GB 5009.82-2016 食品安全国家标准 食品中维生素A、D、E的测定

!"#$%&''()*犌犅５００９．８２—２０１６!"#$%&'(!")*+,犃、犇、犈-./２０１６１２２３01２０１７０６２３23!"#$%&''(+,&-.,/01201'(34546789:;书犌犅５００９．８２—２０１６前　　言　　本标准代替ＧＢ／Ｔ５００９．８２—２００３《食品中维生素Ａ和维生素Ｅ的测定》、ＧＢ５４１３．９—２０１０《食品安全国家标准　婴幼儿食品和乳品中维生素Ａ、Ｄ、Ｅ的测定》、ＧＢ／Ｔ９６９５．２６—２００８《肉与肉制品　维生素Ａ含量测定》、ＧＢ／Ｔ９６９５．３０—２００８《肉与肉制品　维生素Ｅ含量测定》、ＮＹ／Ｔ１５９８—２００８《食用植物油中维生素Ｅ组分和含量的测定　高效液相色谱法》。本标准与ＧＢ／Ｔ５００９．８２—２００３相比，主要变化如下：———标准名称修改为“食品安全国家标准　食品中维生素Ａ、Ｄ、Ｅ的测定”；———增加了“食品中维生素Ｅ的测定　正相高效液相色谱法”；———增加了“食品中维生素Ｄ的测定　液相色谱串联质谱法”；———增加了“食品中维生素Ｄ的测定　高效液相色谱法”；———修改了“食品中维生素Ａ和维生素Ｅ的测定　反相高效液相色谱法”；———修改了维生素Ｅ异构体的反相色谱分离条件，可同时分离测定４种生育酚异构体；———删除了苯并芘内标定量法，改用外标法定量；———删除了“比色法”测定维生素Ａ。Ⅰ　书犌犅５００９．８２—２０１６食品安全国家标准食品中维生素犃、犇、犈的测定１　范围本标准规定了食品中维生素Ａ、维生素Ｅ和维生素Ｄ的测定。本标准第一法适用于食品中维生素Ａ和维生素Ｅ的测定。本标准第二法适用于食用油、坚果、豆类和辣椒粉等食物中维生素Ｅ的测定。本标准第三法适用于食品中维生素Ｄ２和维生素Ｄ３的测定。本标准第四法适用于配方食品中维生素Ｄ２或维生素Ｄ３的测定。第一法　食品中维生素犃和维生素犈的测定　反相高效液相色谱法２　原理试样中的维生素Ａ及维生素Ｅ经皂化（含淀粉先用淀粉酶酶解）、提取、净化、浓缩后，Ｃ３０或ＰＦＰ反相液相色谱柱分离，紫外检测器或荧光检测器检测，外标法定量。３　试剂和除非另有说明，本方法所用试剂均为纯，水为ＧＢ／Ｔ６６８２规定的一级水。３．１　试剂３．１．１　无水乙醇（Ｃ２Ｈ５ＯＨ）：经检查不含醛类物质，检查方法参见Ａ．１。３．１．２　抗坏血酸（Ｃ６Ｈ８Ｏ６）。３．１．３　氢氧化钾（ＫＯＨ）。３．１．４　乙醚［（ＣＨ３ＣＨ２）２Ｏ］：经检查不含过氧化物，检查方法参见Ａ．２。３．１．５　石油醚（Ｃ５Ｈ１２Ｏ２）：沸程为３０℃～６０℃。３．１．６　无水硫酸钠（Ｎａ２ＳＯ４）。３．１．７　ｐＨ试纸（ｐＨ范围１～１４）。３．１．８　甲醇（ＣＨ３ＯＨ）：色谱纯。３．１．９　淀粉酶：活力单位≥１００Ｕ／ｍｇ。３．１．１０　２，６二叔丁基对甲酚（Ｃ１５Ｈ２４Ｏ）：简称ＢＨＴ。３．２　试剂配制３．２．１　氢氧化钾溶液（５０ｇ／１００ｇ）：称取５０ｇ氢氧化钾，加入５０ｍＬ水溶解，冷却后，储存于聚乙烯瓶中。３．２．２　石油醚乙醚溶液（１＋１）：量取２００ｍＬ石油醚，加入２００ｍＬ乙醚，混匀。　１犌犅５００９．８２—２０１６３．２．３　有机系过滤头（孔径为０．２２μｍ）。３．３　标准品３．３．１　维生素犃标准品视黄醇（Ｃ２０Ｈ３０Ｏ，ＣＡＳ号：６８２６８）：纯度≥９５％，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。３．３．２　维生素犈标准品３．３．２．１　α生育酚（Ｃ２９Ｈ５０Ｏ２，ＣＡＳ号：１０１９１４１０）：纯度≥９５％，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。３．３．２．２　β生育酚（Ｃ２８Ｈ４８Ｏ２，ＣＡＳ号：１４８０３８）：纯度≥９５％，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。３．３．２．３　γ生育酚（Ｃ２８Ｈ４８Ｏ２，ＣＡＳ号：５４２８４）：纯度≥９５％，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。３．３．２．４　δ生育酚（Ｃ２７Ｈ４６Ｏ２，ＣＡＳ号：１１９１３１）：纯度≥９５％，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。３．４　标准溶液配制３．４．１　维生素Ａ标准储备溶液（０．５００ｍｇ／ｍＬ）：准确称取２５．０ｍｇ维生素Ａ标准品，用无水乙醇溶解后，转移入５０ｍＬ容量瓶中，定容至刻度，此溶液浓度约为０．５００ｍｇ／ｍＬ。将溶液转移至棕色试剂瓶中，密封后，在－２０℃下避光保存，有效期１个月。临用前将溶液回温至２０℃，并进行浓度校正（校正方法参见附录Ｂ）。３．４．２　维生素Ｅ标准储备溶液（１．００ｍｇ／ｍＬ）：分别准确称取α生育酚、β生育酚、γ生育酚和δ生育酚各５０．０ｍｇ，用无水乙醇溶解后，转移入５０ｍＬ容量瓶中，定容至刻度，此溶液浓度约为１．００ｍｇ／ｍＬ。将溶液转移至棕色试剂瓶中，密封后，在－２０℃下避光保存，有效期６个月。临用前将溶液回温至２０℃，并进行浓度校正（校正方法参见附录Ｂ）。３．４．３　维生素Ａ和维生素Ｅ混合标准溶液中间液：准确吸取维生素Ａ标准储备溶液１．００ｍＬ和维生素Ｅ标准储备溶液各５．００ｍＬ于同一５０ｍＬ容量瓶中，用甲醇定容至刻度，此溶液中维生素Ａ浓度为１０．０μｇ／ｍＬ，维生素Ｅ各生育酚浓度为１００μｇ／ｍＬ。在－２０℃下避光保存，有效期半个月。３．４．４　维生素Ａ和维生素Ｅ标准系列工作溶液：分别准确吸取维生素Ａ和维生素Ｅ混合标准溶液中间液０．