大熊猫Ⅰ类MHC分子标记系统的建立及其适应性进化的研究（可编辑）

大熊猫Ⅰ类MHC分子标记系统的建立及其适应性进化的研究（可编辑） 大熊猫?类MHC分子标记系统的建立及其适应性进化的 研究 ? 指导教师签名:左盛国熬援互趑红副邀援 论文评阅人: 隐垒丑闼 评阅人: 隐名迁闺 评阅人: 隐名迁闺 评阅人: 隐名迁阅 评阅人: 隐名迁因 答辩委员会主席: 王?明』数援』坐盔垣范太堂垒佥叠堂堂瞳 委员:萱哓荩纽究员』生叠院盛垫生堑珏究压 委员: 奎蛆避究送』主叠睦边堑盈究压 委员: 王监盛纽究员』生整睦昆明邈堑珏究压 委员: 芸坐』数援』堡生垣范太堂生佥銎堂堂院 委员: 扬里笙』数援』浙江太堂生佥叠堂堂暄 委员: 左盛国』数援』浙江太堂生佥銎堂堂睦 答辩日期: 生?自鱼旦 ’ :?. ?. : : : :浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果.除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他入 已 经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得逝婆太堂或其他教育机构的 学位或证书而使用过的材料.与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均 已在论文中作了明确的说明并表示谢意. 学位论文作者签名:缂鞋 签字日期:仁、年多月占日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解逝婆太堂有权保留并向国家有关部门或机 构送交本论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅。本人授权.逝逛太堂 可以将学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索和传播,可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 保密的学位论文在解密后适用本授权书 、~弋 ’ 导师签名: 学位论文作者签名:舞轾 勇黟国 签字日期:文夕’年月朔日 签字日期:加眨年如喀日浙江大学博士学位论文 大熊猫类姗分子标记系统的建立及其适应性进化研究 致谢 本论文的完成离不开方盛国教授和万秋红教授这两位导师的悉心指导。从 论文的选题,课题的设计,实验的分析以及论文的撰写,每一个环节都凝聚着 两位老师的心血五年前我得以进入方老师带领的濒危动植物教育部重点实验 室学习,虽然在课题的实验过程中曾遇到许多意想不到的困难,但是两位导师 孜孜不倦的指导帮我渡过了一个又一个的难关,特别是在我对实验失去信心 的 时候,两位导师总是不断鼓励我,给了我很大的精神支持,使我坚持走到了最 后。此外,两位导师对我的生活上也提供了很大的帮助,学生在此致以真挚的 谢意 感谢曾长军博士和潘慧娟博士在大熊猫基因研究方面做的前期工作 感谢喻斌同学完成了本课题的部分实验 特别感谢德育导师葛云法老师在我五年的学和生活上的悉心关怀您乐 观积极向上的态度是我永远学习的目标感谢同一届的何珂、龚杰和倪小伟同 学,与我分享了这五年生活的苦与乐感谢博士期间与我相处过的所有兄弟姐 妹,大家共同营造了团结互助的氛围,让我渡过了五年愉快和难忘的博士生 活。 感谢我的家人一直以来对我无私的关爱。正是你们的支持和理解,才使我 能够全身心投入科研,顺利完成学业。 再次感谢以上提及以及未提及却给予我无私帮助的人 最后,衷心祝愿: 我的导师方盛国教授、万秋红教授以及全家幸福快乐 给予我无私帮助的人们平安快乐 我所在的濒危动植物教育部重点实验室蒸蒸日上 我的母校浙江大学明天更加辉煌 朱英 年月于浙江大学紫金港浙江大学博士学位论文 大熊猫类删分子标记系统的建立及其适应性进化研究 摘要 大熊猫是我国特有的国家级重点保护的濒危物种,栖息地的严重片断化 已致其现今仅分布于秦岭,岷山、邛崃、大相岭、小相岭和?山等个彼此完 全隔离的山系. 后更新世的气候突变虽导致众多的物种灭绝,但大熊猫却奇迹般存活下来 并延续生存繁衍而被誉之为当今的“活化石”物种,且其对环境变化的适应 性分 子进化机制,也油然成为了学界的关注热点。 主要组织相容性复合体 ,是脊椎 动物基因组中多态性极高的功能性基因家族之一,所编码的蛋白分子具有呈 递 抗原并激发免疫反应而使物种世代维持其应对环境变化能力的功能,为迄今 开 展脊椎动物环境适应性进化研究的主要分子标记。鉴此,本文在通过构建类 的克隆重叠群而分离获得全部类基因,并进一步建立这些 基因的特异性基因型和单倍型的分型而终究搭建了类分子完善的标 记系统的前提下,完成了大熊猫野外个山系的遗传变异.山系分化和适应性 进化的多态性维持机制的研究工作。其相关的主要研究结果并附之微卫星 中性分子标记的佐证检测的整合分析结论如下: 共筛选获得了个包含类基因的阳性克隆。据此构建的两 个克隆重叠群的长度,分别为和。经预测, 两个克隆重叠群中共有个类基因,分别将其命名为.、 .、.、.、.和.。 组织表达检测和的全序列分析表明:.、.、.和 .均具有广泛的组织表达和正常的外显子结构,为经典的类 基因。