EASYspin Plus大量组织细胞RNA快速提取试剂盒操作方法及步骤说明书

EASYspin Plus大量组织细胞RNA快速提取试剂盒操作方法及步骤说明书 杭州昊鑫生物科技股份有限公司 htpp://www.hzhxbio.com EASYspin Plus大量组织/细胞RNA快速提取试剂盒 目录号:RN41 目录编号 包装单位 RN4101 10次 , 适用范围: 适用于快速提取动物细胞和易裂解动物组织总RNA，使用独有基因组DNA清除柱技术确保有效清除gDNA残留，不需要使用DNase消化，RNA可直接用于PCR，荧光定量PCR.。 , 试剂盒组成、储存、稳定性: 试剂盒组成 保存 10次 裂解液RLT Plus 室温 100 ml 去蛋白液RW1 室温 120 ml 25 ml X 2 漂洗液RW 室温 第一次使用前按说明加指定量乙醇 15ml X 2 70%乙醇 室温 第一次使用前按说明加指定量乙醇 室温 RNase-free HO 10 ml 2 基因组DNA清除柱 10套 室温 和收集管 RNase-free 室温 10套 吸附柱RA和收集管 本试剂盒在室温储存6个月不影响使用效果。 - 1 - 杭州昊鑫生物科技股份有限公司 htpp://www.hzhxbio.com 储存事项: 1. 所有的溶液应该是澄清的，如果环境温度低时溶液可能形成沉淀，此时不应该直接 使用，可在37?水浴加热几分钟，即可恢复澄清。 2. 不合适的储存于低温(4?或者,20?)会造成溶液沉淀，影响使用效果，因此运输 和储存均在室温下(15?,25?)进行。 3. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化，各溶液使用后应及时盖 紧盖子。 , 注意事项 1. 所有的离心步骤均可在室温完成，使用可容纳50ml 离心管的离心机。 2. 样品处理量绝对不要超过基因组吸附柱DA和和RNA吸附柱RA处理能力，否则造 成DNA残留或者产量降低。不同组织细胞种类RNA/DNA相差极大，例如胸腺脾 脏DNA含量丰富，超过100mg就会超过柱子处理能力。COS细胞RNA含量丰富， 7超过6x10细胞就会超过柱子吸附能力。所以开始摸索实验条件时，如果不清楚样 7品DNA/RNA含量时宁可使用较少的样品处理量，如细胞不超过6x10，组织不超 过200mg。将来根据样品试验情况增加或者减少处理量。 3. 裂解液RLT Plus 和去蛋白液RW1中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避 免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲 洗。 4. 关于DNA 的微量残留: 一般说来任何总RNA提取试剂在提取过程中无法完全避免DNA的微量残留,本 公司的EASYspin系列RNA提取产品，由于采取了本公司独特的缓冲体系和选择 了特殊吸附能力的吸附膜，在大多数RT-PCR 扩增过程中极其微量的DNA残留 - 2 - 杭州昊鑫生物科技股份有限公司 htpp://www.hzhxbio.com (一般电泳EB染色紫外灯下观察不可见)影响不是很大, 如果要进行严格的 mRNA表达量分析如荧光定量PCR,我们建议在进行和引物的选择时: 1) 选用跨内含子的引物,以穿过mRNA中的连接区,这样DNA就不能作为模板参与扩 增反应。 2) 选择基因组DNA和cDNA上扩增的产物大小不一样的引物对。 3) 将RNA提取物用RNase-free的DNase I 处理。本试剂盒还可以用于DNase I处理后 的RNA清洁(cleanup),请联系我们索取具体操作说明书。 4) 在步骤去蛋白液RW1漂洗前，直接在吸附柱RA上进行DNase I处理。请联系我们 索取具体操作说明书。 5. RNA 纯度及浓度检测: 完整性: RNA 可用普通琼脂糖凝胶电泳 (电泳条件:胶浓度1.2%;0.5×TBE电 泳缓冲液;150v，15 分钟)检测完整性。由于细胞中70%-80%的RNA 为rRNA， 电泳后UV 下应能看到非常明显的rRNA 条带。动物rRNA 大小分别约为5 kb 和 2kb，分别相当于28S 和18S rRNA。动物RNA 样品中最大rRNA 亮度应为次大 rRNA亮度的1.5-2.0 倍，否则表示RNA 样品的降解。出现弥散片状或条带消失 表明样品严重降解。 纯度:OD260/OD280 比值是衡量蛋白质污染程度的指标。高质量的RNA， OD260/OD280 读数(10mMTris, pH7.5)在1.8-2.1 之间。OD260/OD280 读数受 测定所用溶液的pH 值影响。