２０ｍＬ、０．５０ｍＬ、１．００ｍＬ、２．００ｍＬ、４．００ｍＬ、６．００ｍＬ于１０ｍＬ棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，该标准系列中维生素Ａ浓度为０．２０μｇ／ｍＬ、０．５０μｇ／ｍＬ、１．００μｇ／ｍＬ、２．００μｇ／ｍＬ、４．００μｇ／ｍＬ、６．００μｇ／ｍＬ，维生素Ｅ浓度为２．００μｇ／ｍＬ、５．００μｇ／ｍＬ、１０．０μｇ／ｍＬ、２０．０μｇ／ｍＬ、４０．０μｇ／ｍＬ、６０．０μｇ／ｍＬ。临用前配制。４　仪器和设备４．１　分析天平：感量为０．０１ｍｇ。４．２　恒温水浴振荡器。４．３　旋转蒸发仪。４．４　氮吹仪。４．５　紫外分光光度计。４．６　分液漏斗萃取净化振荡器。　２犌犅５００９．８２—２０１６４．７　高效液相色谱仪：带紫外检测器或二极管阵列检测器或荧光检测器。５　分析步骤５．１　试样制备将一定数量的样品按要求经过缩分、粉碎均质后，储存于样品瓶中，避光冷藏，尽快测定。５．２　试样处理警示：使用的所有器皿不得含有氧化性物质；分液漏斗活塞玻璃面不得涂油；处理过程应避免紫外光照，尽可能避光操作；提取过程应在通风柜中操作。５．２．１　皂化５．２．１．１　不含淀粉样品称取２ｇ～５ｇ（精确至０．０１ｇ）经均质处理的固体试样或５０ｇ（精确至０．０１ｇ）液体试样于１５０ｍＬ平底烧瓶中，固体试样需加入约２０ｍＬ温水，混匀，再加入１．０ｇ抗坏血酸和０．１ｇＢＨＴ，混匀，加入３０ｍＬ无水乙醇，加入１０ｍＬ～２０ｍＬ氢氧化钾溶液，边加边振摇，混匀后于８０℃恒温水浴震荡皂化３０ｍｉｎ，皂化后立即用冷水冷却至室温。注：皂化时间一般为３０ｍｉｎ，如皂化液冷却后，液面有浮油，需要加入适量氢氧化钾溶液，并适当延长皂化时间。５．２．１．２　含淀粉样品称取２ｇ～５ｇ（精确至０．０１ｇ）经均质处理的固体试样或５０ｇ（精确至０．０１ｇ）液体样品于１５０ｍＬ平底烧瓶中，固体试样需用约２０ｍＬ温水混匀，加入０．５ｇ～１ｇ淀粉酶，放入６０℃水浴避光恒温振荡３０ｍｉｎ后，取出，向酶解液中加入１．０ｇ抗坏血酸和０．１ｇＢＨＴ，混匀，加入３０ｍＬ无水乙醇，１０ｍＬ～２０ｍＬ氢氧化钾溶液，边加边振摇，混匀后于８０℃恒温水浴振荡皂化３０ｍｉｎ，皂化后立即用冷水冷却至室温。５．２．２　提取将皂化液用３０ｍＬ水转入２５０ｍＬ的分液漏斗中，加入５０ｍＬ石油醚乙醚混合液，振荡萃取５ｍｉｎ，将下层溶液转移至另一２５０ｍＬ的分液漏斗中，加入５０ｍＬ的混合醚液再次萃取，合并醚层。注：如只测维生素Ａ与α生育酚，可用石油醚作提取剂。５．２．３　洗涤用约１００ｍＬ水洗涤醚层，约需重复３次，直至将醚层洗至中性（可用ｐＨ试纸检测下层溶液ｐＨ值），去除下层水相。５．２．４　浓缩将洗涤后的醚层经无水硫酸钠（约３ｇ）滤入２５０ｍＬ旋转蒸发瓶或氮气浓缩管中，用约１５ｍＬ石油醚冲洗分液漏斗及无水硫酸钠２次，并入蒸发瓶内，并将其接在旋转蒸发仪或气体浓缩仪上，于４０℃水浴中减压蒸馏或气流浓缩，待瓶中醚液剩下约２ｍＬ时，取下蒸发瓶，立即用氮气吹至近干。用甲醇分次将蒸发瓶中残留物溶解并转移至１０ｍＬ容量瓶中，定容至刻度。溶液过０．２２μｍ有机系滤膜后供高效液相色谱测定。　３犌犅５００９．８２—２０１６５．３　色谱参考条件色谱参考条件列出如下：ａ）　色谱柱：Ｃ３０柱（柱长２５０ｍｍ，内径４．６ｍｍ，粒径３μｍ），或相当者；ｂ）　柱温：２０℃；ｃ）　流动相：Ａ：水；Ｂ：甲醇，洗脱梯度见表１；ｄ）　流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ；ｅ）　紫外检测波长：维生素Ａ为３２５ｎｍ；维生素Ｅ为２９４ｎｍ；ｆ）　进样量：１０μＬ；ｇ）　标准色谱图和样品色谱图见Ｃ．１。注１：如难以将柱温控制在２０℃±２℃，可改用ＰＦＰ柱分离异构体，流动相为水和甲醇梯度洗脱。注２：如样品中只含α生育酚，不需分离β生育酚和γ生育酚，可选用Ｃ１８柱，流动相为甲醇。注３：如有荧光检测器，可选用荧光检测器检测，对生育酚的检测有更高的灵敏度和选择性，可按以下检测波长检测：维生素Ａ激发波长３２８ｎｍ，发射波长４４０ｎｍ；维生素Ｅ激发波长２９４ｎｍ，发射波长３２８ｎｍ。表１　犆３０色谱柱反相高效液相色谱法洗脱梯度参考条件时间流动相Ａ流动相Ｂ流速ｍｉｎ％％ｍＬ／ｍｉｎ０．０４９６０．８１３．０４９６０．８２０．００１０００．８２４．００１０００．８２４．５４９６０．８３０．０４９６０．８５．４　标准曲线的制作本法采用外标法定量。将维生素Ａ和维生素Ｅ标准系列工作溶液分别注入高效液相色谱仪中，测定相应的峰面积，以峰面积为纵坐标，以标准测定液浓度为横坐标绘制标准曲线，计算直线回归方程。５．５　样品测定试样液经高效液相色谱仪分析，测得峰面积，采用外标法通过上述标准曲线计算其浓度。在测定过程中，建议每测定１０个样品用同一份标准溶液或标准物质检查仪器的稳定性。６　分析结果的表述试样中维生素Ａ或维生素Ｅ的含量按式（１）计算：ρ×犞×犳×１００犡＝犿……………………（１）　　式中：犡　———试样中维生素Ａ或维生素Ｅ的含量，维生素Ａ单位为微克每百克（μｇ／１００ｇ），维生素Ｅ单位为毫克每百克（ｍｇ／１００ｇ）；ρ———根据标准曲线计算得到的试样中维生素Ａ或维生素Ｅ的浓度，单位为微克每毫升（μｇ／ｍＬ）；　４犌犅５００９．８２—２０１６犞———定容体积，单位为毫升（ｍＬ）；犳———换算因子（维生素Ａ：犳＝１；维生素Ｅ：犳＝０．００１）；１００———试样中量以每１００克计算的换算系数；犿———试样的称样量，单位为克（ｇ）。计算结果保留三位有效数字。