药用植物金荞麦辐射诱变突变体无性繁殖遗传稳定性及cDNA-SRAP的研究(可编辑)

药用植物金荞麦辐射诱变突变体无性繁殖遗传稳定性及cDNA-SRAP的研究(可编辑) 药用植物金荞麦辐射诱变突变体无性繁殖遗传稳定性 及cDNA-SRAP的研究 学校代码: 学 号: 博士学位 药用植物金荞麦辐射诱变突变体无性繁殖 遗传稳定性及.的研究? 院 所: 药用植物研究所 姓 名: 兰金旭 指导教师: 李艾莲研究员 学科专业: 生药学 研究方向: 药用植物遗传育种 完成日期: 年月独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成 果。尽我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不 包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得北京协和医学院清华 大学医学部或 其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同 志对本研究所做的 任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名: 时间:?汐年钿/日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解北京协和医学院清华大学医学部有关保留、使用学位论文的 ,即:学校有权保留送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅,可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意北京协和医学院清 华大学医学部可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内 容。 研究生签名: 时间:冈年厂月/日 帆年月/日 导师繇焉恢超目 录 一。???????????????????????????????????????????????一 目 录 摘要?”?. 缩略词? 前 言文献综述??.? .金荞麦的研究进展?.. ..植物学特性..命名与分布..营养价值 ..繁殖方式研究? ..生药学研究..组织培养研究? ..染色体研究..生态和遗传多样性研究 ..化学成分研究? ..药理学研究?. .植物遗传稳定?陛的研究??.. ...形态学标记..同功酶检测..细胞学标记.. 、和等分子标记 . 的研究进展?.. .. 的原理及技术特点.. 的反应体系的建立 ..扩增产物检测与片断测序?.. .. 标记技术在植物研究中的应用??一 金荞麦辐射诱变突变体农艺性状及稳定陛研究.材料与方法? ..试验材料??. ..试验方法??. ..生育期观察?. ..性状测定 ..数据分析??. .结果与分析? ..金荞麦物候期. ..金荞麦性状特征..金荞麦各指标的变化. ..金荞麦干物质积累规律??. ..金养麦单株根茎产量. ..相关性分析?. .小结与讨论? .生育进程的改变与辐照的关系??.目 录 ..辐射引起突变的不确定性?. ..金荞麦根茎产量变化的主要影响因素??. ..金荞麦产量与农艺性状之间的关系. 金荞麦突变体抗氧化酶活性和同功酶以及稳定性研究? .金荞麦突变体抗氧化酶活性以及稳定性研究..材料与方法. ...试验材料?一 ...试验方法?一 ..结果与分析. ...不同繁殖代数金荞麦酶活性的测定 ...不同繁殖代数金荞麦酶活性的测定 ...不同繁殖代数金荞麦酶活性的测定. ...不同繁殖代数金荞麦酶活性的测定 ...不同繁殖代数金荞麦类黄酮含量的测定.. ...不同繁殖代数金荞麦花青素含量的测定.. ..小结与讨论. ...金荞麦抗氧化酶活性的变化规律.. ...酶活性变化的原因一 ...类黄酮化合物的保护作用~ .金荞麦叶片同功酶的研究? ..材料与方法?. ...仪器设备?一 ...材料?一 ...方法?一 .结果与分析?. ...金荞麦叶片的同功酶谱带分析...金荞麦叶片的同功酶谱带 分析...金荞麦叶片的同功酶谱带分析??. ..小结与讨论?. 金荞麦突变体光合作用特性及稳定性研究 .金荞麦苗期光合作用与光合色素的关系? ..材料与方法?. ...试验材料?.. ..光合作用和叶绿素荧光测定方法.. ..结果与分析?. ...苗期植株叶片颜色的变化.. ...金荞麦叶片中花青素和类黄酮含量的变化??一 ...金荞麦叶片中绿素含量的变化.. ...金荞麦叶片中类胡萝素含量的变化?.. ...光合作用以及叶绿素荧光的变化一 ...相关性分析.. ..小结与讨论?. ...花青素和类黄酮的变化规律??一 ...花青素与光合作用的关系.目 录 .金荞麦的日光合变化及光响应曲线的测定 ..材料与方法...光响应曲线的测定“ ...光合作用日进程测定??.. ..结果与分析...不同金荞麦光响应曲线的差异?一 ...光合速率日变化特征??.. ..小结与讨论.金荞麦突变体不同生长阶段的光合特性研究..材 料与方法?. ...试验材料?.. ...试验方法?.. ..结果与分析?. ...金荞麦叶绿素含量的变化.. ...金荞麦叶片中类胡萝素的变化.. ...