液 2质联用法测定铁皮石斛和西洋参及制剂中多菌灵残留
吴永江 朱 炜 程翼宇 3
(浙江大学中药科学与
学系 ,杭州 310027)
摘 要 用高效液相色谱 2质谱联用法定量检测铁皮石斛、西洋参药材及其制剂中的多菌灵残留。在酸性条
件下以甲醇提取中药材和制剂中的残留多菌灵 ,分析色谱柱为 D iamonsil C18 (4. 6 mm i. d. ×250 mm, 5μm ) ,
以 4%四氢呋喃水溶液 2甲醇梯度洗脱 , 采用选择离子监测模式 ,以 m / z 192为检测定量离子。多菌灵出峰时
间在 27 m in左右 ,线性范围为 0. 22~33 ng,相关系数 0. 9993;方法检出限为 0. 015 mg/L;定量限为 0. 022
mg/L;平均回收率在 95. 6%以上。该方法灵敏、准确、可靠 ,定量范围宽 ,耐用性强 ,可作为中药中多菌灵残留
的可靠检测方法。
关键词 高效液相色谱 ,质谱 ,多菌灵 ,农药残留 ,铁皮石斛 ,西洋参
2005204209收稿 ; 2005207219接受
本文系浙江省重大科技
项目资助 (No. 021103549)
1 引 言
近年来 ,植物药在消费者心目中的地位不断提升 ,特别是针对一些慢性病、老年性疾病 ,人们寄希望
于天然药物或非药物治疗 ,这为中药的发展提供了契机。但是 ,由于农药的大量使用 ,致使药材中农药
残留量过高 ,严重影响其安全性和治病功效的发挥 ,给人民身体健康带来隐患 ,阻碍了中药现代化和国
际化。因此 ,对中药中农药残留的检测控制至关重要。
多菌灵 (Carbendazim,
N
H
N
NH
C
O
O
CH3
)又称苯并咪唑 44号、棉萎灵等 ,是一种高效低毒、广谱、内吸
性杀菌剂 ,是代替铜、汞类杀菌剂的理想叶面喷洒剂和种子处理剂 ,对菌核病、炭疽病、枯萎病等都有防
治效果 ,是中药栽培过程中常用的农药。多菌灵化学性质稳定 ,能通过作物叶片和种子渗入植物体内 ,耐
雨水冲洗 ,残效期长。因此 ,多菌灵在药材中的残留是影响产品质量的重要因素。
国内外对果蔬中的多菌灵残留量检测已有大量报道 ,但对中药材及制剂中多菌灵残留量的分析报
道较少 [ 1, 2 ]。果蔬中多菌灵残留量检测常用薄层扫描法 [ 3 ]、荧光分析法 [ 4 ]、紫外光谱法 [ 5 ]、气相色谱
法 [ 6 ]、胶束电动色谱法 (MEKC) [ 7 ]和伏安法 [ 8 ]等。其中 ,紫外光谱法、薄层扫描法及胶束电动色谱法灵
敏度低 ;荧光分析法操作比较繁琐且易受干扰 ,而气相色谱法需要对样品进行衍生化处理 ,前处理复杂。
一般的高效液相色谱法常用紫外检测器 [ 9 ] ,由于其选择性差 ,灵敏度受到限制 ,不同的样品必须采用不
同的色谱条件 ,且中药样品成分比食品更复杂 ,对检测干扰极大 ,方法的通用性和耐用性不强。为此 ,本
实验采用高选择性、高灵敏度的质谱检测器 ,以名贵药材铁皮石斛、西洋参及其制剂为研究对象 ,建立了检
测多菌灵残留的液相色谱 2质谱联用方法。本方法通用性强 ,可为制订中药中多菌灵残留标准提供依据。
2 实验部分
2. 1 仪器与试剂
1100型高效液相色谱 2质谱联用仪 (美国 Agilent科技有限公司 ) ,配在线脱气机、四元低压泵、自动
进样器、柱温箱、二极管阵列检测器、电喷雾四级杆质谱检测器 ,仪器控制和数据采集分析使用 ChemSta2
tion工作站 ; DSHZ2300型多用途水浴恒温振荡器 (江苏太仓市实验设备厂 ) ; R2200型旋转蒸发仪 (瑞士
Buchi公司 ) ;飞鸽牌 TGL216G高速台式离心机 (上海安亭科学仪器厂 ) ; METTLER2AE240型电子天平
(梅特勒 2托利多仪器 (上海 )有限公司 )。甲醇 (分析纯 ,用于样品制备 ,浙江临海浙东特种试剂厂 ) ,四
氢呋喃、甲醇 (色谱纯 ,德国 Merck公司 ) ; NaCl、NaOH、石油醚 (沸程 60~90℃)、二氯甲烷 (分析纯 ,杭州
