血清白-球分离wangnull实验
血清白蛋白、γ-球蛋白的纯化及鉴定分离实验
血清白蛋白、γ-球蛋白的纯化及鉴定分离实验目的:实验目的:综合应用盐析、离心、色谱、电泳、分光等技术来分离纯化及鉴定特定蛋白质.主要方法主要方法
盐析
凝胶色谱
离子交换色谱
电泳预处理粗分级基本程序细分级鉴定脱盐基本原理:基本原理:1. 首先利用盐析作血清蛋白的初步分离:在半饱和硫酸铵溶液中,球蛋白沉淀,离心后上清中主要含白蛋白。
2. 利用凝胶色谱脱盐: 葡聚糖凝胶G-25柱色谱将蛋白中盐成分(硫酸铵)除去。
3. 采用阴离子交换色谱进一步纯化蛋白: 在DEAE...
null实验
血清白蛋白、γ-球蛋白的纯化及鉴定分离实验
血清白蛋白、γ-球蛋白的纯化及鉴定分离实验目的:实验目的:综合应用盐析、离心、色谱、电泳、分光等技术来分离纯化及鉴定特定蛋白质.主要方法主要方法
盐析
凝胶色谱
离子交换色谱
电泳预处理粗分级基本程序细分级鉴定脱盐基本原理:基本原理:1. 首先利用盐析作血清蛋白的初步分离:在半饱和硫酸铵溶液中,球蛋白沉淀,离心后上清中主要含白蛋白。
2. 利用凝胶色谱脱盐: 葡聚糖凝胶G-25柱色谱将蛋白中盐成分(硫酸铵)除去。
3. 采用阴离子交换色谱进一步纯化蛋白: 在DEAE纤维素离子交换色谱上,对经过初步分离并脱盐的血清白蛋白、γ-球蛋白样品分别上柱、洗脱,进行进一步纯化。
4. 纯度鉴定: 利用醋酸纤维薄膜电泳进行鉴定。
1. 盐 析1. 盐 析原理: 当高浓度盐存在时,蛋白质往往凝聚并析出沉淀。该技术为“盐析”。
不同的蛋白质在不同浓度的盐中形成沉淀。在半饱和硫酸铵溶液中,血清球蛋白会沉淀,经离心后,可与白蛋白分离开。
影响因素:PH、温度、蛋白质纯度等。
逐渐改变硫酸铵浓度可分段盐析出不同的蛋白。操作步骤操作步骤 取0.5mL 血清,边摇边缓慢滴入0.5mL饱和硫酸铵,混匀后室温下静置10min,在台式高速离心机上10000r/min离心10min,取上清为白蛋白粗分离样品;沉淀加入0.5mL蒸馏水,振摇溶解,为球蛋白粗分离样品。2. 脱 盐2. 脱 盐 盐析后的粗分离样品中含有硫酸铵离子成分, 样品中含有过高的离子浓度会影响离子交换层析的效果,所以在用离子交换层析进行细分级前需要脱盐。
凝胶色谱法是一个温和而又快速的脱盐方法,同时可将蛋白质转换到用于离子交换层析的低离子强度缓冲液中。
2. 脱 盐2. 脱 盐凝胶色谱是以凝胶为固定相,当混合物随流动相经过凝胶色谱柱时,各组分因分子大小不同而被分离。
null操作步骤操作步骤0.02M NH4AC平衡葡聚糖G-25凝胶柱
调节流速
上样
检测收集分离组分
柱再生平衡:用0.02M NH4AC流洗,用BaCl2检测,无沉淀后继续洗30mL.色谱注意事项色谱注意事项避免样品稀释.
勿使洗脱液面低于色谱床面,避免干燥.
加样轻柔,勿冲散床面.
避免样品丢失(注意加样后随时检测)
色谱柱必须再生、平衡3. 纯 化3. 纯 化离子交换色谱是蛋白质提纯中广泛应用的方法之一。它是以离子交换剂为固定相,利用蛋白带电部分与具有相反电荷的离子交换剂吸附强弱的不同,而将混合物中的不同蛋白进行分离的色谱技术。
null阳离子交换剂具有带负电荷的酸性基团作为离子交换基团,能吸附流动相中的阳离子。
阴离子交换剂具有带正电荷的碱性基团作为离子交换基团,能吸附流动相中的阴离子。
null++++++AC- AC- AC- AC- AC- AC- 0.02M
NH4AC++++++蛋白样品---------++++++++AC- AC- AC- AC- AC- AC-
NH4+
NH4+0.06-0.3M
NH4AC--得到纯化的γ-球蛋白得到纯化的白蛋白(γ-球蛋白带正电)白蛋白,α、β
球蛋白带负电阴离子交换剂操作步骤操作步骤用0.02M NH4AC 缓冲液平衡。
上样(球蛋白粗分级组分)
检测收集γ-球蛋白 (当洗脱体积为10mL时)
收集3管,每管10滴。取其中浓度高的一管用于鉴定操作步骤操作步骤0.02M NH4AC缓冲液平衡
上样(白蛋白粗分级组分)
用0.06M NH4AC缓冲液洗脱α、β-球蛋白(洗脱体积30mL)
用0.3M NH4AC 缓冲液洗脱白蛋白
检测收集白蛋白分离组分 (当洗脱体积为4mL时)
柱再生平衡:先用20mL 1.5M 的NaCl-0.3M NH4AC洗脱,再用40mL 0.02M NH4AC 洗脱平衡。null20%磺基水杨酸,检查流出液中是否含有蛋白质。
10g/L BaCL2检查收集液中有无S02-4 。 4. 电泳鉴定4. 电泳鉴定醋酸纤维薄膜电泳:以醋酸纤维薄膜为支持物,在pH=8.6的巴比妥缓冲液中,血清蛋白的PI均小于8.6,带负电荷,电泳时向正极移动。由于迁移率不同而被分离。
醋酸纤维薄膜是一种由醋酸纤维加工制成的一种细密且薄的微孔膜。null操作步骤:
1.准备与点样
2. 电泳 (点样面朝下,100V 1h)
3.氨基黑10B染色2cm粗糙面
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