而.和.则为特异的组织表达,且外显子的结构 异常,为非经典的类基因. 建立了.、.、.和. 个经典的类基因的外 显子和外显子的特异性基因型分型,以及外显子~的单倍型分型的 方法。该方法经已知大熊猫圈养家系的分型验证,表明其准确有效。 对随机采自个山系的只野生大熊猫的样品进行群体检测与分 ?浙江大学博士学位论文 大熊猫类分子标记系统的建立及其适应性进化研 究 析后,发现除.基因为单态之外,其余的.、.和 基因均为多态,且个多态基因共含有条单倍型序列:. 条、 . 条和. 条。相对于其它的濒危食肉类动物,大熊猫的类 基因具有中度水平的遗传多态性。 所获得的个多态性基因抗原结合区的非同义置换率高于同义置换率、 与相比,所揭示的种群分化程度较中性标记的结果为低,以及不同 山系种群共享多数等位基因的结果,表明大熊猫的类基因为平衡 选择的进化模式。 整合类基因与微卫星的检测分析结果,发现秦岭山系的大熊猫与 岷山、邛崃、大相岭、小相岭和?山等其它个山系的大熊猫之间,已出 现了显著的遗传分化尸.;只。蛐?.,从而自环境适 应性进化的角度,支持了秦岭山系为大熊猫的一个独立亚种的分类学结 论。同时,在四川亚种所属的个山系种群中,岷山山系与邛崃山系进化 形成了一个复合的遗传单元一‘岷山.邛崃”单元,而大相岭山系、小相 岭山系和?山山系则进化形成了另一复合的遗传单元‘‘大相岭.小相 岭.?山”单元。鉴此,本文建议将野生大熊猫划分为“秦岭”、“岷山.邛崃” 和“大相岭.小相岭.?山”等个独立的遗传管理单元予以保护和管理。 关键字:大熊猫; ;平衡选择;山系分化。 肠玎。饴“口., :,,,, . .,. 删. ..,. .. : ,. ,, 彳砌.,.,.,. . ? , ? , ? ; /. ? 口/?,?, . /? , /,一.:/,/? /., . 一似/?, ; ; . 谢 、析 . 限.;瓶.. ,‘”, “??’. , 浙江大学博士学位论文 大熊猫类删分子标记系统的建立及其适应性进化研究 : ‘‘’’, ‘‘?’’ ‘?”. : ,,大熊猫类删分子标记系统的建立及其适应性进化研究 浙江大学博士学位论文 目录 致谢.. 摘要.插图清单??。 表格清单第一部分绪论??. 第章大熊猫的研究背景 .大熊猫的历史分布和生存现状??.. .大熊猫的保护遗传学研究第章主要组织相容性复合体??.. . 基因的分类、结构和功能??. ..类基因的组织分布、结构、功能??.. .. 类基因的分布、结构和功能?. .. 类基因的分类? . 的多态性及其维持机制一 .自然种群选择作用的检测..物种进化历史上选择作用的检测..现代种群选 择作用的检测?.. . 的进化 . 在进化生态学与保护遗传学中的应用意义? . 研究中存在的问题第章微卫星标记及其应用. 第章立论依据、研究目的和内容. 第二部分研究内容? 第章大熊猫类基因的分离. .材料?. ..样品? ..主要试剂 ?浙江大学博士学位论文 大熊猫类分子标记系统的建立及其适应性进化研究 ..主要仪器和设备??.. .方法 ..血液基因组提取。 ..血液及组织,琶.的提取?. .. 的分离?. ..第一链的合成及扩增? ..大熊猫类基因序列的分离..大熊猫类基因物理图谱的构建 ..大熊猫类基因的表达检测??. ..大熊猫类基因全长的获得??. .结果与讨论?.. ..大熊猫类基因物理图谱的构建 ..大熊猫类基因的表达检测及全长的序列分析. .小结??.. 第章大熊猫适应性进化研究.材料?. ..样品来源?. ..主要试剂? ..主要仪器和设备??。 .方法. ..基因组的提取与纯化..大熊猫经典类基因座位特异性引物的设计? ..大熊猫经典类基因座位特异性扩增? ..大熊猫经典类基 和 的分型?.. ..大熊猫类基因位点特异性单倍型方法的建立 ..大熊猫粪便样品个体数目的确认..数据处理??。 .结果?. ..大熊猫基因组的提取?. ?浙江大学博士学位论文 大熊猫类~分子标记系统的建立及其适应性进化 研究 ..大熊猫类基因群体调查结果? ..大熊猫类基因位点特异性单倍型方法有效性的确认 ..野外粪便样品个体数目的确认结果.. ..大熊猫类基因的序列变异..大熊猫野生种群类基因的变异 ..大熊猫类基因的选择作用??. ..大熊猫类基因的种群结构与种群分化 .讨论?. ..大熊猫类基因的遗传变异水平 ..非编码区内含子的进化分析??.. ..大熊猫类基因种群间的单倍型分布? ..大熊猫野生种群的遗传分化? ..大熊猫类基因的平衡选择.小结?. 第章大熊猫适应性进化的微卫星辅佐研究.材料?. ..样品来源??.. ..主要试剂 ..主要仪器和设备 .方法?. ..基因组的提取与纯化..微卫星引物的选取与扩增..微卫星基因型的分型。 ..微卫星数据的处理。 .结果?. ..基因组的提取结果??. ,.微卫星位点的无效等位基因,连锁不平衡以及哈.温平衡检测? .微卫星遗传多样性的分析?.. ..微卫星的遗传分化与种群结构.. 浙江大学博士学位论文 大熊猫类删分子标记系统的建立及其适应性进化研究 .讨论?. .小结? 第三部分结论 第章主要结论、创新点及展望?. .主要结论.创新点 .展望?. 参考文献 作者简历?. 