腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶研究进展

腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶研究进展 腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶研究进展 第32卷第2期 Vo1.32NO.2 农业科学研究 JournalofAgriculturalSciences 2O11年6月 Jun.2O11 文章编号:1673-0747(2011)02—0056—04 腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶研究进展 周彩琴,王丽娟 (1.宁夏大学生命科学学院,宁夏银川750021; 2.教育部西部特色生物资源保护及利用重点实验室,宁夏银川750021) 摘要:腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(ADP—glucosepyr()phosphorylase,AGPase)是植物和细茵中淀粉和糖原合 成的限速酶,该酶催化l一磷酸葡萄糖(G一1P)与三磷酸腺苷(ATP)反应形成腺苷二磷酸葡萄糖(ADPG).有关该酶 的定位,功能,酶学特性,分子生物学已经进行了较为深入和系统的综述. 关键词:腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶;亚基;转录;淀粉合成 中图分类号:$532文献标志码:A 腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(ADP—glucose pyrophosphorylase,AGPase)在许多植物叶片及贮 藏器官中都有发现.它是植物合成淀粉和微生物合 成糖原中的一个限速酶,催化由卜磷酸葡萄糖 (G一1一P)与磷酸腺苷(ATP)反应形成腺苷二磷酸 葡萄糖(ADPG)并释放焦磷酸(PPi)的反应.ADPG 作为活化葡萄糖基供体将糖基部分加到a一1,4葡聚 糖引物的非还原端,被淀粉合成酶用来催化形成淀 粉颗粒.植物组织中淀粉合成的曲线与AGPase积 累曲线是基本一致的,抑制AGPase的活性将导致 淀粉合成的部分或全部终止[1].因而,全面了解 AGPase的研究进展,对我们采用不同的方法来提 高淀粉含量和改良农作物品质具有重要意义. 1AGPase定位与功能 1.1AGPase定位 在光合细胞中AGPase定位于质体内,所作用 的底物G—l_P和ATP存在于质体中.而在植物非光 合器官中AGPase定位始终是一个有争议的问题. 在叶绿体中,ATP来自于光合作用,而在非光合器 官质体中,ATP是ADP(二磷酸腺苷)/ATP转运蛋 白从胞质溶胶中输入的.在叶绿体中,G一1一P是通过 还原性戊糖磷酸循环中葡糖磷酸异构酶和葡糖磷酸 变位酶(PGM)的作用所提供的.在非光合组织中, G一1一P或是直接从胞质溶胶中输入,或是在质体中 通过葡萄糖磷酸变位酶的作用由G一6P合成. 1.2AGPase功能 AGPase在许多植物叶片及贮藏器官中都有发 现,它催化G一1一P形成ADPG作为合成淀粉的直接 底物,是淀粉生物合成过程中的关键酶,其主要依据 是:?在AGPase缺失的突变体中淀粉的含量明显 下降.玉米胚乳shrunken2和brittle一2突变体(分 别为AGPase大小亚基基因的突变体),仅含5, 1O的酶活性,淀粉含量仅占野生型玉米的25, 30:{. 在豌豆胚芽rb突变体中,AGPase活性比 正常型下降9O,淀粉含量下降5OH].?转基因 植物的研究.在马铃薯中转入AGPase的反义基因, 酶活性几乎完全被抑制,淀粉含量也降低].在烟 草,马铃薯,番茄中,对无机磷酸不敏感的大肠杆菌 的AGPase的过量表达,促使淀粉积累增加_6. 2AGPase的酶学特性 2.1AGPase的结构 在细菌中AGPase是由glgC基因编码的同源 四聚体,由一种亚基(a)构成.植物与细菌的天然 AGPase大小相似,是有2个51kD的大亚基和2个 50kD的小亚基组成的异源四聚体;根据在植物细 胞内的分布,AGPase分为胞质型(cytosolic)和质 收稿日期:2OlO—l2一lO 基金项目:国家自然科学基金资助课题(30660079) 作者简介:周彩琴(1975),女,宁夏中宁人,硕士研究生,主要从事植物基因工程研究 第2期周彩琴等:腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶研究进展57 体型(plastidia1)2种.因此,在植物细胞内AGPase 存在着4种亚基:即胞质型小亚基(cytosolicsmall subunit,SSUI),质体型小亚基(plastidialsmall subunit,SSU11),胞质型大亚基(cytosoliclarge subunit,I.SUI)和质体型大亚基(plastidiallarge subunit,LSU1I).