注：如维生素Ｅ的测定结果要用α生育酚当量（αＴＥ）表示，可按下式计算：维生素Ｅ（ｍｇαＴＥ／１００ｇ）＝α生育酚（ｍｇ／１００ｇ）＋β生育酚（ｍｇ／１００ｇ）×０．５＋γ生育酚（ｍｇ／１００ｇ）×０．１＋δ生育酚（ｍｇ／１００ｇ）×０．０１。７　精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的１０％。８　其他当取样量为５ｇ，定容１０ｍＬ时，维生素Ａ的紫外检出限为１０μｇ／１００ｇ，定量限为３０μｇ／１００ｇ；生育酚的紫外检出限为４０μｇ／１００ｇ，定量限为１２０μｇ／１００ｇ。第二法　食品中维生素犈的测定　正相高效液相色谱法９　原理试样中的维生素Ｅ经有机溶剂提取、浓缩后，用高效液相色谱酰氨基柱或硅胶柱分离，经荧光检测器检测，外标法定量。１０　试剂和材料除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯。水为ＧＢ／Ｔ６６８２规定的一级水。１０．１　试剂１０．１．１　无水乙醇（Ｃ２Ｈ５ＯＨ）：色谱纯，经检验不含醛类物质，检查方法参见Ａ．１。１０．１．２　乙醚［（ＣＨ３ＣＨ２）２Ｏ］：分析纯，经检验不含氧化物，检查方法参见Ａ．２。１０．１．３　石油醚（Ｃ５Ｈ１２Ｏ２）：沸程为３０℃～６０℃。１０．１．４　无水硫酸钠（Ｎａ２ＳＯ４）。１０．１．５　正己烷（狀Ｃ６Ｈ１４）：色谱纯。１０．１．６　异丙醇［（ＣＨ３）２ＣＨＯＨ］：色谱纯。１０．１．７　叔丁基甲基醚［ＣＨ３ＯＣ（ＣＨ３）３］：色谱纯。１０．１．８　甲醇（ＣＨ３ＯＨ）：色谱纯。１０．１．９　四氢呋喃（Ｃ４Ｈ８Ｏ）：色谱纯。１０．１．１０　１，４二氧六环（Ｃ４Ｈ８Ｏ２）：色谱纯。１０．１．１１　２，６二叔丁基对甲酚（Ｃ１５Ｈ２４Ｏ）：简称ＢＨＴ。１０．１．１２　有机系过滤头（孔径为０．２２μｍ）。　５犌犅５００９．８２—２０１６１０．２　试剂配制１０．２．１　石油醚乙醚溶液（１＋１）：量取２００ｍＬ石油醚，加入２００ｍＬ乙醚，混匀，临用前配制。１０．２．２　流动相：正己烷＋［叔丁基甲基醚四氢呋喃甲醇混合液（２０＋１＋０．１）］＝９０＋１０，临用前配制。１０．３　标准品１０．３．１　α生育酚（Ｃ２９Ｈ５０Ｏ２，ＣＡＳ号：１０１９１４１０）：纯度≥９５％，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质；１０．３．２　β生育酚（Ｃ２８Ｈ４８Ｏ２，ＣＡＳ号：１４８０３８）：纯度≥９５％，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质；１０．３．３　γ生育酚（Ｃ２８Ｈ４８Ｏ２，ＣＡＳ号：５４２８４）：纯度≥９５％，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质；１０．３．４　δ生育酚（Ｃ２７Ｈ４６Ｏ２，ＣＡＳ号：１１９１３１）：纯度≥９５％，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。１０．４　标准溶液配制１０．４．１　维生素Ｅ标准储备溶液（１．００ｍｇ／ｍＬ）：分别称取４种生育酚异构体标准品各５０．０ｍｇ（准确至０．１ｍｇ），用无水乙醇溶解于５０ｍＬ容量瓶中，定容至刻度，此溶液浓度约为１．００ｍｇ／ｍＬ。将溶液转移至棕色试剂瓶中，密封后，在－２０℃下避光保存，有效期６个月。临用前将溶液回温至２０℃，并进行浓度校正（校正方法参见附录Ｂ）。１０．４．２　维生素Ｅ标准溶液中间液：准确吸取维生素Ｅ标准储备溶液各１．００ｍＬ于同一１００ｍＬ容量瓶中，用氮气吹除乙醇后，用流动相定容至刻度，此溶液中维生素Ｅ各生育酚浓度为１０．００μｇ／ｍＬ。密封后，在－２０℃下避光保存，有效期半个月。１０．４．３　维生素Ｅ标准系列工作溶液：分别准确吸取维生素Ｅ混合标准溶液中间液０．２０ｍＬ、０．５０ｍＬ、１．００ｍＬ、２．００ｍＬ、４．００ｍＬ、６．００ｍＬ于１０ｍＬ棕色容量瓶中，用流动相定容至刻度，该标准系列中４种生育酚浓度分别为０．２０μｇ／ｍＬ、０．５０μｇ／ｍＬ、１．００μｇ／ｍＬ、２．００μｇ／ｍＬ、４．００μｇ／ｍＬ、６．００μｇ／ｍＬ。１１　仪器和设备　１１．１　分析天平：感量为０．１ｍｇ。１１．２　恒温水浴振荡器。１１．３　旋转蒸发仪。１１．４　氮吹仪。１１．５　紫外分光光度计。１１．６　索氏脂肪抽提仪或加速溶剂萃取仪。１１．７　高效液相色谱仪，带荧光检测器或紫外检测器。１２　分析步骤１２．１　试样制备将一定数量的样品按要求经过缩分、粉碎、均质后，储存于样品瓶中，避光冷藏，尽快测定。　６犌犅５００９．８２—２０１６１２．２　试样处理警示：使用的所有器皿不得含有氧化性物质；分液漏斗活塞玻璃表面不得涂油；处理过程应避免紫外光照，尽可能避光操作。１２．２．１　植物油脂称取０．５ｇ～２ｇ油样（准确至０．０１ｇ）于２５ｍＬ的棕色容量瓶中，加入０．１ｇＢＨＴ，加入１０ｍＬ流动相超声或涡旋振荡溶解后，用流动相定容至刻度，摇匀。过孔径为０．２２μｍ有机系滤头于棕色进样瓶中，待进样。１２．２．２　奶油、黄油称取２ｇ～５ｇ样品（准确至０．０１ｇ）于５０ｍＬ的离心管中，加入０．１ｇＢＨＴ，４５℃水浴融化，加入５ｇ无水硫酸钠，涡旋１ｍｉｎ，混匀，加入２５ｍＬ流动相超声或涡旋振荡提取，离心，将上清液转移至浓缩瓶中，再用２０ｍＬ流动相重复提取１次，合并上清液至浓缩瓶，在旋转蒸发器或气体浓缩仪上，于４５℃水浴中减压蒸馏或气流浓缩，待瓶中醚剩下约２ｍＬ时，取下蒸发瓶，立即用氮气吹干。用流动相将浓缩瓶中残留物溶解并转移至１０ｍＬ容量瓶中，定容至刻度，摇匀。溶液过０．２２μｍ有机系滤膜后供高效液相色谱测定。１２．２．