第 34卷
2006年 2月
分析化学 ( FENX I HUAXUE) 研究简报
Chinese Journal of Analytical Chem istry
第 2期
235~238
高晶精细化工有限公司 ) ;无水硫酸钠、HCl (分析纯 ,中国上海试剂总厂 ) ; M illi2Q纯净水 (M illipore公
司 ) ;高纯氮气 (99. 999% ,杭州电气集团气体有限公司 ) ;多菌灵标准品由浙江大学农药与环境毒理研
究所朱国念教授提供 ;铁皮石斛和西洋参药材及其制剂在杭州市场购买。
2. 2 实验方法
2. 2. 1 标准溶液配制 准确称取标准品 ,用甲醇溶解配成浓度为 110 mg/L的标准储备液 ,储存于冰
箱。使用时用甲醇逐级稀释成浓度为 0. 022~3. 3 mg/L的标准溶液。
2. 2. 2 样品处理 准确称取粉碎后的药材 5. 0 g于 100 mL具塞三角烧瓶中 ,加入 20 mL甲醇和 5 mL
0. 1 mol/L HCl,搅拌均匀 ,在 25℃的水浴中用振荡器振荡提取 2 h,用布氏漏斗抽滤 ,以少量甲醇清洗残
渣 ,合并滤液于 150 mL圆底烧瓶中 ,在 40℃水浴上浓缩 ,基本除去甲醇。将浓缩液转移至 125 mL分液
漏斗中 ,加入 5mL 0. 1 mol/L 盐酸和 25 mL 10% NaCl溶液 ,混合均匀 ,再加入 20 mL石油醚剧烈振荡。
静置分层后 ,弃去石油醚 ,水相用 2 mol/L NaOH溶液调节 pH至 6. 5~7. 0,用二氯甲烷萃取 3次 ,每次
20 mL。合并二氯甲烷 ,以无水硫酸钠干燥 ,将滤液转移至 150mL圆底烧瓶中 ,在 40℃水浴中减压蒸发
至干 ,最后用甲醇溶解定容至 1 mL。
2. 2. 3 高效液相色谱 2质谱条件 色谱柱 : D ikma D iamonsil C18 ( 4. 6 mm i. d. ×250 mm , 5μm ) ; 流动
相 :采用 4%四氢呋喃水溶液 (A ) 2甲醇 (B )梯度洗脱 ( 0~30 m in,保持 30% B; 30~31 m in, B浓度从
30%升至 100% ,然后保持 16 m in) ,流速 0. 6 mL /m in,柱温 30℃,检测波长 282 nm ,进样量 10μL。在上
述色谱条件下 ,多菌灵出峰时间约为 27 m in。
质谱检测选择正离子选择离子检测 ( SIM )模式 ,以 m / z 192和 m / z 160为定性检测离子对 , m / z 192
为定量检测离子 ,干燥气为氮气 ,流速 10 L /m in,干燥气温度 350℃,毛细管电压 3500 V,裂解电压 100 V。
3 结果与讨论
3. 1 质谱方法建立
在农残分析中 ,由于所要分析的目标物含量很低 ,基体成分干扰很大 ,需要选择合理的检测方法来
进行分析。实验对药材提取液进行高效液相色谱分析后发现 ,用 DAD检测器在紫外波长 282 nm下进
行检测 ,多菌灵信号被掩盖 ,无法准确定量。而用灵敏度和选择性更高的质谱检测器在选择离子监测模
式下进行检测 ,多菌灵响应明显 (见图 1)。用扫描模式在 m / z 120~220范围扫描 ,总离子流图和相应
的多菌灵质谱图结果示于图 2。质谱中的准分子离子 m / z 192 [M + H ] + 为基峰 , m / z 160为 [M -
CH3 O ] + , m / z 214为 [M +Na ] + 。因此 ,实验选取 m / z 192和 m / z 160作为监测离子对进行定性 ,将 m / z
192用于多菌灵的定量测定。
图 1 紫外检测 ( a)和质谱检测 ( b, c)多菌灵的色谱图
Fig. 1 Chromatogram s of carbendazim by ultraviolet detection ( a) and mass detection ( b, c)