其中,小亚基行使AGPase的催 化功能,大亚基则调控小亚基的活性,发挥变构效 应.要使酶具有完全的功能,必须两者都出现,缺少 1种亚基的玉米,拟南芥,豌豆和马铃薯突变体内 AGPase活性明显丧失,最终导致淀粉水平的下降, 这充分说明大小亚基的分工协作[7]. 2.2AGPase的调控 2.2.1转录水平的调控高等植物中AGPase是 由2大(1AGPase)和2小(SAGPase)亚基组成的 异型四聚体,每个亚基是由不同基因编码组成.研究 表明马铃薯块茎形成时,AGPase的调控主要是在 转录水平上,而在叶片中AGPase调控主要在转录 后的加工].当马铃薯块茎形成时,1AGPase和 SAGPase的mRNA和AGPase的多肽链同时稳定 升高,高水平的tuRNAs,AGPase的多肽链和酶活 性,都表明在块茎形成时转录是调控AGPase表达 的主要机制,在其他作物中也得到了相同的结果.在 水稻中,SAGPase转录水平与淀粉积累速率一 致.在小麦种子中,AGPase的含量和淀粉合成速 率[1.j与AGPase的mRNA含量呈正相关.因而在 非光合贮藏器官中,AGPase在淀粉合成中作用主 要是通过转录来调控.相反,叶片中大小亚基水平显 着差异与多肽水平的接近则说明了在叶片中转录后 的调控起主要作用. 2.2.2温度对AGPase的调控在马铃薯块茎形 成时将马铃薯放在不同的温度下,测定块茎淀粉含 量,ADPG含量和AGPase活性.温度从21.5?升 高到30?时,淀粉合成降低了50l",在32?和 37?时,淀粉合成分别降低了6l和65[1; ADPG的含量在30-C和37?时分别比在25?时 降低了23和45,同样的实验结果也证明ADPG 含量在高温下有所减少ll胡;温度由32-C升高到 37?C时,AGPase活性下降了27_l.由此说明,温 度对AGPase活性有调节作用. 2.2.3化学物质对AGPase的调控 2.2.3.1AGPase的激活剂在植物中AGPase 自身主要调节碳同化途径.类似于其他代谢过程的 限速酶,AGPase也是受小分子效应调节物变构调 节的.3一磷酸甘油(3-PGA)是AGPase最有效的激 活物.A『1_5—4.5×10,mmol/L,用0.1×1O mmol/I的3-PGA,S.对ADPG和磷酸化酶分别 提高3.5倍和1.8倍,而Vmax提高了近4倍. 3-PGA对AGPase激活取决于3-PGA与AGPase 的巯基结合和环境pH值.氧化或除去巯基, AGPase的活性显着下降,在只有3-PGA作为 AGPase的激活因子情况下,pH对3-PGA有很大影 响,在pH值为7.5,8.0,8.5和9.0时,活性分别提 高3.1,2.9,4.8,和9.5倍,可以看出,在pH值9.5 时,酶活性相对最高. 除了3-PGA对AGPase有激活作用外,其他因 子L对AGPase也有激活作用.加入高浓度的BSA (20Og)能够提高AGPase活性14,19,在DTT和 3-PGA同时存在的情况下,AGPase活性略有提高.半 胱氨酸(Cys)浓度(20mmol/L),2一巯基乙醇浓度 (10mmol/I)和谷胱甘肽(GSH)浓度(1Ommol/L)分别 使未活化的AGPase的活性提高1.3,3.5和2.8倍. 2.2.3.2AGPase的抑制剂Milagros从麦叶中 分离纯化了完整AGPase,发现AGPase代反应的 最适宜底物为AMP一葡萄糖,无机磷酸(Pi), 3-PGA,ATP,ADP,NADP和AMP是AGPase代 谢反应的抑制因子,其中Pi是AGPase最有效的抑 制剂.在Pi浓度为2mmol/L时,AGPase活性下降 92.5,其他抑制因子有NADP(抑制AGPase活性 的74.0),ADP(抑制AGPase活性的55.0)[1. 2.2.3.3Pi与3一PGA相互作用对AGPase活性 的影响除了小麦和大麦胚乳组织外的植物其他 组织中,AGPase均受变构调节,被3-PGA激活,而 被Pi所抑制.通过调节体内磷酸化水平,改变激活 因子3-PGA与抑制因子Pi的浓度比率可以控制 AGPase的活性,从而调节淀粉的合成.所以在研 究过的种类器官中,控制淀粉合成的重点都放在 了通过3PGA和Pi对AGPase的调节.叶片内 3-PGA~IPi水平依据光合作用中碳的固定水平而 改变,在叶片中当对碳的吸收高于对碳的需求时, 淀粉合成则较快,当碳吸收较低时,淀粉合成则减 慢,于是,尽管淀粉生物合成的调控因不同种类及 组织而有差异,但3一PGA/Pi仍然成为AGPase活 性调解的重要模式.有研究表明,AGPase在贮藏 器官内的调控不像在叶内那样明显,且不存在明 显的以代谢为媒的短期调控,因此,该调节模式就 储藏组织而言仍处于探索阶段. 