３　坚果、豆类、辣椒粉等干基植物样品称取２ｇ～５ｇ样品（准确至０．０１ｇ），用索氏提取仪或加速溶剂萃取仪提取其中的植物油脂，将含油脂的提取溶剂转移至２５０ｍＬ蒸发瓶内，于４０℃水浴中减压蒸馏或气流浓缩至干，取下蒸发瓶，用１０ｍＬ流动相将油脂转移至２５ｍＬ容量瓶中，加入０．１ｇＢＨＴ，超声或涡旋振荡溶解后，用流动相定容至刻度，摇匀。过孔径为０．２２μｍ有机系滤头于棕色进样瓶中，待进样。１２．３　色谱参考条件色谱参考条件列出如下：ａ）　色谱柱：酰氨基柱（柱长１５０ｍｍ，内径３．０ｍｍ，粒径１．７μｍ）或相当者；ｂ）　柱温：３０℃；ｃ）　流动相：正己烷＋［叔丁基甲基醚四氢呋喃甲醇混合液（２０＋１＋０．１）］＝９０＋１０；ｄ）　流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ；ｅ）　荧光检测波长：激发波长２９４ｎｍ，发射波长３２８ｎｍ；ｆ）　进样量：１０μＬ。注：可用Ｓｉ６０硅胶柱（柱长２５０ｍｍ，内径４．６ｍｍ，粒径５μｍ）分离４种生育酚异构体，推荐流动相为正己烷与１，４二氧六环按（９５＋５）的比例混合。１２．４　标准曲线的制作本法采用外标法定量。将维生素Ｅ标准系列工作溶液从低浓度到高浓度分别注入高效液相色谱仪中，测定相应的峰面积。以峰面积为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标绘制标准曲线，计算直线回归方程。１２．５　样品测定试样液经高效液相色谱仪分析，测得峰面积，采用外标法通过上述标准曲线计算其浓度。在测定过程中，建议每测定１０个样品用同一份标准溶液或标准物质检查仪器的稳定性。　７犌犅５００９．８２—２０１６１３　分析结果的表述试样中α生育酚、β生育酚、γ生育酚或δ生育酚的含量按式（２）计算：ρ×犞×犳×１００犡＝犿……………………（２）　　式中：犡　———试样中α生育酚、β生育酚、γ生育酚或δ生育酚的含量，单位为毫克每百克（ｍｇ／１００ｇ）；ρ———根据标准曲线计算得到的试样中α生育酚、β生育酚、γ生育酚或δ生育酚的浓度，单位为微克每毫升（μｇ／ｍＬ）；犞———定容体积，单位为毫升（ｍＬ）；犳———换算因子（犳＝０．００１）；１００———试样中量以每百克计算的换算系数；犿———试样的称样量，单位为克（ｇ）。计算结果保留三位有效数字。注：如维生素Ｅ的测定结果要用α生育酚当量（αＴＥ）表示，可按下式计算：维生素Ｅ（ｍｇαＴＥ／１００ｇ）＝α生育酚（ｍｇ／１００ｇ）＋β生育酚（ｍｇ／１００ｇ）×０．５＋γ生育酚（ｍｇ／１００ｇ）×０．１＋δ生育酚（ｍｇ／１００ｇ）×０．０１。１４　精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的１０％。１５　其他当取样量为２ｇ，定容２５ｍＬ时，各生育酚的检出限为５０μｇ／１００ｇ，定量限为１５０μｇ／１００ｇ。第三法　食品中维生素犇的测定　液相色谱串联质谱法１６　原理试样中加入维生素Ｄ２和维生素Ｄ３的同位素内标后，经氢氧化钾乙醇溶液皂化（含淀粉试样先用淀粉酶酶解）、提取、硅胶固相萃取柱净化、浓缩后，反相高效液相色谱Ｃ１８柱分离，串联质谱法检测，内标法定量。１７　试剂和材料除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯。水为ＧＢ／Ｔ６６８２规定的一级水。１７．１　试剂１７．１．１　无水乙醇（Ｃ２Ｈ５ＯＨ）：色谱纯，经检验不含醛类物质，检查方法参见Ａ．１。１７．１．２　抗坏血酸（Ｃ６Ｈ８Ｏ６）。１７．１．３　２，６二叔丁基对甲酚（Ｃ１５Ｈ２４Ｏ）：简称ＢＨＴ。　８犌犅５００９．８２—２０１６１７．１．４　淀粉酶：活力单位≥１００Ｕ／ｍｇ。１７．１．５　氢氧化钾（ＫＯＨ）。１７．１．６　乙酸乙酯（Ｃ４Ｈ８Ｏ２）：色谱纯。１７．１．７　正己烷（狀Ｃ６Ｈ１４）：色谱纯。１７．１．８　无水硫酸钠（Ｎａ２ＳＯ４）。１７．１．９　ｐＨ试纸（ｐＨ范围１～１４）。１７．１．１０　固相萃取柱（硅胶）：６ｍＬ，５００ｍｇ。１７．１．１１　甲醇（ＣＨ３ＯＨ）：色谱纯。１７．１．１２　甲酸（ＨＣＯＯＨ）：色谱纯。１７．１．１３　甲酸铵（ＨＣＯＯＮＨ４）：色谱纯。１７．２　试剂配制１７．２．１　氢氧化钾溶液（５０ｇ／１００ｇ）：５０ｇ氢氧化钾，加入５０ｍＬ水溶解，冷却后储存于聚乙烯瓶中。１７．２．２　乙酸乙酯正己烷溶液（５＋９５）：量取５ｍＬ乙酸乙酯加入到９５ｍＬ正己烷中，混匀。１７．２．３　乙酸乙酯正己烷溶液（１５＋８５）：量取１５ｍＬ乙酸乙酯加入到８５ｍＬ正己烷中，混匀。１７．２．４　０．０５％甲酸５ｍｍｏｌ／Ｌ甲酸铵溶液：称取０．３１５ｇ甲酸铵，加入０．５ｍＬ甲酸、１０００ｍＬ水溶解，超声混匀。１７．２．５　０．０５％甲酸５ｍｍｏｌ／Ｌ甲酸铵甲醇溶液：称取０．３１５ｇ甲酸铵，加入０．５ｍＬ甲酸、１０００ｍＬ甲醇溶解，超声混匀。１７．３　标准品１７．３．１　维生素Ｄ２标准品：钙化醇（Ｃ２８Ｈ４４Ｏ，ＣＡＳ号：５０１４６），纯度＞９８％，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。１７．３．２　维生素Ｄ３标准品：胆钙化醇（Ｃ２７Ｈ４４Ｏ，ＣＡＳ号：６７９７０），纯度＞９８％，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。１７．３．３　维生素Ｄ２ｄ３内标溶液（Ｃ２８Ｈ４４Ｏｄ３）：１００μｇ／ｍＬ。１７．３．４　维生素Ｄ３ｄ３内标溶液（Ｃ２７Ｈ４４Ｏｄ３）：１００μｇ／ｍＬ。１７．４　标准溶液配制１７．４．１　维生素Ｄ２标准储备溶液：准确称取维生素Ｄ２标准品１０．