a21, b. 多菌灵标准液 ( carbendazim standard solution) : 1. 1 mg/L; a22, c. 样品溶液 ( samp le)。
3. 2 标准曲线绘制
将标准储备液用甲醇稀释成浓度分别为 0. 022、0. 044、0. 11、0. 22、0. 44、0. 88、1. 1、1. 43、1. 76和
313 mg/L的标准溶液。在相同的色谱及质谱条件下 ,测定多菌灵的峰面积。以峰面积对绝对进样量
( ng)作图 ,得标准曲线 ,线性回归方程为 Y = 5. 0882 ×106 X + 2. 6187 ×106 ,相关系数 r = 0. 9993,该方法
632 分 析 化 学 第 34卷
线性范围为 0. 22~33 ng。
图 2 多菌灵标准溶液和样品提取液的总离子色谱 ( a, b)和质谱 ( c, d)图
Fig. 2 The total ion current chromatogram s ( a, b) and mass spectra ( c, d) of carbendazim standard solution
and smap le extraction solution
a, c. 多菌灵标准液 ( carbendazim standard solution) : 1. 1 mg/L; b, c. 样品提取液 ( samp le extraction solution)。
取空白药材提取液 ,加入一定量的多菌灵标准品 ,以信噪比的 3倍和 10倍来确定方法的检出限和
定量限分别为 0. 015和 0. 022 mg/L (RSD < 5% )。
3. 3 精密度、准确度和重复性
采用同一个药材供试品溶液 ,在相同色谱条件下 ,连续进样 5次 ,测定其峰面积 ,多次测定的峰面积
相对标准偏差为 2. 7% ,说明本方法有较好的精密度。
在已知多菌灵含量 ( 0. 06 mg/kg)的药材中准确
加入一定量的多菌灵标准品 ,按同样的操作步骤进行
提取、净化、测定 ,计算回收率 ,结果列于
1。多菌灵
的平均加样回收率为 95. 6% ~104. 7% ;最大相对标
准偏差为 3. 3%。
取同一批药材样品 5份 ,按同样的方法进行提取、
表 1 多菌灵回收率测定结果
Table 1 Recovery of carbendazim in herbal medicine
加入浓度 (mg/kg)
Sp iked concentration
回收率
Recovery ( % )
相对标准偏差
RSD ( % , n = 3)
0. 066 104. 7 1. 6
0. 22 95. 6 3. 3
0. 58 97. 7 2. 2
净化、测定 ,结果样品中多菌灵平均残留为 0. 04mg/kg,相对标准偏差为 5. 6% ,表明方法重复性较好。
3. 4 方法应用
按同样的样品处理方法对 3批铁皮石斛、3批西洋参和 6批铁皮枫斗 (主成分为铁皮石斛和西洋
参 )进行了提取、净化 ,在相同的色谱条件下测定其中多菌灵残留量 ,结果如表 2所示。
表 2 不同批次铁皮石斛、西洋参和铁皮枫斗中多菌灵残留的测定结果
Table 2 The contents of residual carbendazim in D endrobium cand idum W all. ex L indl. , Panax qu inquefolium and Tie2Pi2
Fen2Dou drug
样品
Samp le
样品序号
No.
多菌灵含量
Carbendazim content
(mg/kg)
剂型
Dosage form
批号
No.
多菌灵含量
Carbendazim content
(mg/kg)
铁皮石斛
D endrobium candidum
W all. ex L indl.