光合作用各参数的变化?.. ...叶绿素荧光各参数的变化.. ...金荞麦叶片各参数相关性分析?.. ..小结与讨论?. ...光合色素的变化规律??.. ...光合作用的变化规律??.. ...叶绿素荧光参数的变化?.. 金荞麦突变体的染色体研究 .材料与方法..主要仪器??. ..材料??一 ..植物染色体观察??. ..植物气孔观察. .结果与分析..染色体核型分析??. ..气孔观察??. .小结与讨论..金荞麦染色体的研究现状?. ..染色体倍数与植物发育及气孔的关系??. ..染色体多倍体形成的原因?. 金荞麦突变体一一表儿茶素含量研究.材料与方法? ..试验材料??. ..水分含量测定. ...一表儿茶素含量测定. .结果与分析? ..水分含量测定. ..线性关系考察. ..一.表儿茶素含量测定.目 录 .小结与讨论? 金荞麦.差异表达基因研究? .材料与方法? ..材料?. ..仪器与设备?. ..主要化学试剂. ..试验方法??. .. 的反转录 .. 反应体系的建立??一 .. 扩增产物的电泳检测。 ..相关特异性片段的克隆??. .结果与分析? .. 提取.. 的结果统计?~ ..差异条带回收与分析. .小结与讨论? 总结与展望? .总结. .工作中的创新与不足 .展望??..:. 参考文献图版 导师简介个人简介致谢 摘要 摘要 金荞麦 .为蓼科荞麦属 多年生草本植物,具有抑制肿瘤、抗癌等功效。由于需求量过大, 野生资源过度采挖,以及人类的活动对生态环境的破坏,使野生金荞麦资源濒危, 并于年列入《国家重点保护野生植物名录第一批》中。 荞麦属部分种间存在着显著的白交不亲和性,因而进行荞麦种间常规杂交育种 困难较大,野生金荞麦以根茎无性繁殖为主。本研究从,照射的江苏号金荞麦 的根茎的后代中筛选出红茎和红叶突变株系,连续多代对突变株系的稳定性以及生 理特征进行研究,对不同突变体纯化株系的染色体和同功酶进行分析,并利用 ?分子标汜对差异表达基因片段进行研究。 农艺性状分析 金荞麦在生长发育过程中,红茎和红叶的生育进程受到不同程度的推迟,扦插 苗的推迟时间长于根繁苗。绿茎的株高较高,红茎较低且分枝数较多,红叶的叶面 积较大。金荞麦根茎在月.月中旬进入快速增长期,根茎的干鲜重于月份达 到最高。绿茎的根茎干鲜重较高,红叶略低,与红茎差异显著。绿茎和红茎的分支 数以及茎节数与根茎产量形成为负相关关系。连续两年的观察表明农艺性状和生育 期趋于稳定。 抗氧化酶活性和同功酶谱研究 金荞麦叶片的、、和酶活性随着植物的生长而逐渐升高。 红茎和红叶的酶活性在苗期和生长期的高于绿茎株系,但是差异不显著。 金荞麦叶片同功酶在不同时期和不同株系间各不一样。红叶远端谱带比红 茎和绿茎多出条;绿茎和红叶的近端酶谱带苗期时为条,多出红茎条;生长 期绿茎为条,比红茎和红叶多出条;花期时都为条带,绿茎的条谱带的位 置和红茎、红叶不一致。同功酶和同功酶谱带无差异。 连续几代的试验表明金荞麦的酶活性和同功酶谱在不同代之间表现出一定的规 律性,金荞麦的遗传趋于稳定。 光合特性研究 金荞麦叶片中光合色素含量在苗期和花期较低,生长期较高。绿茎中的叶绿素 含量较高,红叶中的叶绿素含量在苗期时逐渐超过红茎。/的比值在苗期较 低,生长期较高,花期时有所降低;红叶的/比值在苗期和生长期都较高。 红茎和红叶中的类黄酮和花青素含量都高于绿茎。红茎和绿茎中的类黄酮和花青素 含量随着植株的生长逐渐升高,红叶中类黄酮含量随植株的生长逐渐升高,花青素摘要 含量随着植株的生长逐渐下降。 金荞麦一卜片的净光合速率在生长期较高,苗期和开花期较低。苗期时,绿茎叶 片的净光合速率和表观羧化效率较高,红叶叶片中的花青素的存在可能抑制了红叶 叶片的光合作用。生长期时,金荞麦的净光合速率日变化均呈双峰曲线,由于气孔 限制的原因,具有不同程度的“光合午休”现象。 和等叶绿素荧光动力 红茎和红叶在苗期和生长期的/、、? 学参数低于绿茎,而值却高于绿茎株系。花期时,绿茎的升高,和? 也降低,这可能与金荞麦各植株衰老程度有关。各荧光参数的变化,表明辐照 后对突变体株系的光合能力有~定的影响,导致红叶和红茎的光合作用较弱。 连续两年的试验,金荞麦中的光合色素含量、光合作用和叶绿素荧光的变化趋 势基本上一致,遗传已经相对稳定。 染色体核型分析 金荞麦染色体的核型均为型。绿茎的染色体核型组成为 ,红茎的染色体的核型组成为,红叶的染色体核型 组成为 。 有效成分含量研究 金荞麦根茎中的一一表儿茶素含量在月份快速增加。红叶金荞麦根茎中的.一 表儿茶素含量一直高于绿茎,而红茎的含量较低。收获时绿茎根茎中一.表儿茶素含 量为.%,红叶为.%,而红茎为.%。扦插苗的根茎中有效成分的含量 稍低于根繁苗的含量。 ?研究 通过改良的法提取叶片中的总,经反转录后,用直接进行 扩增,分析金荞麦基因的差异表达。从对引物组合中的筛选出的对引 物对个样品的进行扩增,获得条长度在.的条带。其中,特 异性条带条,占总条带数的.%,对其中条特异性差异条带克隆分析,发 现突变体中有条片断功能类似,其中条可能与天冬氨酸氨基转移酶有关。 关键词:金荞麦;绿茎;红茎;红叶;农艺性状;光合作用;抗氧化酶;一一表儿茶 素;核型分析;同功酶;.。.... .” ” . , . .,, . 