攻读博士学位期间的科研成果..:..??..?:?...?:?:.:.:.:?:浙江大学博士 学位论文 大熊猫类蛐分子标记系统的建立及其适应性进化研究 插图清单 图.大熊猫的栖息地分布图 图.类和类分子的结构图? 图.引物/扩增基因组的.的复原图??. 图.大熊猫类基因区域的克隆重叠群及组织表达检测电泳图.. 图.大熊猫血液、皮张和粪便基因组提取结果?。 图.大熊猫.基因 和 的扩增结果?.. 图.大熊猫.基因 和 种群变异检测图??. 图.大熊猫.基因 的扩增结果?.. 图.大熊猫.基因 和 的扩增结果?。 图.大熊猫.基因 和 种群变异检测图??. 图.大熊猫.基因~的扩增结果图.大熊猫.基因和 的扩增结果图.大熊猫.基 因 和 种群变异检测图??.. 图.大熊猫.基因 ~的扩增结果图.大熊猫.基因 和 的扩增结果? 图.大熊猫.基因 和 种群变异检测图图.大熊猫..基因 ~的扩增结果? 图.大熊猫类基因和结构域氨基酸序列比对结果?.. 图.大熊猫类基因内含子序列共享图和序列比对图? 图.基于和微卫星所获得的大熊猫个野生种群遗传距离对比图?一 图.基于微卫星变异对大熊猫个种群进行的贝叶斯归类分析. 浙江大学博士学位论文 大熊猫类分子标记系统的建立及其适应性进化研究 表格清单 表.第一链合成及扩增所需的接头引物. 表.大熊猫类基因克隆的末端引物 表.大熊猫类基因特异性表达检测引物 表.大熊猫类基因全长引物??. 表.大熊猫.人及其他哺乳动物类基因克隆情况比较 表.大熊猫样品信息表. 类基因 , , ~的座位特异性引物??. 表.大熊猫个野生种群个经典类基因的单倍型频率和杂合度表.大熊猫类基因个多态位点的非同义置换率和同义置换率表.大熊猫野生种群间类基因的种群分化系数及显著程度? 表.基于基因型对大熊猫不同地理组群划分的分子变异结果? 表.基于个多态位点的大熊猫分子变异等级分析结果 表.大熊猫个多态性微卫星位点引物信息表.大熊猫个野生种群个位点的遗传多样性??.. 表.大熊猫野生种群微卫星的种群分化系数及显著程度??.. 表.基于微卫星基因型对大熊猫不同地理组群划分的分子变异结果.. 表.微卫星的大熊猫分子变异等级分析结果?. ?浙江大学博士学位论文 大熊猫类眦’分子标记系统的建立及其适应性进化研究 ?。。。‘。。。。。‘?『 第一部分绪论 第章大熊猫的研究背景 .大熊猫的历史分布和生存现状 大熊猫是一种古老的动物,古籍名又称貘、貔貅或白熊。大熊猫虽以竹子为 主食,但在分类学上却隶属食肉目动物胡锦矗,。然而,在“目”这一分 类阶元之下,大熊猫究竟应属浣熊科、熊科还是大熊猫科,却长久地存在着争 论 马逸清等,。多年来,相关学者对其染色体核型、分子生物学和古生物 学等方面广而系统的研究罗昌蓉,;’ .,;宗冠福,; ,终使大多数学者接受了将大熊猫独立为一 黄万波,; 科??大熊猫科的观点。 在距今约万年前的更新世中期,大熊猫曾广泛分布于我国东南黄河、长 江和珠江流域,北至北京的周口店,南抵越南、泰国和缅甸的北部,是我国南 方 大熊猫.剑齿象动物群中的主要成员冯文和等,;胡锦矗,;潘文石 等,,即使是到了距今约万年前的新石器时代,我国广西的来宾也还有 大熊猫的分布胡锦矗,。 然而,面对现代农业和现代林业的飞速发展而对栖息地之非逆转的严重破 坏,大熊猫这一曾经广域分布的物种也不得不被迫退缩至现今四川、陕西和 甘肃 三省毗邻的高山峡谷中残存图.,其彼此孤立的秦岭、岷山、邛崃山,大相 岭、小相岭和?山等个山系的数量,仅分别约有只、只、只、 只、只和 只国家林业局,,并各自或彼此间形成了独特的进化历 史 .,;;方盛国等,。虽然自上世纪年代未我国各 级相关部门日渐加大了野外栖息地的就地保护力度,但各山系内部诸如公 路、铁 路、农田和人居等因素的干扰又进而将物种破碎为多个极小种群,其生存仍 面临严重威胁赵学敏,;方盛国等,.浙江大学博士学位论文 大熊猫类唧分子标记系统的建立及其适应性进化研究 图.大熊猫的栖息地分布图。饼状图表示大熊猫大山系栖息地面积比例 图根据国家林业局年的数据绘制。 . . . , , .大熊猫的保护遗传学研究 保护遗传学是集生态学、分类学、分子生物学、种群遗传学、进化生物学等 学科为一体的综合性学科 .,。它研究的焦点是受环境胁迫 的小种群,涉及“如何确定种下水平的分类地位”,“如何界定保护单元和管理单 元”,“如何鉴定动物个体”, “如何揭示物种的交配机制和迁移模式”,以及“基 于受胁迫的程度和种群结构与遗传结构的现状提出物种的保护对策”等方面的内大熊猫类删分子标记系统的建立及其适应性进化研究 容 .,;方盛国等,。近年来,国外动物保护遗传学 发展迅猛,研究成果频出,在濒危物种保护方面的作用日益凸显。大熊猫作为 我 国特有的珍稀濒危物种,无疑是保护遗传学家所关注的对象。尽管我国保护遗传 学的整体水平与国际相比存在一定的差距,但是大熊猫的保护遗传学研究进展却 非常可观。 等利用线粒体限制性片段长度多态性、线粒体控制 区、核指纹图谱和微卫星四种分子遗传标记对秦岭、岷山、邛崃三个山系 的只大熊猫进行遗传多样性检测,发现大熊猫与其他相似的食肉动物相比如 印度豹和北美洲豹,具有中等水平的遗传多样性,且秦岭的遗传变异能力低于 ,。