同一个RNA 样品，假定在10mM Tris，pH7.5 溶液 中测出的OD260/OD280 读数1.8-2.1 之间，在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9 之间，但这并不表示RNA 不纯。 浓度:取一定量的 RNA，用RNase-free 水稀释n 倍，用RNase-free水将分光光 度计调零，取稀释液进行OD260, OD280 测定，按照以下公式进行RNA浓度的 计算:终浓度(ng/μl)= (OD260)×(稀释倍数n)×40 - 3 - 杭州昊鑫生物科技股份有限公司 htpp://www.hzhxbio.com , 操作步骤:(实验前请先阅读注意事项) 提示: , 第一次使用前请先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入指定量无水乙醇! 1. 组织培养细胞 8a. 收集<2x10悬浮细胞到一个合适大小离心管，对于贴壁细胞，孔板培养可以 直接裂解，细胞瓶培养应该先用胰蛋白酶消化后吹打下来收集。 b. 10,000-13,000x g离心20秒(或者300g离心5分钟)，使细胞沉淀下来。完 全吸弃上清，留下细胞团，注意不完全弃上清会稀释裂解液导致产量纯度降低。 888c. 轻弹管壁将细胞沉淀完全松散重悬，加5ml (<10细胞)或10ml (1x10-2x10 细胞)裂解液RLT Plus，吹打混匀后用手剧烈振荡20秒充分裂解。 6d. 匀浆:(处理细胞量极少时<2x10一般不需要，涡旋振荡一分钟匀浆)。用带 钝针头的一次性 10 ml(配0.9mm针头) 注射器剧烈抽打裂解物10 次以上或直到 得到满意匀浆结果(或者电动匀浆60秒) ，可以剪切DNA，降低粘稠度防堵塞柱 子和提高产量。 e. 将裂解混合物或匀浆混合物全部加到DNA清除柱上(清除柱放在收集管内)。 。 f. 立刻接操作步骤项下3 2. 动物组织(例如鼠肝脑) a. 电动匀浆:新鲜组织用解剖刀迅速切成小碎块,加入5ml(<250mg组织)或者 10ml(400-500mg组织)的裂解液RLT Plus后电动彻底匀浆1分钟。 b. 液氮研磨+匀浆:在液氮中研磨组织成细粉后，取适量组织细粉(250mg/500mg) - 4 - 杭州昊鑫生物科技股份有限公司 htpp://www.hzhxbio.com 转入装有5ml/10ml组织裂解液RLT Plus的50ml离心管中, 用手剧烈振荡20秒， 充分裂解。用带钝针头的一次性 10 ml(配0.9mm针头) 注射器剧烈抽打裂解物 10 次或直到得到满意匀浆结果(或者电动匀浆60秒) ，可以剪切DNA，降低粘 稠度防堵塞柱子和提高产量。 c. 将匀浆后裂解物10,000-13,000x g离心5分钟,沉淀可能存在的裂解困难的碎 片或者不溶物, 将裂解物上清全部加到DNA清除柱上(清除柱放在收集管内)。 d. 立刻接操作步骤项下3。 3. 立刻10,000-13,000x g离心5分钟，保留滤过液(RNA在滤过液中)。 确保离心后液体全部滤过去，膜上没有残留，如有必要，可以加大离心力和离心 时间。 ml/10ml，滤过时候损失体积应该4. 用微量移液器较精确估计滤过液体积(通常为5 减去),加入等体积的70%乙醇(请先检查是否已加入无水乙醇!),此时可能出现 沉淀,但是不影响提取过程,立即吹打混匀,不要离心。 5. 将混合物加入一个吸附柱RA中，(吸附柱放入收集管中)10,000-13,000x g离心3 分钟(确保全部通过，膜上无残留液体，否则应加大转速和时间)，弃掉废液。 6. 加10ml 去蛋白液RW1，室温放置1分钟，12,000x g 离心3分钟，弃掉废液。 7. 加入10ml漂洗液RW(请先检查是否已加入无水乙醇!)，10,000-13,000x g离心 1-2分钟，弃掉废液。加入10ml漂洗液RW，重复一遍。 8. 将吸附柱RA放回空收集管中，13,000x g离心5分钟以干燥膜基质残留乙醇，用 枪头吸除内圈压环和柱壁之间可能残留的乙醇，室温或者烘箱晾干几分钟。 9. 取出吸附柱RA，放入一个RNase free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的 中间部位加500μl -1ml RNase free HO， 室温放置3分钟，12,000x g 离心2分钟。 2 10. 如果预期RNA产量>0.6mg，加300-500μl RNase free HO重复步骤9，合并两次2 洗脱液，或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍(如果需要RNA浓 - 5 - 杭州昊鑫生物科技股份有限公司 htpp://www.hzhxbio.com 度高)。 洗脱两遍的RNA洗脱液浓度高, 分两次洗脱合并洗脱液的RNA产量比前者高15–30%,但是浓度要低, 用户根据需要选择。 - 6 -