一, , . : . , .. , , ,. . . . , ,, ,.; , , ; , ,; . .. , , . ./ ‘’, . , , ,. , . , . , /,.,. ./,? ,. , .? . ? , ., , ’ . , . . , .%. % . % . . .. . .%. , , . ; ; : ; ; ;; ;一; ; ;? 缩略词 缩略词 中文 缩略符号 英文 抗坏血酸过氧化物酶羧化效率 / 胞间浓度类胡萝卜素 过氧化氢酶叶绿素 脱氧核糖核酸非循环电子传递速率 最大荧光 初始荧光 可变荧光原初光能转化效率 / 叶片气孔导度过氧化氢 高效液相色谱 非光化学猝灭系数 光合有效辐射强度最大净光合速率净光合 速率 光系统 过氧化物酶 光化学猝灭系数 核糖核酸基于序列扩增多态性 ? 超氧化物歧化酶 蒸腾速率 水分利用效率 实际光化学量子效率 ? 刖 舌 刖 吾 金荞麦是一种具有抗癌活性的药用植物,其抗瘤谱较广泛,能干预肿瘤细胞侵 袭及转移扩散。民间多口服其根茎,以其活血化瘀、清热解毒、祛邪扶正的功效, 获得了较好治疗效果。金荞麦的资源调查发现部分地区的金荞麦成分含量较低,质 量较差,不适宜药用。而且随着市场需求量的增加,金荞麦野生资源被过度采挖, 造成资源匮乏,处于濒危状态。 药用植物的人工栽培是目前解决野生植物资源匮乏的有效方法,金荞麦仅在云 南、贵州、四川等少数地区有零星栽培。关于金荞麦的品种类型仅在北京地区刘铁 成等人的人工栽培引种中有所报道,分别为贵州号和江苏号,在药用植物研究 所实验地试种后,发现产量较好,成分含量也比较高,适宜北京地区生长。由于金 荞麦在北京地区难以收获种子,主要是通过根茎和枝条扦插以无性繁殖的方式进行 繁殖。关于金荞麦品种选育中,虽然杂交组合成功,但获得的后代不育或者无法结 实,因而无法推广进行。辐射诱变是进行作物品种选育的一种有效手段,可以诱导 体细胞变异,经无性繁殖遗传给后代,从而缩短育种周期。 本论文通过用对金荞麦的根茎进行辐照,分别从无性繁殖的代中选 育出红茎突变体、代选育出红叶突变体,主要从农艺性状、生理活性以及光合 特性等方面进行研究,并对突变体的染色体核型,同功酶谱带以及.分 子标记对差异表达基因片段进行初步分析。通过扦插和根繁的连续无性繁殖试验, 对突变体的性状、遗传稳定性进行的初步研究,为金荞麦进一步的品种选育奠定基 础。同时,金荞麦中的主要药用成分属于类黄酮类次生代谢产物,其中花青素属于 类黄酮代谢途径的分支,研究辐照后颜色突变体与体内有效成分 之间的联系,可以 为药用植物品种选育提供一种新选择标记。原书为空白页 不缺内容文献综述 文献综述 .金荞麦的研究进展 金荞麦为蓼科植物 .,根茎入药,为我国重要 的传统中药材,民间多用于治疗肺脓疡,白汗盗汗,久痢不止,关节酸痛,多发性 脓肿,跌打损伤等。药典一部收录具有清热解毒,排脓祛瘀等功效。 金荞麦的块根活性提取物主要为类黄酮次生代谢产物,含有一类原花色素苷的 缩合性单宁混台物,据中华本草具有显著的抗癌、抑制肿瘤细胞侵袭和转 移,以及抗菌消炎等重要作用,是多种重要的抗癌药物和癌预防药物如复方金荞麦 颗粒、金荞麦片、和威麦宁胶囊等的主要成分。 ..植物学特性 ,分枝,具纵棱, 多年生草本根状茎木质化,黑褐色。茎直立,高. ,宽. ,顶端渐尖,基部 无毛。有时一侧沿棱被柔毛。叶三角形,长. ,托叶鞘筒状, 近戟形,边缘全缘,两面具乳头状突起或被柔毛;叶柄长可达 膜质,褐色,长. ,偏斜,顶端截形,无缘毛。花序伞房状,顶生或腋生; 苞片卵状披针形,顶端尖,边缘膜质,长约 ,每苞内具.花;花梗中部具关 ,雄蕊, 节,与苞片近等长;花被深裂,白色,花被片长椭圆形,长约. 比花被短,花柱,柱头头状。瘦果宽卵形,具锐棱,长,黑褐色,无光 泽,超出宿存花被.倍。花期月,果期.月中国植物志,李安仁,。 ..命名与分布 金荞麦在各地有许多异名彭勇,,如野荞麦云南、金锁银开江苏、浙 江、江西、贼骨头江西、浙江、荞麦三七湖南、河南、广东、苦荞头江西、湖 南、贵州、河南、四川、铁拳头江西、天荞麦江西、湖南、荞麦当归陕西、湖 北等。年月日国务院批准了《国家重点保护野生植物资源第一批,金荞 麦被列为国家重点保护野生植物,保护级别为级,其标准的中文名和拉丁学名: 。 蓼科,金荞麦 目前文献上普遍引用的金荞麦学名为 ..。因为 其依据的植物学名 在年发表时无拉丁文描述,属于不合 .年发表晚,因此 法种名。年正式发表时已较 .、 ..均只能.、户 作其异名。 金荞麦主要分布于亚热带气候带内,适生于山谷湿地、山坡灌丛,海拔 .。当气候温暖湿润,气温偏?,更适宜它的生长。金荞麦的大抵包括我 国黄河以南各省区:河南、江苏、安徽、浙江、福建、江西、湖北、湖南、广东、 广西、陕西、甘肃、云南、四川、重庆、贵州、西藏和长江中下游及珠江流域区,金荞麦突变体无性繁殖遗传稳定性及.研究 北纬。.。,,东经。的广大区域内。从地貌来说,长江中下游平原、 江南丘陵、两广丘陵、四川盆地及云贵高原都有金荞麦的分布。海拔左右的 凸地到海拔的高原区,金荞麦都可以生长。调查发现我国西南地区的金荞麦 资源比较丰富赵佐成等,,云南地区金荞麦资源具有丰富的遗传 多样性吴 惠群等,。国外土要分布于印度北部、锡金、尼泊尔、克什米尔、越南、泰 国等赵佐成等,。 金荞麦具有抗癌药效,但是它的药效与所产环境密切相关,并与海拔高低有 关。