【精品文献】益母草总黄酮的提取及其对羟自由基的清除作用

【精品文献】益母草总黄酮的提取及其对羟自由基的清除作用 范文 目:益母草总黄酮的提取及其对羟自由基 的清除作用 编辑:司马小 【摘要】 目的 为充分利用益母草植物资源～避免浪费～探讨益母草总黄酮的提取、鉴别及对羟(〃OH)自由基的清除作用。方法 采用超声波乙醇浸提法从益母草中提取黄酮类物质～对所提取的黄酮类物质进行验证～并用分光光度法测定含量～用益母草总黄酮对羟自由基清除作用进行试验。结果 测得样品中总黄酮的含量X=0.4099mg/ml～回收率为101.6%～其纯度和产率均较高。结论 该方法采用全物理过程～无任何污染～是提取益母草黄酮类物质的有效途径。益母草总黄酮提取液对Fenton体系产生的〃OH自由基有很好的清除作用。 【关键词】 超声波提取,益母草,植物提取物,黄酮类,鉴别,羟自由基,清除 Abstract: Objective In order to make full use of the resources of Leonurus and avoid wasting～identifying the process of extracting total flavone from Leonurus and its differentiating and the effect on scavenging of hydroxyl radicals. Methods The flavones were extracted by using ethanol as the solvent from Leonurus with ultrasonic wave and extraction method.A spectrophotometry was used to extract and check the flavones of Leonurus.The effect of Leonurus on scavenging of hydroxyl radicals was studied. Results The density of the total flavone of Leonurus was X=0.4099mg/ml and the rate of recovery was 101.6%～which had a highly purity and yield rate. Conclusion This test provides the extraction and purifying methods to obtain high quantity and purity of extracts from Leonurus.This method is a purely physical process and has not any pollution.It is an ideal way to extract the flavones of Leonurus.Total flavone from leonurus has effects on scavenging of hydroxyl radicals. Key words: ultrasonic extraction,Leonurus L.,plant extracts,flavones,differentiation,hydroxyl radical, scavenging 益母草为唇形科植物益母草(Leonurus Japonicus Houtt()的新 鲜或干燥地上部分～原名茺蔚。全草含生物碱、黄酮、酚类、氨基 酸、有机酸、糖类,具有调经止血～保护心肌缺血再灌注损伤～抗血 小板聚集～降低血液粘度等作用。在临床上可用来治疗痛经、流产后 出血、冠心病、心肌缺血、高粘血症、肾炎水肿、风湿关节疼痛等疾 病～具有广泛的药理活性,1,。我们曾采用乙醇提取法对益母草总黄 酮进行提取,2,～但该方法提取的效率仍然较低。