０ｍｇ，用色谱纯无水乙醇溶解并定容至１００ｍＬ，使其浓度约为１００μｇ／ｍＬ，转移至棕色试剂瓶中，于－２０℃冰箱中密封保存，有效期３个月。临用前用紫外分光光度法校正其浓度（校正方法见附录Ｂ）。１７．４．２　维生素Ｄ３标准储备溶液：准确称取维生素Ｄ３标准品１０．０ｍｇ，用色谱纯无水乙醇溶解并定容至１０ｍＬ，使其浓度约为１００μｇ／ｍＬ，转移至１００ｍＬ的棕色试剂瓶中，于－２０℃冰箱中密封保存，有效期３个月。临用前用紫外分光光度法校正其浓度（校正方法见附录Ｂ）。１７．４．３　维生素Ｄ２标准中间使用液：准确吸取维生素Ｄ２标准储备溶液１０．００ｍＬ，用流动相稀释并定容至１００ｍＬ，浓度约为１０．０μｇ／ｍＬ，有效期１个月。准确浓度按校正后的浓度折算。１７．４．４　维生素Ｄ３标准中间使用液：准确吸取维生素Ｄ３标准储备溶液１０．００ｍＬ，用流动相稀释并定容至１００ｍＬ棕色容量瓶中，浓度约为１０．０μｇ／ｍＬ，有效期１个月。准确浓度按校正后的浓度折算。１７．４．５　维生素Ｄ２和维生素Ｄ３混合标准使用液：准确吸取维生素Ｄ２和维生素Ｄ３标准中间使用液各１０．００ｍＬ，用流动相稀释并定容至１００ｍＬ，浓度为１．００μｇ／ｍＬ。有效期１个月。１７．４．６　维生素Ｄ２ｄ３和维生素Ｄ３ｄ３内标混合溶液：分别量取１００μＬ浓度为１００μｇ／ｍＬ的维生素Ｄ２ｄ３和维生素Ｄ３ｄ３标准储备液加入１０ｍＬ容量瓶中，用甲醇定容，配制成１μｇ／ｍＬ混合内标。有效　９犌犅５００９．８２—２０１６期１个月。１７．５　标准系列溶液的配制分别准确吸取维生素Ｄ２和Ｄ３混合标准使用液０．１０ｍＬ、０．２０ｍＬ、０．５０ｍＬ、１．００ｍＬ、１．５０ｍＬ、２．００ｍＬ于１０ｍＬ棕色容量瓶中，各加入维生素Ｄ２ｄ３和维生素Ｄ３ｄ３内标混合溶液１．００ｍＬ，用甲醇定容至刻度，混匀。此标准系列工作液浓度分别为１０．０μｇ／Ｌ、２０．０μｇ／Ｌ、５０．０μｇ／Ｌ、１００μｇ／Ｌ、１５０μｇ／Ｌ、２００μｇ／Ｌ。１８　仪器和设备注：使用的所有器皿不得含有氧化性物质。分液漏斗活塞玻璃表面不得涂油。１８．１　分析天平：感量为０．１ｍｇ。１８．２　磁力搅拌器或恒温振荡水浴：带加热和控温功能。１８．３　旋转蒸发仪。１８．４　氮吹仪。１８．５　紫外分光光度计。１８．６　萃取净化振荡器。１８．７　多功能涡旋振荡器。１８．８　高速冷冻离心机：转速≥６０００ｒ／ｍｉｎ。１８．９　高效液相色谱串联质谱仪：带电喷雾离子源。１９　分析步骤１９．１　试样制备将一定数量的样品按要求经过缩分、粉碎、均质后，储存于样品瓶中，避光冷藏，尽快测定。１９．２　试样处理注：处理过程应避免紫外光照，尽可能避光操作。１９．２．１　皂化１９．２．１．１　不含淀粉样品称取２ｇ（准确至０．０１ｇ）经均质处理的试样于５０ｍＬ具塞离心管中，加入１００μＬ维生素Ｄ２ｄ３和维生素Ｄ３ｄ３混合内标溶液和０．４ｇ抗坏血酸，加入６ｍＬ约４０℃温水，涡旋１ｍｉｎ，加入１２ｍＬ乙醇，涡旋３０ｓ，再加入６ｍＬ氢氧化钾溶液，涡旋３０ｓ后放入恒温振荡器中，８０℃避光恒温水浴振荡３０ｍｉｎ（如样品组织较为紧密，可每隔５ｍｉｎ～１０ｍｉｎ取出涡旋０．５ｍｉｎ），取出放入冷水浴降温。注：一般皂化时间为３０ｍｉｎ，如皂化液冷却后，液面有浮油，需要加入适量氢氧化钾溶液，并适当延长皂化时间。１９．２．１．２　含淀粉样品称取２ｇ（准确至０．０１ｇ）经均质处理的试样于５０ｍＬ具塞离心管中，加入１００μＬ维生素Ｄ２ｄ３和维生素Ｄ３ｄ３混合内标溶液和０．４ｇ淀粉酶，加入１０ｍＬ约４０℃温水，放入恒温振荡器中，６０℃避光恒温振荡３０ｍｉｎ后，取出放入冷水浴降温，向冷却后的酶解液中加入０．４ｇ抗坏血酸、１２ｍＬ乙醇，涡旋３０ｓ，再加入６ｍＬ氢氧化钾溶液，涡旋３０ｓ后放入恒温振荡器中，同１９．２．１．１皂化３０ｍｉｎ。１　０犌犅５００９．８２—２０１６１９．２．２　提取向冷却后的皂化液中加入２０ｍＬ正己烷，涡旋提取３ｍｉｎ，６０００ｒ／ｍｉｎ条件下离心３ｍｉｎ。转移上层清液到５０ｍＬ离心管，加入２５ｍＬ水，轻微晃动３０次，在６０００ｒ／ｍｉｎ条件下离心３ｍｉｎ，取上层有机相备用。１９．２．３　净化将硅胶固相萃取柱依次用８ｍＬ乙酸乙酯活化，８ｍＬ正己烷平衡，取备用液全部过柱，再用６ｍＬ乙酸乙酯正己烷溶液（５＋９５）淋洗，用６ｍＬ乙酸乙酯正己烷溶液（１５＋８５）洗脱。洗脱液在４０℃下氮气吹干，加入１．００ｍＬ甲醇，涡旋３０ｓ，过０．２２μｍ有机系滤膜供仪器测定。１９．３　仪器测定条件１９．３．１　色谱参考条件色谱参考条件列出如下：ａ）　Ｃ１８柱（柱长１００ｍｍ，柱内径２．１ｍｍ，填料粒径１．８μｍ），或相当者；ｂ）　柱温：４０℃；ｃ）　流动相Ａ：０．０５％甲酸５ｍｍｏｌ／Ｌ甲酸铵溶液；流动相Ｂ：０．０５％甲酸５ｍｍｏｌ／Ｌ甲酸铵甲醇溶液；流动相洗脱梯度见表２；ｄ）　流速：０．４ｍＬ／ｍｉｎ；ｅ）　进样量：１０μＬ。表２　流动相洗脱梯度时间流动相Ａ流动相Ｂ流速ｍｉｎ％％（ｍＬ／ｍｉｎ）０．０１２８８０．４１．０１２８８０．４４．０１０９００．４５．０７９３０．４５．１６９４０．４５．８６９４０．４６．００１０００．４１７．００１０００．４１７．５１２８８０．４２０．０１２８８０．４１９．３．２　质谱参考条件质谱参考条件列出如下：ａ）　电离方式：ＥＳＩ＋；ｂ）　鞘气温度：３７５℃；ｃ）　鞘气流速：１２Ｌ／ｍｉｎ；１　１犌犅５００９．８２—２０１６ｄ）　喷嘴电压：５００Ｖ；ｅ）　雾化器压力：１７２ｋＰａ；ｆ）　毛细管电压：４５００Ｖ；ｇ）　干燥气温度：３２５℃；ｈ）　干燥气流速：１０Ｌ／ｍｉｎ；ｉ）　多反应监测（ＭＲＭ）模式。锥孔电压和碰撞能量见表３，质谱图见Ｃ．