1 0. 29 含片 Troche 030805 0. 02
2 0. 09 胶囊 Collocystis 040311 0. 02
3 0. 05 胶囊 Collocystis 040201 0. 01
西洋参
Panax quinquefolium
1 0. 06 颗粒 Granule 041206 0. 03
2 0. 03 颗粒 Granule 040304 0. 01
3 0. 10 颗粒 Granule 040207 0. 02
3. 5 分析条件选择
(1) 多菌灵是一种两性化合物 ,在中性和偏碱性水溶液中溶解度低 ,微溶于丙酮、乙酸乙酯和氯仿
等有机溶剂。实验比较了在酸性条件下 ,甲醇和水提取多菌灵的效果。取空白药材 ,加入多菌灵标准溶
液 ,然后分别用水和甲醇提取 ,同前述方法净化。结果发现 ,甲醇 2盐酸法回收率高 ,而水提法回收率仅
为 22. 7% (见表 3) ,故选择醇提法。在甲醇中加入酸液使多菌灵成盐 ,用石油醚除去脂溶性杂质后调
高 pH,使多菌灵转成原形 ,再用有机溶剂萃取 ,从而纯化、富集多菌灵。本方法简单易行 ,大大缩短了样
品前处理的时间 ; (2) 以甲醇 2水为流动相洗脱时 ,多菌灵峰型宽而且拖尾。经过实验 ,选择了四氢呋喃
作为调节剂 ,使峰型得到改善 ; ( 3)与DAD检测器相比 ,质谱检测器采用 SIM模式后 ,检测灵敏度显著
732第 2期 吴永江等 :液 2质联用法测定铁皮石斛和西洋参及制剂中多菌灵残留
提高 ,目标物在紫外光下无响应 ,但在质谱中有很
强的响应。同时质谱抗干扰强 ,检出限低 ,定量结
果更趋准确和真实 ,方法耐用性更强 ; (4) 通过药
材和制剂中多菌灵含量的比较 ,发现药材中多菌灵
的残留量普遍高于制剂 ,可能是由于在制剂生产过
程中部分多菌灵降解 [ 10 ]。
表 3 水和乙醇提取多菌灵效果比较
Table 3 Comparison of recovery of carbendazim obtained by
using methanol and water as extraction solvent
提取溶剂
Extraction solvent
添加量
Added
(mg/kg)
测定量
Determ ined
(mg/kg)
回收率
Recovery
( % )
甲醇 2盐酸 Methanol2HCl 0. 22 0. 21 95. 4
水 2盐酸 W ater2HCl 0. 22 0. 05 22. 7
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D eterm ina tion of Carbendaz im Residue in D endrobium C andidum
W a ll. ex L indl. , Panax Q u inquefo lium and The ir Prepara tion s by
H igh Performance L iqu id Chroma tography2M a ss Spectrom etry
W u Yongjiang, Zhu W ei, Cheng Yiyu3
(D epartm en t of Chinese M edicine Science & Engineering, College of Pharm aceu tical Sciences,
Zhejiang U niversity, Hangzhou 310027)
Abstract A high performance liquid chromatography2mass spectrometric (HPLC2MS) method form icrodetec2
tion of carbendazim in D endrobium cand idum W all. ex L indl and Panax qu inquefolium. Carbendazim in herbal
medicinal materials was extracted by m ixture solution of methanol and hydrochloric acid. The separation of
carbendazim was performed on a D iamonsil C18 column (4. 6 mm i. d. ×250 mm, 5μm) using gradient elution
of methanol2water ( containing 4% tetrahydrofuran). Carbendazim was detected in selected ion monitoring
( SIM ) mode with m / z 192 and m / z 160 for qualitative analysis and m / z 190 for quantitation. L inear p lot was
obtained between 0. 22 and 33 ng with linear correlation coefficient of 0. 9993. The lim it of detection (LOD)
was 0. 015 mg/L, and the lim it of quantitation (LOQ) was 0. 022 mg/L. The average recoverieswere 95. 6%
~104. 7%. The results indicate that the described method is sensitive, reliable and robust, and it can be
app lied for the quantitation of carbendazim in herbal medicinal materials.
Keywords H igh performance liquid chromatography, mass spectrometry, carbendazim, pesticide residue,
D end robium cand idum W all. ex L indl. , Panax qu inquefolium
(Received 9 Ap ril 2005; accep ted 19 July 2005)
832 分 析 化 学 第 34卷