmediumandATBfungulkittoconducttheclassificationandantifungalsusceptibilitytestingof candidaisolatedfromRVVCpatientsofruralseparately.Results:Amongallthirtystrains,theratioofcandidaalbicans,candidaglabrata, candidatropicalisandcandidaintermedialWas13.33%,33.33%,26.67%,10.00%separately;Thesensitiyityto5一FC,AMB,NYS, MIC.KETandECOwas52%,48%.64%,16%,16%,16%separately.Conclusion:ThecandidaiaolatedfromRVVCpatientsofru- ralhasthetrendofnon—candidaalbicans;besides,thesensitivitytoantifungushasdecreased.Differentstrainshavedifferentantifungal susceptibilityspectrum. (Keywords]Recurrentvulvovaginalcandidiasis;Antifungalsusceptibilityt esting;Classificationofcandida. 育龄妇女假丝酵母菌外阴阴道炎患病率高,在初发病例 中自假丝酵母菌为其主要病原菌.但随着抗真菌药的广泛应 用,由非白假丝酵母菌引起的阴道炎感染逐渐增多;而且假 丝酵母菌对常见抗真菌药物的敏感性逐渐降低,不同菌型的 假丝酵母菌对常见抗真菌药的敏感性也存在差异.假丝酵 母菌外阴阴道炎经治疗后5%一10%复发;而目前有关复发性 假丝酵母菌外阴阴道炎(RVVC)菌株分型及药敏情况尚无报 道.本研究通过对临床RVVC病人体内分离的假丝酵母菌进 行分型和药敏分析,以了解农村地区RVVC感染的菌种分布 和药敏情况. 1材料和方法 1.1菌种来源.2003年9月从湖北省仙桃市计划生育服务站 门诊的复发假丝酵母菌外阴阴道炎病人阴道分泌物中分离到 30株假丝酵母菌:白假丝酵母菌株,ATCC10231,由湖 北省疾病控制中心微生物室提供. 1.2主要试剂.科玛嘉显色培养基(郑州博赛生物工程有限 责任公司);ATBFungulkit和ID32C鉴定卡(法国梅里埃公 司). 1.3实验方法. 1.3.1科玛嘉显色培养基分型鉴定:将沙堡琼脂培养基中的 样本菌株和白假丝酵母菌标准株接种于科玛嘉显色培养基上, 37%培养48h,按培养基上所形成菌落的颜色进行分型鉴定. 1.3.2ATB微生物鉴定仪分型:将初判为光滑假丝酵母菌的 菌株,用ID32C鉴定卡和ATB微生物鉴定仪进行鉴定,用于 区分易于与光滑假丝酵母菌显色相近的其它菌株. 1.3.3药敏实验:随机挑选25个样本株,严格按试剂盒操 作书进行药敏实验. 2结果 2.1分型鉴定结果见表1. 表1假丝酵母菌分型结果(共3o人) 区RVVC型和药敏分析第2 显色培养基从3O株样本菌中分得13株(43.33%)光滑 假丝酵母菌,8株(26.67%)热带假丝酵母菌,4株 (13.33%)白假丝酵母菌和5株(16.67%)其它类型的假丝 酵母菌.对显紫色初判为光滑假丝酵母菌的菌落,继续观察 其在显色培养基上的颜色变化;在接种培养后的第4天,有3 株(10.O%)假丝酵母菌的菌落颜色发生了变化,散在分离 的单个菌落由紫色变成淡蓝色,其余1O株(33.33%)仍为 紫色;后经ATB鉴别系统验证,菌落颜色发生变化,初判为 光滑假丝酵母菌的菌株实为中间假丝酵母菌. 2.2药敏结果见表2. 表2各型假丝酵母茵的药敏试验 注:S:敏感;I:中介;R:耐药 所有菌株对5一FC,AMB,NYS,MIC,KET,ECO6种 药物的敏感性分别为52%,48%,64%,16%,16%,16%; 其中自假丝酵母菌对5一FC,AMB,NYS的敏感性较高 (75%),但对吡咯类抗真菌药均不敏感,对MIC和ECO全部 耐药;光滑假丝酵母菌对5一FC,NYS的敏感性较高 (77.8%),对其它药物的敏感性较低(11.1%);中间假丝酵 母菌对5一FC全部敏感,除对NYS敏感性为33.3%外,对其 它4种药物均不敏感;热带假丝酵母菌对AMB全部敏感,对 NYS的敏感性为71.48%,但对5一FC全部耐药,x,-l~lt:咯类抗 真菌药的敏感性也不高(均低于30%). 