低海拔区所采金荞麦,根茎由块根已变成茎根,茎根中提取抗癌有效成份极少。 虽然金荞麦的分布比较广泛,但是由于需求量较大,人工栽培的金荞麦产量和 品质的限制,造成了对野生金荞麦资源的大量需求,进而对野生资源造成了极大的 破坏,种源大量减少,濒临灭绝。鉴于此,野生金荞麦成为我国野生农作物基因库 的首批成员,重庆市建立了全国第一个野生金荞麦原生境保护区。 ..营养价值 近年来,栽培荞麦的营养、保健作用受到国内外的普遍关注,作为其近缘野生 种的金荞麦的营荞价值尚未得到充分认识张政等,;吕桂兰等,。 金荞麦籽粒中的粗蛋白含量高达.%,达到优质禾谷类粮食的蛋白质含量水 平,其中球蛋白含量达到.%;金荞麦的根、茎、叶和花中都含有、、、 、、、、、、、等种微量元素,而且微量元素含量、 含量和高于或者相接近小麦粉和稻米;此外,金荞麦籽粒中含有种氨基酸, 其必须氨基酸含量较高,尤其是,,,及的含量显著高于禾谷 类粮食中的氨基酸水平,必需和半必需氨基酸占全部氨基酸总量的.%。 金荞麦根、茎、叶、花中都含有维生素、维生素、维生素、维生素 及维生素,同时籽粒中的维生素含量更是出类拔萃,其维生素,和维生素 的含量均高于苦荞和甜荞,维生素和维生素的含量低于苦荞,而远高于甜荞。 金荞麦籽粒还含有丰富的生物类黄酮,其含量接近苦荞,而超过甜荞。金荞麦 黄酮主要成分为槲皮素、芦丁、莰菲醇、桑色素等,具有良好的扩张血管、降低胆 固醇的作用。因此,金荞麦还是一种很有潜力,有待进一步开发的优良保健食品。 ..繁殖方式研究 云南地区的野生金荞麦霜降后逐渐枯萎,老根埋于土中,次年春季又发芽。分 布在不同气候带内的金荞麦,其枯萎时间不同。滇东北昭通、宣威一带,冬季寒冷, 金荞麦至月枯萎。昆明一带冬季温暖些,金荞麦月枯萎。而滇南红河元江一 带,气温更高,金荞麦地上茎叶则不枯萎,大叶落掉,长出小叶,过冬后,来年春 季又萌出新枝叶,茂盛生长吴惠群,。 人工栽培仅在贵州、四川等少数地区。关于金荞麦栽培育种的研究较少。金荞 麦在北京地区引种栽培,生长期天左右,株高...米,分枝.个。地上 文献综述 部枯萎于霜冻前,同期植物各部位的干物质积累重爰有效成分含量都达到了高峰, 此时期为最佳采收期,收获期各部位双聚原矢车菊甙元含量,根...,茎..., 叶...,花...%,地下部粮与地上部茎、叶、花之比为:..:.。 刘铁成等通过在北京地区对不同省份引进的金荞麦观察发现,它们之 间以及同一地区个体群之间在形态特征、生物学性状以及化学特征上,都有明显的 差别。贵州号在北京地区一年两次花期,分别为月和月中旬。江 苏号、江 苏号叶片及茎部均为绿色或微具粉红色,而贵州号变型茎及叶脉则为棕红色。 在化学特征方面,各变型间原花色甙元的含量也存在着一定的差异,其中贵州号 缩合原花色甙元含量为%,第二年含量%以上,而其它变型的含量则多为 %。 金荞麦可采用有性繁殖种子繁殖及无性繁殖。有性繁殖根据各地气候条件不 同,在秋季或春季播种。野外采收的种子在北京地区于月下旬播种,温度在. ?约.天出苗,出苗率达.%。温度是影响萌发的主要因素,研究了表明 发芽温度。是金荞麦种子发芽的较适宜条件杨坪等,。秋播当年不出苗, 需至翌年月出苗。冬季寒冷的地区,秋播畦面均应覆草防寒。春播当年采收,单 株根重为... ,小区平均产量为. ,约合亩产. ,缩合 原花色甙元的含量为.%。种子繁殖第二年产量与其它方法无明显差别。 由于北京地区的霜冻较早,金荞麦的种子难以结实和成熟,主要 通过无性繁殖 进行栽培。采用扦插、压条、芽苞和根茎进行繁殖,成活率均在%以上。根的 最高可达 产量则以用根茎繁殖最好,当年亩产可达 , ,其次为扦插 及芽苞繁殖。 在采用不同部位的根茎作繁殖材料的试验中,以根茎幼嫩部分及根茎芽苞作繁 殖材料,出苗率较高%,约比老根茎高%。采用根茎幼嫩部分繁殖,平均根 重及小区产量也较其它处理明显提高。 多年连续栽培观察表明,金荞麦在北京地区生长良好,产量稳定,有效成分含 量稳定。金荞麦除以根入药外其地上部茎、叶、托也具有较好的开发利用价值。 可扩大药材资源...倍。 ..生药学研究 金荞麦干燥根茎长.,呈不规则块状或圆柱状,常具瘤状分枝。表面棕褐 色,有横向环节及纵皱纹。质坚硬,不易折断,断面淡黄色至黄棕色,有射状纹理, 中央有髓。气微,味微涩潘宏林,。 根的横切面的木栓层由.列类长方形的扁平细胞组成,细胞壁木化加厚;皮 层甚窄;维管束外韧型,形成层成环;木质部宽广,约占整个横切面直径的/ 之多,其中导管较大,成束断续径向排列,横切面观为类圆形、多角形;射线明显, 由?列细胞径向排列;中央无髓。金荞麦突变体无性繁殖遗传稳定性及.研究 根茎的横切面的木栓层由.列排列整齐的扁平细胞组成,细胞壁常增厚;皮 层较窄;维管束外韧型,形成层成环;木质部发达,大量导管断续径向排列;射线 较密,径向略弯曲排列;髓部薄壁细胞中含淀粉粒及草酸钙簇晶。 叶片上下表皮均由列类方形细胞组成,有气孔分布。叶为异面叶型,栅栏细 胞呈长柱形,紧密排列;海绵组织疏松。维管束外韧型,个相对排列。薄壁细胞 内含有较大的草酸钙簇晶。 粉末粉末黄色至棕褐色。淀粉粒较多,单粒类球形、卵圆形,复粒由分粒 组成。草酸钙簇晶多见。导管多见网纹及具缘纹孔导管,少数为 梯纹导管。非腺毛 散在。纤维细长,有的两端有分叉,纹孔不明显。