等通过随机检测秦岭、岷山、邛崃、 岷山和邛崃 大相岭、小相岭和?山这个山系大熊猫个体的指纹图谱,发现大约年前, 秦岭山系与和其他个山系之间已经产生了显著的分化,并结合形态学上的差 异,将秦岭种群命名为一个新的亚种,即秦岭亚种..,而四川 的个种群为指名亚种..;此外,作者获得的个山系的遗传 多样性参数表明,岷山、邛崃和秦岭的遗传多样性最高,大相岭和小相岭的最低,,; ?山山系的居中 ,。等运用 个微卫星位点和线粒体控制区两种遗传标记对秦岭、岷山、邛崃、?山和相岭的 大熊猫进行遗传检测后发现:与其他熊类相比,大熊猫具有较高的遗传多样性; 各个山系已产生了遗传分化,其中以秦岭和其他山系的分化最为显著;大熊猫种 群的衰退始于几千年前,而人类的活动加剧了其衰退的过程 .,。 等运用个微卫星标记对两个最大的圈养种群成都大熊猫繁育 基地和中国大熊猫卧龙保护中心和来自王朗和宝兴自然保护区的野生大熊猫进 行了遗传多样性的比较,认为圈养种群的等位基因杂合度和多样性均低于野生种 群,并提出为改善此状况,应将野生种群引入到圈养种群 .,。 等运用个微卫星位点和线粒体控制区对?山山系的大熊猫进行了遗 传变异的评估,认为此山系的遗传多样性处于大山系的中等水平以及人类活动 ., 导致栖息地的丧失是此种群在.年前产生衰退的主要原因 除了以上遗传多样性和种群结构的研究之外,一些学者对于大熊猫的扩散模 式、景观遗传学也作了初步的探讨。等利用个多态的微卫星位浙江大学博士学位论文 点对岷山几个自然保护区的大熊猫的扩散模式进行了研究,数据表明大熊猫是雌 性偏好的扩散模式,作者结合生态学数据以及大熊猫的生活历史,认为产生这种 模式有可能是由于雌性大熊猫之问的繁殖竞争以及避免近交繁殖所致 ,。等对来自大相岭和小相岭的份粪便样品和份血液 样品进行了个微卫星位点和线粒体控制区的检测,结果表明两个种群大约在 年前便产生了分化,此时间与大渡河谷底岩石形成的时间吻合,推断大渡 河是造成两个山系分化的主要缘由,而国道的建设进一步阻断了两个山系大 熊猫的基因交流,加剧了种群之间的分化 ., 。 其次,大熊猫亲子鉴定方面的研究也取得了很大的进展。尽管指纹图 谱、扩增片断长度多态性和微卫星都能用来做亲缘关系的鉴定,但微卫星由于具 有共显性遗传、广泛的基因组覆盖,高的可变性以及简单的分型方法使得其成为 亲子鉴定的首选标记。近期等人建立了一种快速而高效鉴定圈养大 熊猫亲子关系的方法:利用/参数初步筛选微卫星位点,然后再进行亲 .,。 子鉴定,达到简便快速和准确有效的效果 上述所涉及到遗传多样性的研究多采用中性标记线粒体控制区,指 纹图谱或者微卫星标记,虽然能反映种群历史,种群结构等方面的问题,但是 并不能反映出大熊猫在种群历史进化过程中的适应性进化潜力。而大熊猫又面临 着高疾病感染率和死亡率的威胁胡锦矗,,使得一些学者开始探索与大 熊猫疾病抗性有关的基因研究,如与免疫相关的主要组织相容性复合体 基因的研究。目前已取得的成果有:通过荧光原位杂交,将大熊猫基因 组定位于第号染色体长臂 .,;大熊猫类的基因区域长 度为 .,,包括、、、、和区;表达 的类基因经典座位包含个基因和和个基因、、、 .,; .,; , ;克隆到三个大熊猫类基因 .,。这些研究为后续评 估大熊猫野生种群的适应性进化潜力奠定了基础。 综上所述,近十几年来关于大熊猫的保护遗传学研究,从整体上反映出大熊 猫的遗传多样性较低以及不同山系之间的大熊猫存在一定程度的遗传分化 这一 事实。 浙江大学博士学位论文 大熊猫类姗分子标记系统的建立及其适应性进化研 究 第章主要组织相容性复合体 . 基因的分类,结构和功能 主要组织相容性复合体 是脊椎 动物体内的一类多基因家族,它编码的免疫细胞表面受体种类丰富,能够识 别并 结合细胞内的外源多肽,呈递给淋巴细胞,从而激发一系列的免疫应答反应。 因此,在脊椎动物的免疫系统里起着非常重要的作用,; ,。 主要包括类和类两个亚族。哺乳动物和鸟类的类 和类连锁在同一条染色体上; ,,硬骨鱼和两栖类的连锁情况却有所不同,硬骨鱼的类和类分别位于两条不 同的染色体上. .,; .,,而两栖类中非洲爪蟾的一组类基因却与其主要的 复合体是分离的,位于另外一条染色体上 .,。二 ? 笛目??臣目州剐憎陶曩 笛前?,酬? 尹 ‖’,二三二’。“ 。兰”鼍今跨蘑区浙江大学博士学位论文 大熊猫类分子 标记系统的建立及其适应性进化研究 自然杀伤性细胞,因此类分子主要抵御来自细胞内的病源微生物 主要是病毒,;。 类分子为由链和链以非共价键方式结合形成的异源二聚体。【 链包括胞外结构域 ,,.,、跨膜区 和胞质尾区 三个部分,由同一个 类基因所编码,图.。类基因的前导 肽外显子一般包含个左右的氨基酸残基;和仅结构域外显予 和外显子,均由个左右的氨基酸残基组成,是类分子的抗原结合区; 结构域外显子有个氨基酸残基,它不仅是与链共价结合的区域,也 是细胞表面与分子结合的部分。跨膜区和胞质尾区由外显子?编码, 前者包含大约个疏水氨基酸,能穿过质膜的脂质层,使类分子锚定在 膜上;后者由个左右的亲水氨基酸组成,位于细胞质内 .,;.,。类分子的链是 一微球蛋白,在哺 乳动物和大部分其他的脊椎动物体内,由位于另外一条染色体上的非基因 所编码,序列保守不具有多态性,主要是稳定类分子的结构,使其有效 表达于细胞表面。 .. 类基因的分布、结构和功能 与类相比,类分子的表达比较局限,主要分布在抗原呈递 细胞的表面如巨噬细胞,淋巴细胞和树突细胞,呈递外源性的多肽至细胞 毒素淋巴细胞,主要防范来自细胞外的寄生虫和病源菌 。 类分子也是由链和链以非共价键结合的异源二聚体,同样也包 含胞外结构域、跨膜区和胞质尾区三个部分。但与类分子不同的是,类分子 链和链的胞外结构域分别是,以和,,并且都是由类分子 所编码。和结构域是类分子的抗原结合位点,而以和结构域是 细胞表面与分子结合的区域图.。 .. 类基因的分类 根据基因表达方式,多态性水平和功能的不同,类基因通常被分成浙江大学 博士学位论文 大熊猫类姗分子标记系统的建立及其适应性进化研究 经典类基因 和非经典类基因 ,。 经典的类基因在体细胞中广泛表达,多态性较高,主要结合内源性 多态并递呈到细胞毒素淋巴细胞四 .,,如人类的类 基因被分为,,,在人体的各个组织中均有表达,且个基因 的多态性都很高 .,。年月/的数据显示, ,,分别具有、和个等位基因,远远高于人类其它基 因的多态?陛://...///.。 相较于经典的类,类非经典基因的表达既具有组织特异性, .,; 又具有较低的多态性,一般是单态或仅有少数几个等位基区 .,,如人类的非经典类基因分为,,,等位基因的数 目分别只有、和个://...///.,远小于经典 的类基因。但是,非经典类基因的功能却多种多样,如识别脂质抗原人类 和小鼠的远、结合并运输经典类分子和小 鼠的. .,、与自然杀伤细胞表面的受体结合调 ., 节免疫反应,、参与铁离子代谢 和母.婴互作 .,等等。另外,由于提前终止密码子的出现,非经 典的类基因的胞质尾区都较短,这也是区分经典和非经典的特征之一 .,。 . 的多态性及其维持机制 是脊椎动物基因组中多态性最为丰富的功能性基因家族之一,如人的 类基因,,分别具有、和个等位基因,类 基因 的 座位拥有 个等位基因 ://...//.。 目前,多态性的维持机制存在着两种解释。第一种解释是病源菌介导 的平衡选择? ,它通过病源茵和宿主的不断竞争 从而达到两者平衡的状态。平衡选择的假说有两种,其一:杂合子优势或者超 显性假说 浙江大学博士学位论文 大熊猫类懈分子标记系统的建立及其适应性进化研究 。由于是共显性基因,两条等位 基因都能够编码呈递抗原的分子,所以和于年提出了 如下假说:如果一个种群受到一系列病源菌的侵害,杂合子的个体比起纯 合子的个体更受到偏爱,因为杂合子基因型能够识别并结合更多的外源性多 肽, 抵抗更多的病源菌;; .,。其二:稀有等位基因优势或者依频选择假说. , 。在长期的选择作用下,病源菌对于宿主常见的基因型的抵抗力逐渐增强, 使得这些宿主体内常见的等位基因在种群中的适合度逐渐减低,这时种群中 出现 的新等位基因由于其强的抗病能力而被选择固定下来; 。病源菌的种类和宿主等位基因频率不断变化, 它们之间的“共进化”竞赛不断循环,其结果便是维持了种群的多样性 。 第二种维持多态性的机制是性选择机制 ,,包括“基于的配偶选择机制” 和“近交避免假说” 。 配偶选择机制认为,为了产生高适合度的子代基因型,交配的双方更偏爱选 择与 自己不同的基因型个体,以增加后代对疾病的抵抗力,; 。近交避免假说的前提是:不同的的基因型所决定的动物气味是不同 的,动物的亲缘关系越近意味着基因型越相似,所发出的气味就越接近。动物 通 过区分气味来避免近亲之间的交配,从而避免了近亲交配导致的适合度降低 的后 果, ;。 .自然种群选择作用的检测 ..物种进化历史上选择作用的检测 / 非同义替换 与同义替换 的比值/能检测基因是否受到平衡选择作用。根据 的中性理论,同义替换是中性的,不引起氨基酸的改变,它的替换速率浙江大 学博士学位论文 大熊猫类分子标记系统的建立及冥适应性进化研冗 应该等于中性突变的速率,即/;非同义替换改变氨基酸的构成,一般认 为其受到了选择作用。如果非同义替换造成氨基酸的改变是有害的,那么净化作 用会将这些有害的突变剔出,结果便是非同义替换的进化速率低于中性突变的速 率,即/;相反,如果非同义替换引起的氨基酸改变是有利的,这些突变 受到选择的作用会保留下来,使得非同义替换的进化速率高于中性突变的速率, 即/。因此,如果基因的抗原结合区 ,受到平衡选择作用,那么非同义替换就会被保留,/的比值应该 大于。目前许多研究将/作为判断基因受到平衡选择的指标之一 ;?,如果更进一步分析,还能够确 认到具体的氨基酸位点,; ; 。 跨物种进化? 跨物种进化或者跨物种多态性? 是另外一种检 测物种的在进化历史上是否存在选择作用的方法。 理论认为中性的多态性在物种的分化事件以后不会保留很长的时间。 随后,和指出如果受到平衡选择作用,等位基因即使经历过 物种分化事件,也能够长期保存下来,这便形成了不同物种之间共享有等位基因 的现象,即跨物种进化。如果系统树上表现出来的差异与 基因树和物种树不一致,那么前者的分化时间应早于后者 .,。 的跨物种进化现象在鱼类;;.,、有蹄类 .,、食肉类.,、啮齿类 .,和鸟类 、灵长类 等动物中都有发现。尽管跨物种进化在动物中普 遍存在,但是基因转换和基因重组事件的发生会使分析产生偏差 .,,所以某些等位基因的起源时间可能比系统树上显示的要晚 ;。 