·综述·
作者单位 : 200092 上海交通大学医学院附属新华医院老年科
(高艳虹 ) ,消化科 (李定国 )
通信作者 :李定国 , Email: dingguo_li@263. net
基因治疗靶向方法的研究进展
高艳虹 李定国
靶向基因治疗是指将目的基因通过载体系统导入机体 ,
并特异性地在靶组织细胞中以可调控的方式
达 ,达到治疗
疾病的作用而不影响其他正常细胞、组织或器官的功能。自
1990年第 1例基因治疗应用以来 ,基因治疗技术已在遗传、
代谢病和肿瘤等领域取得了较快的研究进展。但迄今为止 ,
基因治疗的安全性和有效性仍是有待突破的“瓶颈 ”。其
中 ,基因治疗的靶向性是安全有效地进行基因治疗的技术关
键和研究热点。目前应用于基因治疗的靶向方法主要有 :基
因的靶向转移、靶向表达、原位修复和 RNA干扰技术定点整
合等。为此 ,现就有关问
进行综述。
一、基因的靶向转移
即借助载体系统对组织细胞的特异性实现目的基因的
定向转导。目前用于基因转导的载体分为病毒载体和非病
毒载体两大类。
1. 病毒载体 :病毒载体因有较高的基因转染效率 ,在目
前的研究中占有主导地位。在靶向治疗时 ,人们利用病毒蛋
白对某些人体细胞的特殊亲和作用而将目的基因特异性地
导入靶细胞中。如单纯疱疹病毒对神经细胞有天然的亲嗜
性 ,可用作治疗神经系统疾病的基因载体。然而 ,大多数病
毒感染的宿主细胞较广泛 ,为提高病毒感染靶细胞的特异
性 ,可在原来的病毒结构蛋白上接上一段具有特异靶向的抗
体或配体 , 目前应用较多的是单链可变区抗体 ,如 Martin和
Neil[ 1 ]设计的特异性靶向黑色素瘤的逆转录病毒载体在单
链可变区抗体传导下与肿瘤细胞表面的特殊抗原结合 ,明显
提高了载体的靶向性。
近年来 ,有研究者将基因治疗与病毒治疗的各自优势相
结合进行肿瘤的靶向 2病毒治疗。其基本方法是 :将有抗癌
作用的外源基因插入肿瘤特异性增殖病毒 (也称溶瘤病毒 )
的载体中特异性导向肿瘤。这既要病毒载体本身能特异地
在肿瘤细胞内复制 , 杀死肿瘤细胞 ;又要携带的外源基因的
表达量能随病毒的复制和增殖而大大提高。构建肿瘤特异
增殖型病毒的方法很多。一种方法是将病毒复制在正常细
胞中所必需 ,而在肿瘤细胞中不需要的基因进行剔除。另一
种方法是利用肿瘤特异性启动子控制病毒复制所必需的基
因 , 使病毒只能在肿瘤细胞中复制、增殖 [ 2 ]。基于此 ,有学
者采用野生型腺病毒构建的 ZD55及 Ad. TERT系统显示 ,
ZD55基因及 Ad. TERT基因在正常细胞中的复制能力比在
肿瘤细胞中显著降低 , 而基因的表达量却随感染肿瘤细胞
时间的延长而明显增加 [ 3, 4 ]。
2. 非病毒载体 :非病毒载体包括脂质体、多聚阳离子聚
合物、纳米粒、胶束、细菌或多肽和 (或 )蛋白等。目前主要
用于靶向治疗的载体有脂质体、多聚阳离子聚合物和纳米
粒。根据靶向方法原理的不同可分为被动靶向、主动靶向和
外延靶向。 (1)被动靶向 :载体进入血液后被人体的网状巨
噬系统细胞吞噬 ,将目的基因带到肝、脾等富含巨噬细胞的
器官达到对这些组织靶向治疗的目的。这是由载体的物理
特性所决定的。 (2)主动靶向 :许多细胞表面特异性地表达
或过表达某种抗原或受体。用相应的抗体或配体对非病毒
载体的表面进行化学修饰 ,利用受体 2配体或抗原 2抗体相互
作用的特异性 ,可把目的基因特异性地转导入靶细胞中 ,实
现载体的主动靶向 [ 5 ]。其基本原理是配基 /抗原与聚阳离子
偶联 ,利用阳离子与 DNA阴离子的相互作用 ,形成配基 /聚
阳离子 /DNA复合物 ;复合物通过配基与受体结合所介导的
内化途径进入细胞。最早采用的是肝细胞表面的唾液酸受