3AGPase的分子生物学 3.1植物AGPase序列的同源性(相同或相似) 马铃薯大小亚基氨基酸序列具有52的同源 58农业科学研究第32卷 性,比菠菜叶高35同源性.马铃薯AGPase小亚 基与水稻胚乳AGPase小亚基为84同源性,比菠 菜叶小亚基同源性高93.马铃薯大亚基与小麦胚 乳AGA17,玉米胚乳Shrunken22仅有58和61 的同源序列].上述数据说明,同一物种大小亚基 的同源性低于不同物种同一亚基之间的同源性;不 同物种同一亚基之间小亚基更加保守,大亚基趋向 分离.因此推测,高等植物2亚基来源于同一基因, 只是该基因在进行复制过程中,受选择压力或最适 活性需求而出现分离,产生2种不同的多肽(2亚 基). 3.2编码AGPase每个亚基基因的拷贝数和表达 情况 在不同植物中,编码每个亚基基因的拷贝数和 表达情况很不同.例如在马铃薯中编码AGPase大 亚基的基因有3个拷贝,小亚基有1个拷贝;而在大 豆中编码AGPase大亚基的基因仅有1个拷贝,而 小亚基却有2个拷贝.马铃薯AGPase大亚基基因 的3个拷贝在块茎中均表达,而在叶片中只有2个 拷贝表达;大豆1个大亚基的基因表达没有组织特 异性,而它的2个小亚基却有明显的组织特异性,1 个仅在豆荚和叶片中表达,另1个只在胚中表达.有 些植物(如大麦)的AGPase小亚基虽然只有1个拷 贝,但它通过不同启动子调控合成出2个不同的转 录体,1个在叶中表达,另1个在胚乳中表达.事 实上在植物不同组织或器官中表达不同的大小亚基 是植物对AGPase的一个重要的调节方式,用这种 方式可以形成不同结构的AGPase,它们对变构调 节物表现出不同的敏感性.例如,在大麦,大豆的叶 片中,AGPase对3-PGA和Pi很敏感,而它们相应 的胚乳和胚中的AGPase对诱导物的存在并没有明 显的反应. 3.3AGPase的异源表达 随着对AGPase的结构,功能,调节特性等的不 断深入研究,可以通过改变AGPase的结构特征,达 到控制淀粉合成速率的目的.例如,编码E.coli— AGPase基因在马铃薯块茎中的表达,用于研究 AGPase与淀粉合成的关系;马铃薯AGPase基因 在细菌中的表达,用于研究AGPase的性质.前一系 统结果表明,编码E.coliAGPase的glgC基因嵌合 来自于拟南芥核酮糖一1,5一二磷酸羧化酶小亚基基 因(rbcs)编码修饰叶绿体转运肽(modified chloroplasttransitpeptide,CTP),在CaMV增强的 35S(CaMV—e35S)启动子和多腺苷作用信号因子 (NoS)控制下转化马铃薯植株,达到了提高AGPase 活性和增加淀粉含量的目的.有人通过将编码 E.coliAGPase—glgC的突变体glgC16组成CTP— glgC16,连接在块茎特异性表达的patatin启动子 后转化并获得了表现正常的马铃薯植株,其块茎淀 粉含量比对照株平均增加35,有些块茎淀粉含量 甚至比对照株高60【-]. 3.4AGPase与块茎的淀粉合成 关于AGPase与淀粉合成的关系,前人通过光 合产物控制,反义抑制等方法进行了研究.光合产物 的控制分析结果表明,AGPase对马铃薯植株叶片 淀粉合成的通量控制系数(Fluxcontrolcoefficinet, FCC)高达0.6mol/L,AGPase对块茎淀粉合成的 FCC为0.55,对蔗糖合成的控制系数为一0.47..一. 反义抑制马铃薯AGPase小亚基eDNA的表达发 现,转基因块茎AGPase活性显着减少,淀粉含量也 急剧降低.若在块茎特异性表达Patatin启动子控制 下将正义的异源AGPase基因glgC16转化马铃薯 植株,块茎淀粉含量比对照株平均增加35,有些 块茎淀粉含量甚至比对照株高6O. 4展望 AGPase催化产生腺苷二磷酸葡萄糖进行淀粉 生物合成时,其表达水平的高低对淀粉积累具有决 定性作用.淀粉代谢涉及多种酶的调节,是一个精确 的,系统的,复杂的过程.整合基冈组学,蛋白质组学 和代谢组学的方法研究代谢路径,克隆典型品种基 因型的大亚基编码基因,分析其序列差异,研究造成 淀粉含量区别与大亚基多肽组成变化的联系,为我 们获得淀粉糖代谢的清晰路径和关键调节位点提供 了新的途径. 通过体内表达,确定不同AGPase小亚基和大 亚基编码基因基因型的调控区别和类型,将揭开体 内条件下淀粉合成限速酶AGPase的酶学和凋控机 制,因此,体内条件下代谢调控研究手段已成为限制 大小亚基研究的突破口,建立高效,快速,可靠的体 内表达将是该领域的另一研究热点. 参考文献: [1]SWEETLOVEIJ,MUILER-ROBERB,W1IIMITZER I,eta1.ThecontributionofAGPPtOthecontrolofstarch synthesisinpotatotubers[J].Planta,1999,20(9):330-337. 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