外显子和内含子的核酸多样性比较类 通过比较人类,,这个类 位点所有等位基因的外显子、、和内含子、、的核酸替换,发现内含子 平均核酸替换要低于外显子,说明这.个位点的外显子受到了平衡选择作用 塑兰奎堂堡主堂垡堡茎 奎壁堕耋竺坌王堡望至竺塑堡皇垦茎垩壁丝耋垡型 窒 。而其它基因正好相反,由于其受到净化作用剔除了外 显子的非同义突变,使得内含子的核酸替换高于外显子; 。 ..现代种群选择作用的检测 现代种群如果受到选择选用,种群的等位基因分布频率就会产生变化,并且 能够被检测出来;,,因此许多研究通过比 较等位基因的变异模式和假设种群不受选择压力条件下处于中性的变 异模式,确定种群是否受到选择作用以及受到何种选择作用 .,。 杂合子过多 平衡选择的超显性假说认为杂合基因型抵抗疾病的能力强于纯合基因型 ,因此如果种群受到的平衡选择压力足够强,在种 群中必然存在过多的杂合个体,使得种群偏离哈温平衡 。但是实际的研究情况却很复杂,一些研究未检测到明显的杂合子 ., 过多或者检测到的哈文平衡并不偏离; ;。和推测这可能是由于空间或时 间上的选择作用存在变化,不能在一个世代中检测出来;或者研究的种群样 本不 够,检测到的等位基因多样性没有达到统计学的水平;抑或是某些地理历史 的因 素作用于小种群,屏蔽了平衡选择的作。 .检验 .中性检验的原理是:在中性理论下,只有突变和漂变作用 于种群时,种群内所有等位基因频率平均分布的可能性是很低的,, 因此如果种群的等位基因频率分布偏离中性假说,意味着种群内受到了选择 作用 。检验被应用于人类 .,;.,和一些非模式生物; .,; 的平衡选择检测。然而.检验的 前提是假设在进化的时间内,种群的大小是稳定的。如果地理历史的 因素导致种群大小的波动,那么我们就不能确定在不同种群中检测到的 .检验结果到底是归因于地理历史事件还是选择作用的波动。由 于地理历史事件作用于所有的基因,但是选择作用确只作用于特定的基因,因此 浙江大学博士学位论文 大熊猫类分子标记系统的建立及其适应性进化研究 可加入中性标记作为对照,通过比较中性标记和的变异,从而排除地理历 史的因素的影响 .,。 种群结构模式 比较和中性标记作用下的种群结构可以确定选择作用的类型。如果种 群受到平衡选择的作用,基于的种群结构的遗传分化参数应该低于基于中 性标记的种群结构的遗传分化参数,即前者的值应小于后者 ., ;; .,。相反,如果种群受到的作用是波动变化 的,那么在不同的种群内会产生几套不同的等位基因,的值应大于中性标记的值 .,;; .,;。此外,一些研究结果表明和中性标记的 种群结构没有差别,推测种群不受选择作用或者选择作用很弱,也可能是受到的 几种不同的选择作用互相抵消所导致的。 . 的进化 类基因和类基因具有不同的进化历史 .,;.,。相对于类基因,类基因具有更高的复制 和转换速率 .,;,以至于在不同的动物中往往会找不到彼此同源的类基因序 列’ .,; .,,且在不同的属之间,类基因的数目和结构存在着很大差别 .,。但就类基因而言,甚至在不同的目之间均存在着 同源关系。此外,同一个物种的经典类和非经典类基因 之间的相似性,要高于不同物种问经典类或者非经典类之间的相似性 ; .,;,。因此,脊椎动物的类基 因因其具有较高的进化速率而成其为研究动物适应性进化历史的有力工具 .,; .,。 . 在进化生态学与保护遗传学中的应用意义 多年来,针对野生动物的种群结构研究,通常选用中性的分子标记如线粒体 、微星和单核苷酸多态性等,;浙江大学博士学位论文 大熊猫类分子标记系统的建立及其适应性进化研究 ,。利用这些分子标记所获得的相关参数,可在一定的程度上评估种群 或个体的变异程度,并进而探讨动物的演化史、种群历史是否经历过瓶颈效应、 扩散模式基因流的方向和亲缘关系等 .,;.,; ; .,。但值得注意的是, 中性标记的遗传变异不能反映种群受到的选择压力,从而不能评估动物对于环境 变化所产生的适应性能力,; .,。 与中性标记不同,是适应性选择标记,相关基因的遗传变异水平能够 客观反映物种在进化过程中应对环境变异的能力; ,而这也正是进化生态学和保护遗传学所关心的核心问题之一 .,; .,。此外,近期对于物种与环境之间互作 关系的研究,表明某些进化事件经常是在几十年的短期时间内发生的 .,,因此,在利用中性标记难以获得短期内种群是否经历了分化事件之 关注信息的情况下,选用可有效揭示受短期选择压力作用而留下分化印记的 标记,便成其为必然。也正因为如此,利用标记开展濒 危物种环境适应性进化的研究工作,才会受到广泛的关注并成为进化生态学 与保 护遗传学领域的前沿和研究热点 .,。 另外,的基因型和多态性往往与物种的许多生物学特征密切相关,如 个体的存活率、免疫识别能力、对于传染性疾病和自身免疫疾病的敏感?陛 ., .,; .,、个体嗅 、配偶选择 ,、亲缘识,、母婴互作及繁殖成功率等 .,。不言而喻,基因的遗传变异水平,最终影响到种群的长期生 存能力, ,所以对于深受高疾病致死率和低繁殖效率双重影响的 小种群或濒危物种来说,有关的检测数据和藉此提出的保护建议,无疑关乎 着物种的发展命运 .,; .,。 