５。表３　维生素犇２和维生素犇３质谱参考条件保留时间母离子定性子离子碰撞电压定量子离子碰撞电压维生素ｍｉｎ（犿／狕）（犿／狕）ｅＶ（犿／狕）ｅＶ３７９５维生素Ｄ２６．０４３９７１４７２５１０７２９３８２４维生素Ｄ２ｄ３６．０３４００２７１６１１０２２３６７７维生素Ｄ３６．３３３８５２５９８１０７２５３７０３维生素Ｄ３ｄ３６．３３３８８２５９６１０７１９１９．４　标准曲线的制作分别将维生素Ｄ２和维生素Ｄ３标准系列工作液由低浓度到高浓度依次进样，以维生素Ｄ２、维生素Ｄ３与相应同位素内标的峰面积比值为纵坐标，以维生素Ｄ２、维生素Ｄ３标准系列工作液浓度为横坐标分别绘制维生素Ｄ２、维生素Ｄ３标准曲线。１９．５　样品测定将待测样液依次进样，得到待测物与内标物的峰面积比值，根据标准曲线得到测定液中维生素Ｄ２、维生素Ｄ３的浓度。待测样液中的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应减少取样量重新按１９．２进行处理后再进样分析。２０　分析结果的表述试样中维生素Ｄ２、维生素Ｄ３的含量按式（３）计算：ρ×犞×犳×１００犡＝犿……………………（３）　　式中：犡　———试样中维生素Ｄ２（或维生素Ｄ３）的含量，单位为微克每百克（μｇ／１００ｇ）；ρ———根据标准曲线计算得到的试样中维生素Ｄ２（或维生素Ｄ３）的浓度，单位为微克每毫升（μｇ／ｍＬ）；犞———定容体积，单位为毫升（ｍＬ）；犳———稀释倍数；１００———试样中量以每１００克计算的换算系数；１　２犌犅５００９．８２—２０１６犿———试样的称样量，单位为克（ｇ）。计算结果保留三位有效数字。注：如试样中同时含有维生素Ｄ２和维生素Ｄ３，维生素Ｄ的测定结果以维生素Ｄ２和维生素Ｄ３含量之和计算。２１　精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的１５％。２２　其他当取样量为２ｇ时，维生素Ｄ２的检出限为１μｇ／１００ｇ，定量限为３μｇ／１００ｇ；维生素Ｄ３的检出限为０．２μｇ／１００ｇ；定量限为０．６μｇ／１００ｇ。第四法　食品中维生素犇的测定　高效液相色谱法２３　原理试样中的维生素Ｄ２或维生素Ｄ３经氢氧化钾乙醇溶液皂化（含淀粉试样先用淀粉酶酶解）、提取、净化、浓缩后，用正相高效液相色谱半制备，反相高效液相色谱Ｃ１８柱色谱分离，经紫外或二极管阵列检测器检测，内标法（或外标法）定量。如测定维生素Ｄ２，可用维生素Ｄ３作内标；如测定维生素Ｄ３，可用维生素Ｄ２作内标。２４　试剂和材料除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯。水为ＧＢ／Ｔ６６８２规定的一级水。２４．１　试剂２４．１．１　无水乙醇（Ｃ２Ｈ５ＯＨ）：色谱纯，经检验不含醛类物质，检查方法见Ａ．１。２４．１．２　抗坏血酸（Ｃ６Ｈ８Ｏ６）。２４．１．３　２，６二叔丁基对甲酚（Ｃ１５Ｈ２４Ｏ）：简称ＢＨＴ。２４．１．４　氢氧化钾（ＫＯＨ）。２４．１．５　正己烷（Ｃ４Ｈ１０Ｏ）。２４．１．６　石油醚（Ｃ５Ｈ１２Ｏ２）：沸程为３０℃～６０℃。２４．１．７　无水硫酸钠（Ｎａ２ＳＯ４）。２４．１．８　ｐＨ试纸（ｐＨ范围１～１４）。２４．１．９　甲醇：色谱纯。２４．１．１０　淀粉酶：活力单位≥１００Ｕ／ｍｇ。２４．２　试剂配制２４．２．１　氢氧化钾溶液：５０ｇ氢氧化钾，加入５０ｍＬ水溶解，冷却后储存于聚乙烯瓶中，临用前配制。２４．２．２　正己烷环己烷溶液（１＋１）：量取８ｍＬ异丙醇加入到９９２ｍＬ正己烷中，混匀，超声脱气，备用。２４．２．３　甲醇水溶液（９５＋１）：量取５０ｍＬ水加入到９５０ｍＬ甲醇中，混匀，超声脱气，备用。１　３犌犅５００９．８２—２０１６２４．３　标准品２４．３．１　维生素Ｄ２标准品：钙化醇（Ｃ２８Ｈ４４Ｏ，ＣＡＳ号：５０１４６），纯度＞９８％，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。２４．３．２　维生素Ｄ３标准品：胆钙化醇（Ｃ２７Ｈ４４Ｏ，ＣＡＳ号：６７９７０），纯度＞９８％，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。２４．４　标准溶液配制２４．４．１　维生素Ｄ２标准储备溶液：准确称取维生素Ｄ２标准品１０．０ｍｇ，用色谱纯无水乙醇溶解并定容至１００ｍＬ，使其浓度约为１００μｇ／ｍＬ，转移至棕色试剂瓶中，于－２０℃冰箱中密封保存，有效期３个月。临用前用紫外分光光度法校正其浓度（校正方法参见附录Ｂ）。２４．４．２　维生素Ｄ３标准储备溶液：准确称取维生素Ｄ３标准品１０．０ｍｇ，用色谱纯无水乙醇溶解并定容至１００ｍＬ，使其浓度约为１００μｇ／ｍＬ，转移至１００ｍＬ的棕色试剂瓶中，于－２０℃冰箱中密封保存，有效期３个月。临用前用紫外分光光度法校正其浓度（校正方法参见附录Ｂ）。２４．４．３　维生素Ｄ２标准中间使用液：准确吸取维生素Ｄ２标准储备溶液１０．００ｍＬ，用流动相稀释并定容至１００ｍＬ，浓度约为１０．０μｇ／ｍＬ，有效期１个月，准确浓度按校正后的浓度折算。２４．４．４　维生素Ｄ３标准中间使用液：准确吸取维生素Ｄ３标准储备溶液１０．００ｍＬ，用流动相稀释并定容至１００ｍＬ的棕色容量瓶中，浓度约为１０．０μｇ／ｍＬ，有效期３个月，准确浓度按校正后的浓度折算。２４．４．５　维生素Ｄ２标准使用液：准确吸取维生素Ｄ２标准中间使用液１０．００ｍＬ，用流动相稀释并定容至１００ｍＬ的棕色容量瓶中，浓度约为１．００μｇ／ｍＬ，准确浓度按校正后的浓度折算。２４．４．６　维生素Ｄ３标准使用液：准确吸取维生素Ｄ３标准中间使用液１０．