溶菌酶的晶体培养试验
溶菌酶晶体培养实验
一( 实验目的
近年来,X射线晶体结构分析技术在受体研究中得到了广泛应用。其关键是获得具有高衍射分辨率的晶体。本试验通过溶菌酶晶体培养实验:
1( 了解蛋白质分子结晶的原理
2( 了解影响蛋白质分子结晶的因素
3( 掌握蛋白质晶体的悬滴培养法
二( 蛋白质分子结晶的原理
蛋白质结晶的4个主要步骤:
1( 测定蛋白质溶液的纯度
2( 蛋白质溶液与盐,有机化合物等沉淀剂混匀;膜蛋白需要加入去垢剂 3( 混合溶液达到过饱和状态,形成晶核
4( 晶核一旦形成,晶体开始生长
三(影响蛋白质分子结晶的因素
1(待结晶蛋白质的纯度,一般要求纯度高于95%
2(待结晶蛋白质的浓度, 5~10 mg/ml
3(沉淀剂,盐,PEG,有机溶剂
4(pH值
5(温度, 4?C, 16?C
6. 结晶方法,悬滴法,坐滴法
7(震动
四( 试剂及器材
1(试剂:溶菌酶蛋白,氯化钠,醋酸钠,去离子水
2(器材:可调移液器,晶体培养板,硅化盖玻片,真空脂,晶体培养箱,显微
镜
五( 试验步骤
1( 配制50 mg/ml 溶菌酶溶液,0.1 M醋酸钠溶液,pH4.5
2( 配制池液:(1)5% (w/v) 氯化钠,0.1 M醋酸钠溶液,pH4.5
(2)8% (w/v) 氯化钠,0.1 M醋酸钠溶液,pH4.5
3(在晶体培养板溶剂池中分别加入0.3 ml池液(1)和池液(2)
4(在干净的硅化盖玻片上,滴加2 ml溶菌酶溶液和2 ml池液
5(将盖玻片倒扣在加池液的有溶剂池上,用真空脂密封
6(将晶体培养板放入16?C晶体培养箱
7(第二天,在显微镜下观察晶体生长情况
Procedure for Crystallization of Lysozyme
Chemicals needed:
Lysozyme protein
Sodium Chloride
Sodium Acetate buffer
Distilled water
Procedure
1. Prepare 50 mg/ml sample of lysozyme in 0.1 M NaAc pH4.5 2. Prepare well solutions:
a. 5% (w/v) NaCl, 0.1 M sodium acetate, pH4.5
b. 8% (w/v) NaCl, 0.1 M sodium acetate, pH4.5
3. Place 0.3 ml of well solution a, well solution b in each well of a VDX tray 4. On a clean silated cover slide, create 4 drops of 2 μl lysozyme solution, 2 μl well solution
5. Seal these cover slips with grease over a well
6. Place the VDX plate in 16 ?C incubator.
7. Observe the crystals next day under microscope