体。目前应用的配体有半乳糖、甘露糖、表皮细胞生长因子、
纤维细胞生长因子、转铁蛋白、RGD 肽、叶酸及各种单克隆
抗体等。 (3)外延靶向 :借助超声、磁性、pH值等物理手段
和载体本身的理化性质 ,将携带目的基因的载体特异性地导
入靶组织或细胞中。例如根据肿瘤组织 pH值比正常组织
低的原理设计的 pH值敏感脂质体可用于肿瘤的靶向基因
治疗。又如磁性纳米粒携带外源基因 ,体外局部施加磁场可
增强基因在局部组织器官的表达。应该指出的是 ,近年研究
较多的是超声技术。超声通过其空化效应可提高细胞膜的
通透性 ,促进外源基因进入细胞 ,增强基因在体外和体内细
胞的转染和表达水平 ,局部超声可增加基因转染的靶向性。
Anwer等 [ 6 ]经外周静脉注入阳离子脂质体 2DNA 复合物后 ,
应用超声对小鼠肿瘤区进行照射 ,发现其在肿瘤的表达量较
对照组显著增加 ,且这种增强基因表达的影响仅限于超声照
射区。
病毒载体不仅有较高的基因转染效率 ,而且有实现外源
基因稳定表达的优势 ,故是目前基因治疗中应用最广泛的载
体类型。但因其有免疫原性、激活体内原癌基因的可能性而
存在安全隐患。近年来 ,病毒载体导致的基因治疗严重并发
症引起人们的忧虑 ,基因治疗将何去何从 ? 已成为科学家面
临的重大挑战 [ 7 ]。此时 ,非病毒载体开始受到关注。非病毒
载体具有对人体良好的安全性、易生产及包装量大等特点 ,
但因其转染效率低、体内表达不稳定而曾长期被忽视。目
前 ,通过载体的修饰 ,并借助超声、磁性等手段增强非病毒载
体的靶向性、提高转染效率已成为研究热点 ,有良好的应用
前景。
·234· 中华内科杂志 2006年 5月第 45卷第 5期 Chin J Intern Med, May 2006, Vol 45, No. 5
二、基因的靶向表达
多数的载体并无组织细胞的靶向性 ,而通过调节目的基
因表达的空间或时间可实现靶向基因治疗。
1.调节基因表达的空间 :利用组织特异性的基因启动子
构建表达载体 ,虽然携带的外源性基因可转染多数细胞 ,但
仅靶细胞中存在特异的反式作用因子与组织特异性的基因
启动子结合后 ,才能激活外源基因的转录。然而 ,在非靶细
胞中外源基因表达不被激活。常用的组织特异性的基因启
动子多为肿瘤特异的基因启动子 ,如甲胎蛋白启动子、前列
腺特异抗原启动子、酪氨酸启动子及癌胚抗原启动子等用于
肿瘤的基因治疗。也有正常组织细胞中特异蛋白的基因启
动子 ,如降钙素基因启动子。
2.调节基因表达的时间 :由于某些疾病的基因治疗要求
目的基因在一定时间内和水平上进行表达 , 因而对目的基
因的表达时间和表达水平需要进行精确的调控。目前大都
是采用可口服的小分子药物 ,如四环素、RU 486及蜕皮激素
等控制一个经基因工程修饰的转录因子 , 进而开启目的基
因的表达。这个体系由两部分组成 :由针对目的基因 DNA
的结合区域、DNA激活区域和诱导药物作用区域融合而成
的转录因子 ;人工合成的含多个与 DNA 的结合区域结合位
点的启动子 [ 8 ]。这些小分子药物进入体内后 , 目的基因的
表达可在短时间内达到很高的水平 , 否则不表达或低水平
表达。有人在小鼠及非人类的灵长类的骨骼肌中成功地控
制了促红细胞生成素 ( EPO )基因的表达 ,即构建成功一种
纳巴霉素依赖性的转录活化因子控制靶基因 EPO的表达。
他们将含有转录因子成分的载体和含有 EPO 基因的载体同
时注入动物体内而不给予纳巴霉素时 ,动物的血浆 EPO 浓
度无变化 ,但给予纳巴霉素时 , 血浆的 EPO 浓度可增加 200
倍 ; 连续给药则可维持 EPO 浓度在高水平 ;不同的给药剂
量 ,血浆 EPO 浓度亦不同 ;一旦停药 ,浓度又会回落 [ 9 ]。