００ｍＬ，用流动相稀释并定容至１００ｍＬ的棕色容量瓶中，浓度约为１．００μｇ／ｍＬ，准确浓度按校正后的浓度折算。２４．４．７　标准系列溶液的配制：２４．４．７．１　当用维生素Ｄ２作内标测定维生素Ｄ３时，分别准确吸取维生素Ｄ３标准中间使用液０．５０ｍＬ、１．００ｍＬ、２．００ｍＬ、４．００ｍＬ、６．００ｍＬ、１０．００ｍＬ于１００ｍＬ棕色容量瓶中，各加入维生素Ｄ２内标溶液５．００ｍＬ，用甲醇定容至刻度混匀。此标准系列工作液浓度分别为０．０５μｇ／ｍＬ、０．１０μｇ／ｍＬ、０．２０μｇ／ｍＬ、０．４０μｇ／ｍＬ、０．６０μｇ／ｍＬ、１．００μｇ／ｍＬ。２４．４．７．２　当用维生素Ｄ３作内标测定维生素Ｄ２时，分别准确吸取维生素Ｄ２标准中间使用液０．５０ｍＬ、１．００ｍＬ、２．００ｍＬ、４．００ｍＬ、６．００ｍＬ、１０．００ｍＬ于１００ｍＬ棕色容量瓶中，各加入维生素Ｄ３内标溶液５．００ｍＬ，用甲醇定容至刻度，混匀。此标准系列工作液浓度分别为０．０５μｇ／ｍＬ、０．１０μｇ／ｍＬ、０．２０μｇ／ｍＬ、０．４０μｇ／ｍＬ、０．６０μｇ／ｍＬ、１．００μｇ／ｍＬ。２５　仪器和设备注：使用的所有器皿不得含有氧化性物质。分液漏斗活塞玻璃表面不得涂油。２５．１　分析天平：感量为０．１ｍｇ。２５．２　磁力搅拌器：带加热、控温功能。２５．３　旋转蒸发仪。２５．４　氮吹仪。２５．５　紫外分光光度计。２５．６　萃取净化振荡器。２５．７　半制备正相高效液相色谱仪：带紫外或二极管阵列检测器，进样器配５００μＬ定量环。２５．８　反相高效液相色谱分析仪：带紫外或二极管阵列检测器，进样器配１００μＬ定量环。１　４犌犅５００９．８２—２０１６２６　分析步骤２６．１　试样制备将一定数量的样品按要求经过缩分、粉碎、均质后，储存于样品瓶中，避光冷藏，尽快测定。２６．２　试样处理处理过程应避免紫外光照，尽可能避光操作。如样品中只含有维生素Ｄ３，可用维生素Ｄ２做内标；如只含有维生素Ｄ２，可用维生素Ｄ３做内标；否则，用外标法定量，但需要验证回收率能满足检测要求。２６．２．１　不含淀粉样品称取５ｇ～１０ｇ（准确至０．０１ｇ）经均质处理的固体试样或５０ｇ（准确至０．０１ｇ）液体样品于１５０ｍＬ平底烧瓶中，固体试样需加入２０ｍＬ～３０ｍＬ温水，加入１．００ｍＬ内标使用溶液（如测定维生素Ｄ２，用维生素Ｄ３作内标；如测定维生素Ｄ３，用维生素Ｄ２作内标。），再加入１．０ｇ抗坏血酸和０．１ｇＢＨＴ，混匀。加入３０ｍＬ无水乙醇，加入１０ｍＬ～２０ｍＬ氢氧化钾溶液，边加边振摇，混匀后于恒温磁力搅拌器上８０℃回流皂化３０ｍｉｎ，皂化后立即用冷水冷却至室温。注：一般皂化时间为３０ｍｉｎ，如皂化液冷却后，液面有浮油，需要加入适量氢氧化钾乙醇溶液，并适当延长皂化时间。２６．２．２　含淀粉样品称取５ｇ～１０ｇ（准确至０．０１ｇ）经均质处理的固体试样或５０ｇ（精确至０．０１ｇ）液体样品于１５０ｍＬ平底烧瓶中，固体试样需加入约２０ｍＬ温水，加入１．００ｍＬ内标使用溶液（如测定维生素Ｄ２，用维生素Ｄ３作内标；如测定维生素Ｄ３，用维生素Ｄ２作内标）和１ｇ淀粉酶，放入６０℃恒温水浴振荡３０ｍｉｎ，向酶解液中加入１．０ｇ抗坏血酸和０．１ｇＢＨＴ，混匀。加入３０ｍＬ无水乙醇，１０ｍＬ～２０ｍＬ氢氧化钾溶液，边加边振摇，混匀后于恒温磁力搅拌器上８０℃回流皂化３０ｍｉｎ，皂化后立即用冷水冷却至室温。２６．２．３　提取将皂化液用３０ｍＬ水转入２５０ｍＬ的分液漏斗中，加入５０ｍＬ石油醚，振荡萃取５ｍｉｎ，将下层溶液转移至另一２５０ｍＬ的分液漏斗中，加入５０ｍＬ的石油醚再次萃取，合并醚层。２６．２．４　洗涤用约１５０ｍＬ水洗涤醚层，约需重复３次，直至将醚层洗至中性（可用ｐＨ试纸检测下层溶液ｐＨ值），去除下层水相。２６．２．５　浓缩将洗涤后的醚层经无水硫酸钠（约３ｇ）滤入２５０ｍＬ旋转蒸发瓶或氮气浓缩管中，用约１５ｍＬ石油醚冲洗分液漏斗及无水硫酸钠２次，并入蒸发瓶内，并将其接在旋转蒸发器或气体浓缩仪上，于４０℃水浴中减压蒸馏或气流浓缩，待瓶中醚剩下约２ｍＬ时，取下蒸发瓶，氮吹至干，用正己烷定容至２ｍＬ，０．２２μｍ有机系滤膜过滤供半制备正相高效液相色谱系统半制备，净化待测液。１　５犌犅５００９．８２—２０１６２６．３　测定条件２６．３．１　维生素犇待测液的净化２６．３．１．１　半制备正相高效液相色谱参考条件半制备正相高效液相色谱参考条件列出如下：ａ）　色谱柱：硅胶柱，柱长２５０ｍｍ，内径４．６ｍｍ，粒径５μｍ，或具同等性能的色谱柱；ｂ）　流动相：环己烷＋正己烷（１＋１），并按体积分数０．８％加入异丙醇；ｃ）　流速：１ｍＬ／ｍｉｎ；ｄ）　波长：２６４ｎｍ；ｅ）　柱温：３５℃±１℃；ｆ）　进样体积：５００μＬ。２６．３．１．２　半制备正相高效液相色谱系统适用性试验取约１．００ｍＬ维生素Ｄ２和Ｄ３标准中间使用液于１０ｍＬ具塞试管中，在４０℃±２℃的氮吹仪上吹干。残渣用１０ｍＬ正己烷振荡溶解。取该溶液１００μＬ注入液相色谱仪中测定，确定维生素Ｄ保留时间。然后将５００μＬ待测液注入液相色谱仪中，根据维生素Ｄ标准溶液保留时间收集维生素Ｄ馏分于试管中。将试管置于４０℃水浴氮气吹干，取出准确加入１．０ｍＬ甲醇，残渣振荡溶解，即为维生素Ｄ测定液。２６．３．２　反相液相色谱参考条件反相液相色谱参考条件列出如下：ａ）　色谱柱：Ｃ１８柱，柱长２５０ｍｍ，柱内径４．６ｍｍ，粒径５μｍ，或具同等性能的色谱柱；ｂ）　流动相：甲醇＋水＝９５＋５；ｃ）　流速：１ｍＬ／ｍｉｎ；ｄ）　检测波长：２６４ｎｍ；ｅ）　柱温：３５℃±１℃；ｆ）　进样量：１００μＬ。２６．４　标准曲线的制作分别将维生素Ｄ２或维生素Ｄ３标准系列工作液注入反相液相色谱仪中，得到维生素Ｄ２和维生素Ｄ３峰面积。