木栓细胞探黄色,呈长方形,壁 较厚。石细胞为类方形、类圆形或近多角形,黄色,壁厚,壁孔明显。 ..组织培养研究 金荞麦的组织培养研究集中于发状根培养和多倍体的诱导。通过发根农杆菌感 染金荞麦无菌苗后诱导出的发状根在液体培养条件下的增殖速度显著高于细胞培 养物,发状根培养物积累有效成分双聚原矢车菊甙元稳定,接近原植物的水平, 最高含量达.%干重。发状根培养物也适于大量培养,增殖率可达到./ 干重/天张荫麟等,。以金荞麦的茎、叶等器官为外植体诱导的愈伤组织基 础上,形成的红色细胞系富含类黄酮,其含量可在金荞麦细胞生长到达最高李 艳冬,。使用发根农杆菌对金荞麦不同外植体叶片、叶柄、愈伤组织 进行感染,获得的毛状根具有激素自养、多根毛、多分枝的特点,经光/暗、 液体培养基、‖蔗糖、摇床转速可以使培养的金荞麦毛状根增殖 倍数达到.,类黄酮含量最高达到.%潘灿飞,。最适宜金荞麦快繁 的培养基为附加 ;将其带绿色芽点的愈伤组织和无 / 和./ 菌苗浸泡在不同浓度的秋水仙素溶液中或接种于添加一定浓度秋水仙素的培养基 上处理一定时间后再进行培养,均可诱导金荞麦多倍体的产生吴清等,。 ..染色体研究 目前关于金荞麦染色体研究的报道不多,多集中于金荞麦的近缘种中。朱凤绥 等报道,金荞麦为四倍体,有对随体染色体,而同属的甜荞、米荞、翅荞 这个类型实际上都是甜荞根尖细胞都为二倍体,其中,甜荞有对随体染色体, 米荞和翅荞有对随体;苦荞为二倍体,也有对随体染色体;也有人报道苦荞中 有对随体染色体,和林汝法报道的对随体染色体的结果不同。有人对二 倍体多年生荞麦大野荞和毛野荞及四倍体的一年生左贡野荞进行核型分析,发现大 野荞有对非随体染色体和对随体染色体,而毛野荞染色体有对随 体染色体和对随体染色体。 在甜荞根尖中本研究也发现存在二倍体细胞和四倍体细胞的嵌合现象,而在茎 尖细胞中无,这暗示在荞麦中茎尖染色体数相对较稳定。由于根尖变异不能通过性文献综述 细胞遗传,但茎尖变异则可能通过细胞遗传。考虑到野生荞麦种子少、休眠期长而 不整齐、发芽率低等问题,在荞麦中用茎尖作细胞学研究可能更好。提示金荞麦的 核型分析可能用茎尖的效果会更好一些。 ..生态和遗传多样性研究 金荞麦是苦荞麦的近缘种,属于广布种,根状茎行营养繁殖,种子萌发率低赵 佐成等,。冀花存等在研究西南地区的金荞麦时,认为其生态位宽 度均较大,趋向于泛化种,与其伴生的优势种群有一定程度的生态位重叠。同时, 金荞麦与其它种群能够共同存在,这表明金荞麦群落能维持较高的物种多样性和相 对稳定性,所以金荞麦的生态位的不存在变窄的问题,对其的保护,只要停止人为 的破坏,金荞麦就可以得到很好的保护。因此建议在人为活动较强的野生金荞麦资 源分布点,设立一定的保护区,禁止破坏性利用,防止各种人为干扰,充分发挥金 荞麦群落的生态作用,就可以起到保护的作用张春平,。金荞麦对低浓度 的铝胁迫具有一点的适应性,低浓度的铝使金荞麦的茎节伸长,水分利用增强,地 上部分生物积累量增多,对金荞麦根际土壤细菌具有显著刺激效应,而高浓度严重 抑制金荞麦叶片光合作用的正常进行,刺激效应明显减弱,甚至产生抑制作用。陈 ’。 微微等,;罗虹等,。 关于金荞麦的遗传多样性的研究,多采用等位酶电泳技术和基因序列相 近度比较来进行。通过中的.区域序列和核序列之间的序列 比对,金荞麦可能是荞麦组中比较原始的类群,金荞麦与苦荞麦和苦荞野生近缘种 之间的相似程度大于荞麦和野生甜荞 ,。而杨小艳等采用 和同功酶技术却发现金荞亲缘关系与甜荞较近而苦荞较远。金荞麦和.关系比 .之间的关系近的多,而 且为此提供证据。野生甜荞从金荞麦中分化的时间要早于苦荞野 生近缘种。赵佐成 等采用等位酶电泳技术对苦荞麦及其近缘种共种变种的个居群经 过个酶系统的个位点的检测分析发现营养繁殖为主的金荞麦的种内居群间分 化明显,遗传一致度相对较低的植物,相对较多的遗传多样性存在于居群问,可能 是以近交繁育白花授粉或营养繁殖为主的。金荞麦和甜荞之间的基因序列 相近度较高,表明亲缘关系比较近 .,;通过线粒体中的非编 .,。印 码区序列分析发现金荞麦分布于荞麦属单独的各类群之 度的四倍体金荞麦的基因中的区域中的序列明显不同于其它 地方的二倍体和四倍体同一染色体,支持金荞麦可能是多系起源的假说, 。 ..化学成分研究 金荞麦根茎中具有多种化学成分,其中的原花色素类化合物被证明具有抗癌活 性。目前,已通过乙醇提取、丙酮提取、葡聚糖凝胶和大孔吸附树脂柱层析等方法,金荞麦突变体无性繁殖遗传稳定性及研究 从金荞麦根茎中分得双聚原矢车菊苷元、海柯皂苷元和谷甾醇永 隆等, 、 没食子酸酯、原矢车菊素聚合物姚荣成等,、赤杨酮、赤杨醇、棕榈酸单甘 油酯、木犀草素、正丁醇...吡喃型果糖苷邵萌等,、正十六酸、,一,一 十八二烯酸、,,,,,,,.八氢.,,,.四甲基..萘烯甲醇、樟脑、萘白政忠等, .,等。金荞 、.甲基.棉花皮素.....葡萄糖甙、 麦地上部分叶中已分离鉴定出个化合物,分别为苯甲酸、.谷甾醇、,’.二呋喃 醛基二甲醚、对羟基苯甲酸、芸香甙、槲皮素、胡萝甙和琥珀酸田磊等,。 张雯洁等从金荞麦的根茎提取物一威麦宁中分离得到个酚性化合物,分别 鉴定为,.二经基苯甲酸、没食子酸、 ..表儿茶素、..表儿茶素.没食子酸酯、 原矢车菊素.、原矢车菊素.,其中原矢车菊素.