近年来～随着超声 技术应用于提取植物中的生物碱、苷类、生物活性物质、动物组织浆 的毒质等的研究,3～4,～表明其具有能耗低、效率高、不破坏有效 成分的特点。也可利用超声波产生的强烈振动、高的加速度、强烈的 空化效应、搅拌作用等～加速植物材料中的有效成分进入溶剂～从而 增加有效成分的提取率～缩短提取时间～并且还可避免高温对提取成 分的影响,4,。为此～现将我们采用超声波乙醇浸提法提取益母草总 黄酮、鉴别及提取物总黄酮对羟(〃OH)自由基的清除作用的结果 如下。 1 仪器与试剂 1.1 仪器 KQ5200DB型数控超声波清洗器,超声工作频率40kHz)昆山市超声仪器有限公司,,UV-755B紫外可见分光光度计,上海仪器总厂,,ZF-I型三用紫外分析仪(上海顾村光电仪器厂),SHB-III循环水式多用真空泵,郑州长城科工贸有限公司,。 1.2 试剂 95%乙醇AR,亚硝酸钠AR,硝酸铝AR,氢氧化钠AR,三氯化铝AR,盐酸AR,氨水AR,冰醋酸AR,乙酸乙酯AR,乙酸镁AR,甲醇AR,镁粉AR,正丁醇AR,芦丁品,中国药品生物制品检定所,,双氧水AR,硫酸亚铁AR,水杨酸AR,新鲜益母草,采自广西百色市,。 2 方法与结果 2.1 总黄酮成分提取 取新鲜益母草～烘干～粉碎。称取益母草粉末约6g～加80ml 95%乙醇～超声波提取2.5h～抽滤。滤渣再加80ml 95%乙醇～超声波提取2.5h～抽滤～合并两次滤液～减压回收乙醇至滤液仅剩25ml左右为止～放置250ml容量瓶中～用60%乙醇稀释至刻度～得样品液。 2.2 测定方法依据 以芦丁为对照品测定益母草中总黄酮的含量～加入铝离子试剂～同时控制适宜pH值～使黄酮化合物与铝盐形成络合物～在可见光区能获得稳定的特征吸收峰。 2.3 定量实验—总黄酮的含量测定 2.3.1 波长的选择 取样品液适量～在0.30ml 5%亚硝酸钠溶液存在的碱性条件下～经硝酸铝显色后～以试剂为空白参比液在420，700nm波长范围测定络合物的吸光度～络合物于510nm波长处有最大吸收～故测定时选用此波长。 2.3.2 标准曲线的绘制 分别精密吸取芦丁对照液,0.10mg/ml,0.00～0.50～1.00～2.00～3.00～4.00～5.00ml于10.00ml容量瓶中～分别加入5%亚硝酸钠溶液0.30ml～摇匀～静置6min,再加10%硝酸铝溶液0.30ml～摇匀～静置6min,再加4%氢氧化钠溶液4.00ml～ 用60%乙醇稀释至刻度～摇匀～静置12min～以试剂作空白～于510nm处测吸光度。吸光度测定结果见表1。 表1 紫外可见分光光度计测定吸光度,略, 根据上表得回归方程:=-0.0311+13.5184X～r=0.9999 2.3.3 提取物含量的测定 精密吸取样品液0.50ml～置10ml容量瓶～按标准曲线的制备方法测定吸光度=0.246～根据回归方程:=-0.0311+13.5184X～计算样品中总黄酮的含量X=0.4099mg/ml。 2.3.4 回收实验 精密量取样品液2.00ml～加入标准芦丁对照品2.00ml,0.10mg/ml,～同前样品测定方法操作测定吸光度～求出回收率为101.6%。 2.4 定性实验—总黄酮的鉴别 2.4.1 颜色反应 紫外光下呈色反应:取该样品溶液点在滤纸上～在可见光下呈灰黄色～在紫外光下呈灰褐色并有荧光斑点。浓氨水反应:取该样品溶液点在滤纸上～将滤纸在氨水上方熏0.5min～立即在紫外光下观察～呈极明显的黄褐色荧光斑点。三氯化铝反应:取样品溶液点在滤纸上～滴加,,三氯化铝乙醇溶液～吹干～在可见光下呈灰黄色～在紫外光下呈黄色荧光斑点。乙酸镁反应:取样品溶液点在滤纸上～滴加1%乙酸镁甲醇溶液～吹干～紫外光下呈黄色斑点。盐酸—镁粉反应:取乙醇提取液1ml于试管中加镁粉～再加入浓盐酸数滴,1次加入,～在泡沫处呈紫红色。 2.4.2 纸层析 取样品溶液10μl点在滤纸上。用正丁醇?醋酸?水=4?1?5(体积比)为展开剂～上行展开5h～取出晾干。