以两者峰面积比为纵坐标，以维生素Ｄ２或维生素Ｄ３标准工作液浓度为横坐标分别绘制维生素Ｄ２或维生素Ｄ３标准曲线。２６．５　样品测定吸取维生素Ｄ测定液１００μＬ注入反相液相色谱仪中，得到待测物与内标物的峰面积比值，根据标准曲线得到待测液中维生素Ｄ２（或维生素Ｄ３）的浓度。２７　分析结果的表述试样中维生素Ｄ２（或维生素Ｄ３）的含量按式（４）计算：ρ×犞×犳×１００犡＝犿……………………（４）１　６犌犅５００９．８２—２０１６　　式中：犡　———试样中维生素Ｄ２（或维生素Ｄ３）的含量，单位为微克每百克（μｇ／１００ｇ）；ρ———根据标准曲线计算得到的试样中维生素Ｄ２（或维生素Ｄ３）的浓度，单位为微克每毫升（μｇ／ｍＬ）；犞———正己烷定容体积，单位为毫升（ｍＬ）；犳———待测液稀释过程的稀释倍数；１００———试样中量以每１００克计算的换算系数；犿———试样的称样量，单位为克（ｇ）。计算结果保留三位有效数字。２８　精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的１５％。２９　其他当取样量为１０ｇ时，维生素Ｄ２或维生素Ｄ３的检出限为０．７μｇ／１００ｇ，定量限为２μｇ／１００ｇ。１　７犌犅５００９．８２—２０１６附　录　犃犃．１　无水乙醇中醛类物质检查方法犃．１．１　试剂犃．１．１．１　硝酸银。犃．１．１．２　氢氧化钠。犃．１．１．３　氨水。犃．１．２　试剂配制犃．１．２．１　５％硝酸银溶液：称取５．００ｇ硝酸银，加入１００ｍＬ水溶解，储存于棕色试剂瓶中。犃．１．２．２　１０％氢氧化钠溶液：称取１０．００ｇ氢氧化钠，加入１００ｍＬ水溶解，储存于聚乙烯瓶中。犃．１．２．３　银氨溶液：加氨水至５％硝酸银中，直至生成的沉淀重新溶解，加入数滴１０％氢氧化钠溶液，如发生沉淀，再加入氨水至沉淀溶解。犃．１．３　操作方法取２ｍＬ银氨溶液于试管中，加入少量乙醇，摇匀，再加入氢氧化钠溶液，加热，放置冷却后，若有银镜反应，则表示乙醇中有醛。犃．１．４　结果处理换用色谱纯的无水乙醇或对现有乙醇进行脱醛处理：取２ｇ硝酸银溶于少量水中，取４ｇ氢氧化钠溶于温乙醇中，将两者倾入１Ｌ乙醇中，振摇后，放置暗处２ｄ，期间不时振摇，经过滤，置蒸馏瓶中蒸馏，弃去１５０ｍＬ初馏液。犃．２　乙醚中过氧化物检查方法犃．２．１　试剂犃．２．１．１　碘化钾。犃．２．１．２　淀粉。犃．２．２　试剂配制犃．２．２．１　１０％碘化钾溶液：称取１０．００ｇ碘化钾，加入１００ｍＬ水溶解，储存于棕色试剂瓶中。犃．２．２．２　０．５％淀粉溶液：称取０．５０ｇ可溶性淀粉，加入１００ｍＬ水溶解，储存于试剂瓶中。犃．２．３　操作方法用５ｍＬ乙醚加１ｍＬ１０％碘化钾溶液，振摇１ｍｉｎ，如水层呈黄色或加４滴０．５％淀粉溶液，水层呈蓝色，表明含过氧化物。１　８犌犅５００９．８２—２０１６犃．２．４　结果处理换用色谱纯的无水乙醚或对现有试剂进行重蒸，重蒸乙醚时需在蒸馏瓶中放入纯铁丝或纯铁粉，弃去１０％初馏液和１０％残留液。１　９犌犅５００９．８２—２０１６附　录　犅维生素犃、犇、犈标准溶液浓度校正方法维生素Ａ、维生素Ｄ、维生素Ｅ标准溶液配制后，在使用前需要对其浓度进行校正，具体操作如下：ａ）　取视黄醇标准储备溶液５０μＬ于１０ｍＬ的棕色容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度，混匀，用１ｃｍ石英比色杯，以无水乙醇为空白参比，按表Ｂ．１的测定波长测定其吸光度；ｂ）　分别取维生素Ｄ２、维生素Ｄ３标准储备溶液１００μＬ于各１０ｍＬ的棕色容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度，混匀，分别用１ｃｍ石英比色杯，以无水乙醇为空白参比，按表Ｂ．１的测定波长测定其吸光度；ｃ）　分别取α生育酚、β生育酚、γ生育酚和δ生育酚标准储备溶液５００μＬ于各１０ｍＬ棕色容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度，混匀，分别用１ｃｍ石英比色杯，以无水乙醇为空白参比，按表Ｂ．１的测定波长测定其吸光度。试液中维生素Ａ或维生素Ｅ或维生素Ｄ的浓度按式（Ｂ．１）计算：犃×１０４犡＝犈……………………（Ｂ．１）　　式中：犡　———维生素标准稀释液浓度，单位为微克每毫升（μｇ／ｍＬ）；犃———维生素稀释液的平均紫外吸光值；１０４———换算系数；犈———维生素１％比色光系数（各维生素相应的比色吸光系数见表Ｂ．１）。表犅．１　测定波长及百分吸光系数目标物波长／ｎｍ犈（１％比色光系数）α生育酚２９２７６β生育酚２９６８９γ生育酚２９８９１δ生育酚２９８８７视黄醇３２５１８３５维生素Ｄ２２６４４８５维生素Ｄ３２６４４６２２　０犌犅５００９．８２—２０１６附　录　犆色谱图犆．１　维生素Ｅ标准溶液Ｃ３０柱反相色谱图见图Ｃ．１。图犆．１　维生素犈标准溶液犆３０柱反相色谱图犆．２　维生素Ａ标准溶液Ｃ３０柱反相色谱图（２．５μｇ／ｍＬ）见图Ｃ．２。图犆．２　维生素犃标准溶液犆３０柱反相色谱图（２．５μ犵／犿犔）犆．３　维生素Ｅ标准溶液酰氨基柱色谱图见图Ｃ．３。图犆．３　维生素犈标准溶液酰氨基柱色谱图２　１犌犅５００９．８２—２０１６犆．４　为维生素Ｄ和维生素Ｄｄ３混合标准溶液１００μｇ／Ｌ的ＭＲＭ质谱色谱图见图Ｃ．４。图犆．４　维生素犇和维生素犇犱３混合标准溶液１００μ犵／犔的犕犚犕质谱色谱图犆．５　奶粉中添加维生素Ｄ和维生素Ｄｄ３混合标准溶液１００μｇ／Ｌ的ＭＲＭ质谱色谱图见图Ｃ．５。图犆．５　奶粉中添加维生素犇和维生素犇犱３混合标准溶液１００μ犵／犔的犕犚犕质谱色谱图２　２