为主要成分,含量为该活性 部位的.%。其中,矢车菊素聚合物的基本结构单元为儿茶素或者.表儿茶素, 具 体外实验证明有抗肿瘤的作用;.甲基.棉花皮素.....葡萄糖甙和 有很强的抗氧化能力. /。 ..药理学研究 金荞麦的提取物一威麦宁具有对体外肿瘤的抑制作用,研究表明金荞麦提取物 在/时对多种人癌细胞的杀伤率均超过一个对数杀灭,同位素示踪发现能够明显 。剂量下能明显抑制一 抑制癌细胞内的核酸代谢盂凡虹等,;在 细胞侵袭,能抑制 细胞?胶原酶的产生,但对酶的活性无明显影响刘红 岩等,;对肝、白细胞、市、结肠.及骨骼 来源的癌细胞的生长受到显著抑制,其中肝癌细胞最为敏感等,;能减 少小鼠肺癌移植瘤组织血管生成,从而抑制小鼠移植瘤的体内生长吴学敏 等,。金荞麦醇提水沉法获得的提取物有明显的清除自由基、玉自由 基的作用,对基质金属蛋白酶.,.和肝癌.细胞有抑制 作用倪鹏,。以金荞麦提取物为主组成的复方威麦宁对、、、 .、.和等六种肿瘤细胞体外增殖具有不同程度的抑制作用娄 金丽,。 金荞麦对体内肿瘤的抑制作用,研究多集中于试验小鼠中。威麦宁对二乙基亚 硝胺诱发肿瘤的小鼠的胸腺有保护作用,利于细胞增殖、发育,降低肺肿癌诱发 率,显示威麦宁在预防肺肿瘤方面有一定的作用董玉宁等,。金荞麦根提取 物对接种于小鼠的肺癌及子宫颈癌有显著的抑制作用徐国辉等,; 能显著抑制小鼠移植性肉瘤、子宫颈癌及肺癌的生长,最大抑瘤率分 别为.%、.%、.%杨体模等,。 口服金荞麦对机体免疫功能有提高和保护作用,是一个良好的免疫促进剂。 用 /的威麦宁口服给药均能增强荷瘤小鼠脾细胞活性 /和 傅体辉等,;小鼠口服给金荞麦提取物,均可不同程度增强小鼠腹腔巨噬细文献综述 胞的吞噬功能印德贤等,。金荞麦的提取物可以作为一种提高机体免疫功能 的中药。 .植物遗传稳定性的研究 植物辐射诱变获得突变体之后,而对于突变体植株的突变特性能否通过无性繁 殖进行稳定的遗传,是进行下一步深入研究的基础。目前常用的植株遗传稳定性的 监测方法主要有以下几种,农艺学性状观察、同功酶谱的分析、染色体镜检、以及 分子标记检测等。植株遗传稳定性的研究主要集中于组织培养和离体材料的保存, 对于通过无性繁殖的突变体的遗传稳定性鲜有报道,一般情况下认为,通过根茎繁 殖的无性系的变异,可以保持部分性状的稳定。 ..形态学标记 对于无性繁殖的再生植株进行形态学或表现型上的遗传变异检测是最直接、最 简单,也是最常用的方法。有关质量性状的形态变异在众多类型的无性系变异中是 最容易鉴别的,这种变异在很多植物的再生植株中都有发现,如叶形、枝刺的有无等 .,; .;。而对于早期的通过根茎以及扦插繁殖的无 性系的检测主要是根据表现型变异来进行的。但对数量性状的表 现型变异往往通过 一形态学检测不易被检测到,且这种数量性状上的变异用形态学检测也受观测者个体 差异所限制。一般情况下认为,通过根茎繁殖的无性系的变异,可以保持部分性状 的稳定。 ..同功酶检测 植物的生长发育是在多种代谢和生理过程基础上所发生的基因在时间和空间 上所表达的综合现象,各种类型的差异性和主要代谢特征都是由其蛋白质和酶存在 的独特样式所决定的,因而对于不同代数同功酶谱的分析,可以间接的反映植物遗 传稳定性的状况秦敏,。贮藏年的小麦和谷子经酯酶同功酶检测,未发现 遗传变异陶梅,。王述民用酯酶、过氧化物酶、超氧化物岐化酶等同 功酶,研究小豆种质资源遗传多样性,效果较好。李灵芝研究认为小麦、玉 米反复回湿前后,酯酶和过氧化物酶同功酶没有明显变化。 ..细胞学标记 染色体数目和结构是否改变是植物无性繁殖稳定性另一检测方 法。植物突变 后,染色体结构变异包括易位、倒位、重复和缺失等情况,己在多种植物或者突变.,; .,,可能发生染色 体中发现了这些变异的存在 体数目变异包括整倍体变异和非整倍体变异 .,。其中,整倍体变 异研究的较早、较多,在许多植物的组织培养过程中都发现了多倍体 .,; .,; 张金文等,,原因可能是细胞内源有丝分裂或核融合造成的 一些植物的组织培养过程中还会产生混倍体王正询等,和类减数分裂产生的 单倍体陈一华等,。染色体的这些倍性变异一般会造成表现型异常,如四倍金荞麦突变体无性繁殖遗传稳定性及.研究 体植株的许多器官组织的变大、增厚等马国斌等,。植物中的非整倍体变异 多种多样 .,,也广泛存在于组织培养过程中,且在愈伤组织培养阶 段,这种非整倍体变异甚至比倍性变异还要普遍和复杂 .,;宋锡金 等,。 除了染色体的数目和结构变异外,还在植物组织培养中发现了一些异常染色体 行为。其中之一是姊妹染色单体交换频率的增加,姊妹染色单体的交换可以造 成双着丝粒染色体和无着丝粒染色体等,产生非整倍体和染色体桥,从而导致一系 列相应的异常遗传行为的出现 .,。还有如体细胞联会频率增高, 这在杂合基因型的植株中会产生后代的无性系分离,在多细胞起源的植株中会出现 嵌合体 .,。这些表明了无性系变异机制的复杂多样性和不稳定性。 .. 、和等分子标记 、和等分子标记可用于检测种形式的变异,甲基化、染色.,; .,。作为一种共显 体重排和单碱基变异 性标记,可以检测?的插入和缺失,并能检测异位、倒位和基因拷贝数的变 化,位点数为.。因此,只要能得到大量的探针,能检测的遗传位点非常多。就 每个酶的识别位点来说,能检测单碱基变异,但每个酶/探针组合仅能检测 。