总之,在濒危动物或小种群保护中日渐广泛的应用和成功实践案例的 与日积累. .,;; .,,必将推动 进化生态学与保护遗传学的学科发展。 浙江大学博士学位论文 大熊猫类姗分子标记系统的建立及其适应性进化研 究 . 研究中存在的问题 随着分子标记在进化生态学与保护遗传学领域的运用研究的日益增多 .,,其在自身结构特征 .,;; 方面不利于实验检测的有关问题,也随即突显在相关学者的面前。 众所周知,遗传变异的研究前提,是需通过有效和准确的基因分型以 获得各个座位之不同等位基因的序列信.电,。然而,由于 分子普遍存在着基因复制和协同进化现象,; ,因此,不同物种的基因位点和各位点的等位基因数均存在着显著的 差异 .,,这就使得起始的基因分型工作便困难重重。 多年来,国内外与有关的研究工作惯于采取通用引物多位点扩增的策 .,; .,; .,; ., 略 ,但缘于不同位点序列的高度相似性,位点之间的交叉扩增则在所难 免。同时,由于同一个位点的两个等位基因之间又存在着较大的差异,所以通 用 引物之同时有效地扩增两个等位基因的通用性也随之失效,并导致无效等位基因 的产生,。文献表明,该方法所获得的位点数和各位点等位基 因的归属、属纯合位点还是杂合位点,以及进而那些关于“等位基因与病原菌” 和“基因与动物配偶选择之间的相关性”等一系列报道的结论或推论,均系值得商 榷的待定参数,甚至是毫无意义的烦扰数据。 再则,进化生态学与保护遗传学主要关注具有功能的基因。因为只有 ., 表达功能的基因,才会与动物的表型变化有着密切的关系 ;; .,,那些大量的假基因的存在,势必会影.,; 响正常的结果分析 .,;; ,并进而散播出误导的信息。 目前,人和许多模式动物基因组的完整结构或精细结构已得以解析,如人 、小鼠 .,, 大鼠 .,; .,和鸡 ,等动物的 基因组。同时,一些非模式动物的类或类基因组的解析工作也 取得了重要进展,如猪 .,、家猫 ,、狗浙江大学博士学位论文 大熊猫类旺分子标记系统的建立及其适应性进化研究 .; .,、羊 ,、马 .,、大熊猫、火鸡 .,和红腹锦鸡 .,等。这些物种 基因的功能都比较保守,在机体的免疫应答中均起着重要的作用,但各物种 之间 基因组的结构却千差万别,如与人类相比较,家猫的类缺失了整 个区基因,而区的基因数目又多于 .,,因此,如果 只了解少数模式生物的结构信息,是不能够充分说明其他生物体内抗原识 别和结合的过程的 .,,它需要更多非模式生物的基因组结 构信息的积累,以便为深入开展目的物种的种群适应性进化和性选择机制等 方面 的研究奠定基础。 总之,要研究一个物种的基因组与环境适应性有关的遗传变异,就首 先要在分离所有的基因位点 .,的前提下,进一步经基 因表达鉴定、特异性引物的再设计和单位点扩增,实现各个座位的等位基因 分离, 并在建立物种完备的分子标记系统的工作基础上,通过群体检测分析,探 索多态性的维持机制或等位基因与疾病的相关性问题。 大熊猫类姗分子标记系统的建立及其适应性进化研究 第章微卫星标记及其应用 微卫星,是基因组中短的串联重复序列,因此又称简单 ., , 或短串联重复序 重复序列 列 .,.它由核心序列和侧翼序列构 , 成,核心序列是含个碱基的重复单元,重复次数可为.次,而侧翼序列 则使微卫星特异的锚定于基因组的某一位置,。 一般情况下,重复次数越多,微卫星变异能力越大,等位基因数目就越多, 多态性就越高 。虽然目前还不清楚微卫星多态性的产生机制,但是普 遍认为其多态性是由于重复单元在复制中出现滑动导致重复次数发生改变 的结果。 微卫星随机并广泛分布于真核生物的基因组内,大约每~就有 一个微卫星位点,。微卫星是共显性标记,遵循 孟德尔遗传定律,可以区分纯合个体和杂合个体,个体水平上是双等位基因, 群 体水平上是多等位基因。 大多数微卫星的长度在几百个碱基以内,因此微卫星位点通常可以通 过的扩增而获得。根据保守的侧翼序列设计引物进行扩增,两条等位 基因由于长度的不同而被分离。正是由于这一简便快速获得基因型的方法使 得微 卫星迅速成为一个有效的分子标记 .,。 综上,由于微卫星具有位点数量多,在基因组中均匀分布,多态信息 含量高,共显性遗传以及易于检测等特征,它的应用日益广泛 ; .,; .,; .,。此外,在微卫 ., 星的技术中,最大的优点便是对模板的质量要求不高 ,因此微卫星标记越来越多的用来解决保护遗传学的许多问题:如个体身份 的鉴定 .,,亲子关系的鉴定 .,,物种的进 化历史 .,,种群的扩散模式 .,,种群的遗传结 .,;; .,; 构和遗传分化 .,; .,。浙江大学博士学位论文 第章立论依据、研究目的和内容 是我国特有的珍稀濒危动物,频繁的人 大熊猫 类活动使大熊猫栖息地面积不断被侵占、破坏,片断化日益严重。目前野生 大熊 猫只分布于陕西、四川和甘肃的秦岭、岷山,邛崃、大相岭、小相岭和?山个 相互隔离的山系,数量仅只国家林业局,。 线粒体和微卫星等中性分子标记以及功能性的类基因分子标记对 群体检测的结果,表明大熊猫具有中度的遗传多样性和平衡选择的进化模式 .,; .,;。这些前期的研究结果为制定大 .,; 熊猫物种保护的管理和保护措施,提供了科学的依据方盛国等,。 由于类具有自己独立的进化历史和多态性的维持机制,其在大熊猫 各山系种群中的进化模式和适应性问题,同样受到学界的关注。