缺氧是一系列严重疾病的病理生理表现 ,如实体瘤、外
周动脉血管疾患、类风湿关节炎和糖尿病性视网膜病变等。
在低氧状态下 , 细胞的代谢可发生许多变化 ,很多基因的表
达会升高 , 因为在这些基因中都具有被称为低氧反应元件
(HRE) 的增强子序列。用 HRE构建的诱导载体在缺氧状
态下可以上调目的基因的表达。Boast等把荧光素酶基因置
于 HRE三聚体和 Molony小鼠白血病病毒 MoMLⅤ基因启动
子的调控下 ,在体外于低氧环境中转染乳腺癌细胞 T47D,结
果发现荧光素酶基因的表达水平比氧含量正常状态时的对
照组高 50倍以上。这类转录控制元件的使用较安全 ,一旦
病理状态消失 ,目的基因的表达也就停止 [ 10 ]。
三、基因的原位修复
人类许多遗传性疾病是由于单基因突变所致。在体细
胞中用野生的正常基因替换突变或受损的基因称原位修复。
传统的基因原位修复是通过基因重组进行 ,效率很低。最近
有人探索新的基因原位修复的方法 , 即采用三链形成寡核
苷酸、RNA /DNA嵌合分子 (RDO )和单链寡核苷酸 ( ssODN )
进行基因原位修复。应该指出 :后两种方法具有巨大潜力。
RDO技术中人工合成一条含 68碱基的寡核苷酸链 ,可折返
形成假双链结构 ,“双链 ”中的一条为 DNA,另一条为含 DNA
与 RNA的杂合链 ,即中央为 5个脱氧核苷酸 ,两侧各有 10
个核苷酸的杂合链 , 2条链的两端有 4个 T相连。只有 2条
链中央的碱基与目标基因序列不配对 ,用以修复突变的基
因。有人报道在 RDO 实验中发现 ,仅用杂合分子中的
ssODN (中央含有错配碱基 ) 也可以修复质粒或基因组中的
特定突变 ,而且合成简单、费用较低及效率较稳定 [ 11, 12 ]。
RDO和 ssODN进行基因原位修复的分子机制远未阐明。目
前认为有 2个相互连续的步骤 : RDO 或 ssODN 与靶基因序
列形成异源双链 ;细胞自身修复系统识别错配并启动修复系
统。应用上述技术成功地纠正了多种组织细胞的多个致病
基因的少数碱基突变 (β2半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、β2珠蛋白
及γ2珠蛋白、IX因子、载脂蛋白 E2、酪氨酸酶及肌营养不良
蛋白 ) [ 13, 14 ]。
基因原位修复无损基因组结构。无病毒载体所引起的
免疫反应不仅可校正隐性变异 ,还可以校正显性变异 ,尽管
其效率比病毒介导的基因增补要低 ,但修复后基因仍然受自
然调控因子长期稳定地调控。
四、基因的定点整合
过去几年中 ,在基因治疗临床试验中严重不良反应事件
的发生已成为人们关注的焦点。主要的原因是由于病毒载
体插入原癌基因的位置附近并激活原癌基因的表达 ,导致恶
性肿瘤的发生 [ 7 ]。促进外源治疗基因定点整合到宿主基因
的安全位点 (多为生物进化中的退化位点 ,与细胞增殖、肿瘤
抑制无关 ) ,既能克服随机插入导致的功能基因断裂、原癌基
因激活及染色体缺失等潜在危险 ,又可实现治疗基因的长期
表达。基因打靶技术是一种使基因通过同源重组按预期方
式改变生物体的遗传重组的实验手段。首先根据转基因受
体宿主细胞中特异染色体上特异位点的 DNA 序列特征 ,在
体外构建与此序列同源的、含目的外源基因并携带有一个或
几个条件选择标记基因的质粒载体 ,然后导入受体细胞 ,使
该质粒载体中含外源基因的同源区与受体细胞染色体特异
位点同源区进行同源重组 ,最后在一定的选择压力下 ,选择
出发生了同源重组的细胞克隆。定点重组酶在其中具有关
键作用 ,他们能识别宿主染色体的特异位点 ,并介导该位点
上的基因整合 [ 15 ]。定点重组酶多来源于细菌类原核生物 ,
其中