由于该标记操作复杂,过程较长,且涉及放射性物质,故其应用受到影响。 技术为另一种显性标记,每个随机的引物可以检测.个位点数,且 需要量少,简单易操作,成本低等优点已成为最常用的分子标记技术之一, 已成功地用于多种植物组织培养中体细胞无性系变异的检测。技术结合 技术的高重复性及技术简单快速的特点。不象分析那样必须制备探针, 且与标记一样对基因组多态性的检测不需要预知基因组的序列特征,同时弥 补了技术重复性差的缺陷。同其它以技术为基础的标记技术相比, 技术能同时检测到大量的位点和多态性标记吕振岳等,,通常运行一次就可 得到一条扩增带,且可以检测单碱基变异。 植物的遗传变异可以体现在形态学到的各层次水平上,检测的方法也应 建立在不同的层面上:形态标记简单易行,但对那些直到植株生长后期才表达的突 变无能为力,且易受培养环境的影响;染色体倍性和结构只能反应出染色体水平的 变异,不能检测出基因突变,;分子标记检测的位点多,结果可靠, 但成本过高,实际应用中仍不能覆盖整个基因组。因此,目前任何一种检测遗传变 异的方法,在理论上和实际研究中都有各自的优点和局限只能提供部分有价值的资 料,还没有找到一种能完全取代其它方法的技术。但是,我们应该认识到,在实际 研究中还没有任何一种现成的检测方法能够证明材料在繁殖和保存过程中绝对没 有发生遗传变异,所以遗传多样性的保持和期望性状的稳定性是最重要的判断标准 ,。因而,对于通过无性繁殖的突变体的遗传稳定性早期研究,主要 集中于形态、同功酶和染色体三方面,对于分子标记,理论上结果可靠,缺点是成 分过高,实际操作过程中的也存在着不能覆盖整个基因组的缺点,所以,对于突变 体遗传稳定性的早期选择中,分子标记并不十分适用。 . 的研究进展 .. 的原理及技术特点 真核生物的基因组是由不编码蛋白质的核苷酸序列和编码蛋白质的核苷酸序 列基因所组成,编码蛋白质的基因通常只是基因组的很小一部分,人类编码的蛋白 质仅占到全基因组的...%。基因组拥有的“基因”数目是由通过实验证明确有 蛋白质产物的真实基因和根据起始密码和终止密码序列所确定的潜在基因两部分 。由美 组成的。这两类基因都称为“开放读码框” 提出的,又叫基于序列扩增多态性 国加州大学的 与 . ,该标记通过一对引物对开放读码框 进行扩增,即分为个碱基的正向引物和个碱基的反向引物进行扩增,揭 示序列的多态性。而通过一对引物对进行扩增的技术。 该标记通过一对引物对开放读码框进行扩增,分为个碱基的正向引 物和个碱基的反向引物。正向引物’端前个碱基为填充序列,无任何特异 组成,紧接着序列,随后是’端个选择碱基,与相同的核心序列组成一 套正向引物。研究表明外显子一般处于富含区域,从中随机选择 个拟南芥序列,发现序列位于这些外显子中,正向引物中的序列目的 是与位于富含区域的开放读码框中的外显子进行特异结合。但是, 外显子序列 在不同的个体间通常是保守的,这种低水平多态性被反向引物的组合所弥补。反向 引物 端前 个碱基的填充序列,接着为序列,随后也是 端个个选 择碱基。其序列可以对富含的内含子区域和启动子区域进行扩增。由于 内含子、启动子和间隔序列在不同物种甚至不同个体间变异很大,从而与正向引物 搭配扩增出基于内含子和外显子多态性标记。构建正向何反向引物的总体要 求是它们不形成发夹结构及其他二级结构,且含量为%。%,且两“填充” 序列在组成上必须不同,长度为个或个碱基。 标记测序显示多数标记为外显子区域,其多态性产生于两方面:小片段 插入与缺失导致片段大小改变而产生共显性标记;核苷酸改变影响引物的结合位 点,导致显性标记产生。该标记具有诸多优点,如多态性高,产率中等;重复性好; 操作简单;在基因组中分布均匀;较易对扩增得到的目的片段进行测序;引物具有 通用性,而且其正向引物可以与反向引物两两搭配组合。 .. 的反应体系的建立 反应多数是基因组,也可以是。在一个标准反应体系中, ./ ,. / 酶。?反 ,./引物,金荞麦突变体无性繁殖遗传稳定性及.研究 应采用复性变温法;开始。变性, 反应前个循环在。 .,。 ?,?.条件下运行:之后.个循环温度提高到。复性,最后 延伸。前个循环复性温度设为.。,主要是考虑到低的复性温度能够 确保两个引物与靶部分配对;随后循环中复性温度升到。,可保证前个 循环的扩增产物可在余下循环中进行指数式扩增;如果复性温度在个循环中都 保持在.?,扩增片断重复性将很低。 ..扩增产物检测与片断测序 扩增产物在变性聚丙烯酰胺凝胶上分离,通常胶板厚度..,每孔加样 .?,保证单条带足量回收。可使用同位素,也可采用银染技术;用%的琼脂糖 凝胶也可分析多态性,但分辨的条带较少。对标记测序有可能获得更多的遗传信息。 由于多数产生高强带,很少有重叠,而且引物较长,故比易测序。获得 的标记差异片段,进行切胶回收后,用相应引物直接测序,必要时可采用克隆 测序。 .. 标记技术在植物研究中的应用 分子标记系统最早是在芸薹属作物开发出来于拴仓等,。 技术主要用于生物多样性的鉴定、遗传图谱的构建、重要性状基因标记、指纹 分析、基因克隆和杂种优势利用等方面。目前已在其他作物如马铃薯、水稻、生菜、 油菜、大蒜、苹果、樱桃、柑橘、芹菜、丹参、豌豆等植物中也成功扩增。常规作 物水稻、大麦、小麦、黑麦、甜菜等进行了遗传图谱等已有研究报道。 ...