3讨论 假丝酵母菌外阴阴道炎多发于育龄妇女,主要引起外阴 ? l59? 搔痒,灼痛,白带增多等症状;若不经规范的诊治,以及连 续3个月经周期的复查,很易慢性化,非白念化,并形成耐 药株.由于卫生服务条件,知识水平和就医行为等原因,使 得农村育龄妇女成为罹患RVVC的弱势群体.本研究结果显 示农村地区RVVC病例呈现非白化和高耐药性两大特征: 3.1非白化特征.3O例RVVC病人中自假丝酵母菌仅占 13.33%,而非白假丝酵母菌占86.67%,其中光滑假丝酵母 菌和热带假丝酵母菌分别占33.33%和26.67%.这与初发病 例中,白假丝酵母菌为主要病原菌(占80%,90%)相差甚 远.其可能原因是现在临床广泛应用的是吡咯类抗真菌药, 而该类药物的杀菌作用主要是针对白假丝酵母菌,对光滑假 丝酵母菌和克柔假丝酵母菌的杀菌作用较弱;这就使得其 它菌种能够逃逸吡咯类抗真菌药的杀菌作用而存活下来,从 而使得非白假丝酵母菌的比例增大.另一可能原因是长期的 不规范用药导致了菌种的变迁.ChongPP等H在研究中发现, RVVC病人中自假丝酵母菌的遗传相似性较初发病人低,说 明菌种在复发感染中维持着微观进化. 3.2高耐药性特征.耐药性可以分为两种:一种是天然耐 药,另一种是获得性耐药或继发性耐药.本次调查发现,从 25例复发病例中分离到的假丝酵母菌呈很高比率的耐药性. 总体趋势为对吡咯类抗真菌药不敏感或耐药.其中白色念珠 菌最为典型,不敏感或耐药性达100%.出现上述结果的可能 原因是不规范的用药(在农村地区主要为疗程短,不复查) 使抗真菌药起到了筛选和消灭敏感株的作用,从而使得耐药 株在药物存在情况下选择性存活下来;或者是抗真菌药诱导 敏感株突变为耐药株.NYS是治疗假丝酵母菌外阴阴道炎 的传统用药,但研究中我们发现实验菌株对NYS的敏感性 (64%)高于吡咯类抗真菌药;出现该现象的可能原因是放弃 了传统药物或是NYS使用方法不当.因为NYS不溶于水,阴 道给药时应该将药物碾成粉末,均匀的涂布于阴道表面.而 调查中我们发现,农村地区在使用该药时只是简单地将药片 塞入阴道,这样隐匿于阴道粘膜皱襞的假丝酵母菌得以逃逸, 并作为菌种导致复发感染.值得注意的是本研究中热带假丝 酵母菌对5一FC全部耐药,而且MIC>128mg/L.温旺荣等 也有同样的报道.其可能原因是患者感染的即为具有遗传 稳定性的耐药菌株.研究中我们还发现,25株实验菌株都对 6种实验药物中1种或几种敏感.上述结果提示对RVVC病人 在有条件的医院需进行假丝酵母菌分型和药敏分析,选择有 效的抗真菌药物;对没有条件的基层门诊,可选用传统药物 NYS,采用粉剂和栓剂.使药物能在阴道表面均匀分布.若 治疗无效,应转诊到有条件的大医院就诊. 4参考文献 1HayRJ.AntifugaltheoryandthenewaxoleCompouds.Journalofanti? microbialchemotherapy,1991,18(1):36 2丰有吉主编.妇产科学.北京:人民卫生出版社.2002:228 3SojakovaM.LiptajovaD,SimoncicovaMeta1.Vulvovagi【naleandidia- sisandsensitivityofpathogenstoantimycoties.CeskaGynekol,2003. 68(1):24—29 ? l60? 4ChongPP,LeeYL,TanBCeta1.Geneticrelatedness0fCandida strainsisolatedfromwomenwithvaginalcandidiasisinMalaysia. JMed Mierobiol,2003,52(8):657,666 5AlbeasonGDM,NilmiRD ,Cannoneta1.Multipleeffluxmecha. nismsaDeinvolvedinaCandidaalbieansfluconazoleresistance.Antim一 2005年第2O ierobAgentsChemother,1996,40:2835,2841 6温旺荣,徐莉敏,陈红eta1.念珠菌的药敏测定及方法学研究 福建医学院,1996,30(4):399,401 (2004-05-17收稿) [编校李秀娟] MMP一2在宫颈腺癌中的表达及其活化状态与转移之间的关系 徐琳李一雷?