喷1%氯化铝乙醇溶液。吹干后于紫外光下～可见荧光斑点。 2.5 总黄酮提取物对〃OH的清除作用 参照Fenton反应的方法建立反应体系模型,5,～利用H2O2与Fe2+混合产生〃OH～但由于〃OH具有很高的反应活性～存活时间短～若在反应体系中加入水杨酸～就能有效地捕捉〃OH～并产生有色产物。反应式如下: H2O2+Fe2+?Fe3++〃OH+OH- 2〃OH+ COOHOH ?COOHOHOH+H2O (无色) (有色) 该产物在510nm处有强吸收～若在此反应体系中加入具有清除〃OH功能的被测物～便会与水杨酸竞争〃OH～从而使有色产物生成量减少～采用固定反应时间法～在相同体积的反应体系(8.8mmol/L H2O21ml～9mmol/L Fe2+1ml～9mmol/L 1ml水杨酸—乙醇溶液)加入一系列不同浓度的益母草总黄酮提取液～并以蒸馏水为参比～与试剂空白液比较～在510nm处测量各浓度下的吸光度～便能测定被测物(总黄酮)对〃OH的清除作用～其清除率计算公式:清除率(,)=Y0-Yx Y0×100%以实验的提取液总黄酮作为样品～分别取不同体积的样品定容到10ml～分别测其对〃OH的清除作用。从图1中可看出～随着益母草总黄酮提取液对由Fenton体系产生的〃OH有一定的清除作用～随着益母草总黄酮提取液浓度的增加～对〃OH自由基的清除能力也增强～说明当黄酮类物质的浓度增加时～其清除率也增大。 图1 益母草总黄酮提取液浓度与自由基清除率的关系,略, 3 讨论 3.1 实验结果表明～本实验方法工艺简单～回收率为101.6%～提取效率远高于乙醇提取法,2,～是乙醇提取法的1.5倍。提取、纯化方法而得到的黄酮类物质其纯度较高。超声波可以强化乙醇浸提法～达到省时、高效、节能的目的～此方法采用全物理过程～无任何污染～是一条理想的提取黄酮类物质的途径～具有广阔的应用前景。 3.2 黄酮类化合物是一大类天然产物～广泛存在于植物界～是许多中草药的有效成分～具有很高的药用价值。在自然界中最常见的是黄酮和黄酮醇～其他包括双氢黄,醇,、异黄酮、双黄酮、黄烷醇、查尔酮、橙酮、花色苷及新黄酮类等,6,。天然来源的生物黄酮分子量小～能被人体迅速吸收～能通过血脑屏障～能进入脂肪组织～进而体现出如下功能:消除疲劳、保护血管、防动脉硬化、扩张毛细血管、疏通微循环、抗脂肪氧化、抗衰老、活化大脑及其他脏器细胞的功能。 黄酮类化合物具有抗肿瘤、抗心脑血管疾病、消炎镇痛、免疫调节、降血糖、治疗骨质疏松、抑菌抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗辐射等作用,2～7,。近年来～世界上掀起了植物药开发的热潮～植物药以其天然低毒的特点倍受青睐～而黄酮类化合物以其广谱的药理作用 引人瞩目～益母草分布广泛～本组实验结果表明～益母草中含有较为丰富的黄酮～其提取物总黄酮对羟自由基具有很好的清除作用。因此～益母草具有广泛开发和利用价值～值得综合利用～加强资源开发。 【参考文献】 ,1, 阮金兰～杜俊蓉～曾庆忠～等.益母草的化学、药理和临床研究进展,J,.中草药～2003～34(11):15-19. ,2, 黄锁义～黎海妮～余美料～等.益母草总黄酮的提取及鉴别,J,.时珍国医国药～2005～16(5):398-399. ,3, 刘祥义.超声波提取元宝枫叶总黄酮方法研究,J,.云南化工～2003～30,1,:27-28. ,4, 谢明杰～宋明～邹翠霞～等.超声波提取大豆异黄酮,J,.大豆科学～2004～23(1):75-76～74. ,5, 李贵荣～杨胜圆.党参多糖的提取及其对活性氧自由基的清除作用,J,.化学世界～2201～42(8):21-22. ,6, 夏杏洲～张辉～魏传晚.榕树叶中黄酮类化合物的提取条件研究,J,.食品研究与开发～2002～23(5):35-37. ,7, 姚小敏～覃成箭～羊金梅～等.茶叶中总黄酮的提取、鉴别及其含量测定,J,.右江民族医学院学报～2005～27,6,:779-781.