但是,由于类 基因的位点信息尚不明确,有关大熊猫类基因于此方面研究尚未 开展起来。要开展此方面的研究,前提是分离所有的类基因,本实验室 虽已分离到部分的大熊猫类基因序列 .,,但是座位对应 关系不明确,且掌握的数据不足以对大熊猫进行全面的适应性进化分析。 在本研究之前,实验室以细菌人工染色体为载体,构建了大熊猫 高容量高质量的基因组文库 .,,从而使构建类基因 物理图谱,分离所有的类基因成为可能。 于是,本论文以大熊猫各山系种群的类基因的适应性进化机制为科 学问题的切入点,拟通过构建类的克隆重叠群而分离获得全部 类基因,创建类基因的分子标记系统等方面的研究工作,解决学 界所关注的大熊猫野外个山系的类基因的遗传变异、山系分化和适应 性进化的多态性维持机制等科学问题。 浙江大学博士学位论文 大熊猫类删分子标记系统的建立及其适应性进化研 究 第二部分研究内容 第章大熊猫类基因的分离 在开展大熊猫类功能基因的适应性进化研究之前,需要获得全部的 类位点。但是完全分离大熊猫基因组中的每一个功能位点,通过 跨物种扩增的方法是很难实现的。文献表明,构建物理图谱是分离物种 基因组全部功能位点的最有效方法之 .,; .,。因 此,本研究利用本实验室业已构建的大熊猫高质量基因组文库 ., ,构建类基因物理图谱,进而分离全部的类基因,为随后 的种群遗传变异研究奠定基础。 .材料 ..样品 成都大熊猫繁育研究基地的名为“成功”谱系号:的大熊猫外周血液, 经抗凝,保存液氮备用;二、头之子谱系号:的脑组织和娇 子之子谱系号:的肝脏组织,液氮保存备用。 本实验室构建的大熊猫基因组文库。 ..主要试剂用试剂, , , 均购 和克隆转化用试剂. 自公司;; ; ; ; ;引物由上海 公司合成。其他常规试剂购自上海生工生物公司。产物测序和克隆测 序均由测序部完成。浙江大学博士学位论文 大熊猫类分子标记系统的建立及其适应性进化研究 ..主要仪器和设备 小型高速冷冻离心机和大型高速冷冻离心机;真空干燥仪; : 梯度扩增仪; 纯水仪杭州永洁达;超纯水仪 ; 电泳仪; 凝胶成像系统 :;烘 ?;冷循环仪; 箱和 培养箱; 超低温冰箱;各种规 格移液枪。 .方法 ..血液基因组提取 经液氮冻存的血液经逐级解冻后取,加入等体积的缓冲液 , ., ., .,.,摇匀后静 止,离心去除上清; .;? .; , 加入“消化缓冲液 .;.%,及蛋白酶/,混匀于消化至澄清; 加入等体积的饱和酚后混匀,离心,吸取上清; 加入等体积的氯仿:异戊醇:,混匀,离心, 吸取上清, 重复此步骤一次; 加入等体积的酚:氯仿:异戊醇::,混匀,离 心,吸取上清: 在上清中加入倍体积无水乙醇.预冷,混匀后.沉淀~; 离心,除去上清; 用 %乙醇洗涤沉淀,离心; , 真空干燥加入适当体积。预热的. ,.溶解沉淀。 浙江大学博士学位论文 大熊猫类分子标记系统的建立及其适应性进化研究 ..血液及组织总的提取总的抽提参照 的使用说明书进行。 预处理 血液:取外周血置于离心管中,加入等体积缓冲液摇匀, 静置,。 离心,去上清; 组织:称取液氮保存的肝脏组织.脑组织.,置于预冷的研钵 中,加入适量液氮,迅速研磨至粉末状,并转移至离心管中; 加入 ,用注射器反复吹打,涡旋,室温放置; 加入.氯仿,用力摇动,室温放置~; 离心; 将上层水相吸出转移至新的.离心管中,加入.异丙醇,混匀, 室温放置,。 离心; 去上清,用水配制的%乙醇洗涤沉淀, 离心; 去上清,室温下蒸发掉残余乙醇,用水溶解,温育至完 全溶解。总置于.保存。 .. 的分离 的说明书进行。 的分离参照 向上述的总溶液加\.舶的水至终体积; 再加入 和斗 悬浮液混匀后于?温育幽,然后室 温放置 ; 离心,上清吸入新的.离心管,备用; ,吹打混匀,转移至离心柱中, 于沉淀中加入 离心; 将离心柱转移至新的.离心管中,加入 , 离心; 重复一次; 加入预热的溶液,枪头吹打次,离心,收 集溶液,.保存备用. 浙江大学博士学位论文 大熊猫类分子标记系统的建立及其适应性进化研究 ..第一链的合成及扩增 ...第一链的合成 第一链全长的合成参照 使用说明书进行。 表.第一链合成及扩增的接头引物 . ’ ‘ ’ , ;八 ? ’ 向冰浴的.离心管中加入以下成分: . 斗 . ’. “ 轻轻混匀,加热,冰上冷却; 冰浴条件下,向上述溶液加入 . “ 斗肛 总体系 温育,于冰上终止反应; 合成的第一链产物保存于.备用。 ...第一链的扩增 混合以下成分: 浙江大学博士学位论文 大熊猫类姗分子标记系统的建立及其适应性进化研 究 ’ . ’ / . . . 至“ 混匀后加入矿物油,按以下程序进行扩增 程序: 预变性:。 循环:? ? 终延伸:? ..大熊猫类基因序列的分离 ...大熊猫类基因部分序列的扩增及克隆 “成功”的扩增 序列,, 根据已发表的大熊猫类 和其他食肉类类序列狗:,, ;猎豹:,;猫:,,, ,,,;豹猫:,,, ,利用软件包的程序设计大熊猫类 基因的通用引物,扩增成功基因组同构建大熊猫文库所用的个 体。引物序列如下: ’位于 ; ’.配一’位于 ; 。 ,全部 及大部分的 扩增长度为,包含大部分 反应如下: 孑 . . .? ..