赵秀芝吉林省人民医院130021 中国图书分类号R737?3文献标识码B文章编号1001-4411(2005)02-0160-02 金属基质蛋白酶(MMPs)是一类zn”依赖的细胞外蛋Kit购自Invitrogen北京分公司.该方法的原理为:试剂盒中 白水解酶家族,可以降解细胞外基质所有成分,在基质重构包含与明胶交连在一起FITC荧光染料,当明胶被明胶酶降解 及胚胎发生过程中发挥重要作用.MMPs以酶原形式分泌,后,可导致荧光的激发,从而显示活化酶存在的部位和活性 随之被其他蛋白酶等激活物所激活,从而发挥生物学作用.强度.方法按说明书进行. MMP一2(明胶酶A/72kDa?型胶原酶)是MMPs家族的重要1.3阳性判定标准.MMP一2以肿瘤细胞或上皮细胞出现棕 成员,可降解细胞外基质中的IV型胶原,在肿瘤侵袭转移时黄色颗粒为阳性判定标准.MMP一2表达的判定以染色强度 起重要作用”.实验应用免疫组化的方法,研究MMP一2和阳性细胞百分率的得分之积进行评估.?染色强度:0 在各型宫颈腺癌中的表达,通过原位酶谱分析的方法,对为阴性;l为弱阳性;2为阳性;3为强阳性.?阳性细胞百 MMP一2的活化进行和定位,从而明确其在肿瘤侵袭转分率:无阳性细胞为0;<25%为l;25%50%为2;> 移日寸的作用.50%为3.两者之积最高为9,0视为阴性,l3弱阳性,4 6视为阳性,7—9视为强阳性.活化型MMP一2的观察在O一 1材料与方法LYMPUSFV500共聚焦显微镜下进行,当MMP一2活化时, 1.1材料.1996—2004年手术切除宫颈腺癌3l例,因其他出现绿色荧光,以信噪比大于2为阳性判断标准. 原因子宫全切的正常宫颈12例.宫颈癌组年龄31—75岁,1.4统计学分析.采用INSAT软件,应用检验处理数据. 平均年龄44.1岁.正常组平均年龄45.5岁.病理学分型按 WHO分类进行.伴有淋巴结转移者19例.31例宫颈腺癌中2结果 19例取材新鲜组织用于原位酶谱分析,剩余部分与其他病例2. 1正常宫颈和官颈腺癌中MMP一2的表达.MMP一2在正 组织按常规方法包埋,固定.常宫颈上皮及腺体中无陌性表达,宫颈腺癌MMP一2的表达 1?2方法c全部标本按常规制成3,4Ixm厚的连续切片,依率为77. 4%,各亚型之间表达率无显着性差异(P>0.05), 次进行苏木素一依红染色(HE)及免疫组织化学染色.19例肿瘤细胞阳性表达定位于细胞膜和细胞浆,染色阳性的细胞 新鲜组织制备冰冻切片,通过原位酶谱分析的方法,对MMP呈散在,片状或灶状分布.肿瘤问质和正常官颈基质中,部 一 2的活化进行检测和定位.分血管内皮细胞,浸润的单核细胞和淋巴细胞也可见阳性反 1.2.1免疫组织化学染色.采用sp法,鼠抗人MMP一2单应. 克隆抗体及免疫组化染色试剂盒均购自迈新生物制剂有限公2.2MMP一2表达与临床分期及淋巴结转移的关系.结果显 司.切片脱腊,浸入修复液中,98%热修复5min.冷却后用示,宫颈腺癌临床I期,II期和IIIIV期MMP一2阳性率分 过氧化氢溶液(A液)阻断15min去除内源性过氧化酶活别为75%,77.8%和77.8%,组间无显着性差异(P> 性.用血清(B液)封闭后,用l:200稀释的鼠抗人MMP一20. 05).淋巴结转移组MMP一2阳性率高达89.5%.明显高于 单克隆抗体孵育切片,4?过夜,再用生物素标记的二抗(C无淋巴结转移组(58. 3%),两组间差异显着(P<0.01), 液)和链霉素抗生物素一过氧化物酶(D液)孵育,各10见表l. min(37?),其间用PBS缓冲液洗涤.DAB(现配)发色.2. 3MMP一2的活化与宫颈腺癌淋巴结转移之间的关系.采 经苏木素复染后,常规脱水,透明,封片.镜下观察并摄片.用原位酶谱分析的方法,检测了19例冰冻宫颈腺癌组织,以 用PBS代替一抗设阴性对照.用浸润性乳腺癌标本作阳性对明确是否存在活化型MMP一 2,并观察其分布.伴淋巴结转 照.移的宫颈腺癌组织,83.3%出现活化型MMP一2;而7例无淋 1?2?2常规HE染色.巴结转移的宫颈腺癌组织仅1例出现活化型MMP一2 1.2.3原位酶谱分析.ENZchekGelatinase/CollagenaseAssay(14.3%),两组间差异显着(P<0.01),见表2.活化型 —— MMP一2存在于肿瘤细胞膜,呈灶状或团簇状分布,多位于 ?吉林大学基础医学院病理教研室癌巢与正常组织交界处和管腔周围.