生物多样性的分类鉴定 分子标记广泛存在于基因组的各个区域,数量巨大,通过对随机分布于整 个基因组的分子标记的多态性进行比较,就能够全面评估研究对象的多样性,并揭 示其遗传本质。利用遗传多样性的结果可以对种质进行聚类分析, 进而了解其系统 发育与亲缘关系。由于在不同物种、不同个体间具有一定的多态性,技术也成 功应用于种质分类、鉴定与评价工作中。 钱丹等对来源于个产地的蒙古黄芪的样品进行了多态性研 究, 个引物组合,扩增得到条条带,聚类分析结果显示,份材料可以 分为个大类,结果表明技术可以有效用于蒙古黄芪的亲缘关系分析。李 廷春等通过对多态性引物组合对生长在四川中江、陕西商洛、山东临 沂、安徽毫州和安徽凤阳个丹参主产区的个丹参种群进行了遗传多样性分析, 共产生条多态性条带,平均每个引物组合产生.条多态性条带,显示了较高 的多态性。软件聚类分析将供试材料分为两大类,’遗传相似系 数在...之间,技术可有效地应用于丹参的遗传多样性及亲缘关 系的研究。彭飒等利用多态性好的对引物对个红花品种的基因组 进行.扩增,共扩增出条带,其中多态性带条,平均每对引物可 文献综述 扩增出条片断,条多态性带,占总位点的%。值为.时, 个红花品种被聚为两类,除号野生种和号栽培品种聚在一起外, 野生种和其 他栽培种完全分开。值为.时,利用引物的不同组合,可明显区分不同栽培 品种。在此基础上,这些特异性条带序列的获得,为栽培种红花 .的分子鉴别提供了有效途径。 .与野生种绵毛红花 等和对丹参进行居群以及多样性进行分析,对引物共 得到条多态性条带,对引物共获得条条带,其中条为多态性条带。 分析发现丹参居群件存在较多的遗传变异,聚类分为两大类,但和地理分布关系不 大,但是说明和是有效的估测丹参遗传变异的有效方法。 等、等、等、李严等、刘建 丰等、许晓燕等等、等、郭大勇等 刘志远等、凌磊分别应用技术对甜瓜、南瓜、野牛草、西 瓜、普通栽培烟草品种、毛木耳、苎麻、不同类型的青葙、湖北海棠、构树、棉花 等进行遗传多样性、品种鉴定以及系统发育和亲缘关系等不同方面的研究,结果表 明标记技术是一个评价遗传多样性、品种鉴定和系统发生的有效工具。 ...遗传图谱构建 遗传图谱对于基因定位至关重要,图谱上包括的标记数越多,分 布越均匀,则 基因定位就越精细。在图谱构建中,只有较高密度的分子标记图谱才能有效地应用 于数量性状基因定位、图位基因克隆、比较基因组学等研究中。 于拴仓等利用番茄品种和形成的群体,构建了 由个和个标记组成的遗传图谱。标记均匀分布平衡在 个重要连锁群上。高频率共显性与在基因组中均匀分布的特性优于标记而 成为一个构建遗传图谱的良好标记体系。王刚等用个引物组合对黄瓜 群体进行分析,个标记进入个连锁群,总长 .,标记平均间距., 每个连锁群有.个标记。’等通过对引物对份豌豆 .研究共获得条多态性条带,发现这些条带的分布和农艺性状 紧密相连,可以为分子育种提供基础。高丽霞等利用白姜花×圆瓣姜花的 群体个单株,分别构建了父母本的基于标记的连锁图谱。其中,个 . 标记进入个父本连锁群,覆盖遗传距离 ; 个标记进入个母 . 本连锁群,覆盖遗传距离 。 林忠旭等,利用棉花种间群体,吴洁等利用甘薯高 淀粉品种和低淀粉品种杂交分离群体,王强等用对对豫花号 和郑获得多态性标记,等通过对甜瓜杂交形成的代群体, 等通过和对响叶杨和银白杨杂交的代,都进行了连锁分析, 计算了标记间的距离,并构建了连锁图谱。金荞麦突变体无性繁殖遗传稳定性及.研究 ...绘制基因组转录图谱 转录图谱是比较基因组学研究的有效手段,而利用基于的.分 析来检测编码区的多态性将更加简便、高效、快捷。等利用花椰菜 植株与青花菜杂交产生的群体个单株,使用个引物组合,从个 中检测到个多态性.标记,平均每个引物对产生个,其中.%为 共显性;构建了由个标记组成的转录图谱。利用这个图谱,成功进行了甘蓝类 蔬菜作物与拟南芥基因组的基因排列与组成分析,发现这两类基因组的广泛同一性, 个多态性.标记中,共有个相似序列;这种同一性集中在某些 染色体片段而非整个染色体上;甘蓝中大多数重复区段集中于拟南芥号与号染 色体,而不是号与号染色体。等通过对引物组合对剪 股颖属的匍匐翦股颖 .、细弱翦股颖. .和茸毛 翦股颖. ..分析获得了个片断,序列分析和蛋白推测表达表明 这些和的合成,翻译以及信号转导有关,其中验证了基因,表明 有助于在转录水平对基因组进行分析。等通过?对个野 生的异源四倍体芸苔和个较早的二倍体进行研究,共筛选出条转录子带, 其中条.%在异源四倍体中沉默,而条.%转录子是激活的,这表 明自然界中的变异植株和二倍体在在基因复制和转录方面存在着的不同。 ...基因标记 重要农艺性状基因紧密连锁标记的获得,将可进行性状分子标记辅助选择,提 高育种的选择效率与预见性,加快新品种的选育进程。等大白菜中也发 现了一个与雄性不育基因有关的标记,在油菜中筛选到一个与连锁的 标记,在芹菜中获得一个与病毒抗性基因紧密连锁的标记。等 用黄瓜的群体,对侧枝性状进行定位,在第二连锁群检测到一个, 其贡献率为.%;同时把始花节位控制基因定位在第?连锁群上,与两侧标记的 距离分别为.和.。郁有健等以紫色大白菜回交群体的个 单株为材料,采用混合集群分析法构建大白菜的紫色与非紫色池,应用获得的对 稳定的引物组合进行分析,初步获得个与紫色性状相关的:?、 ..和..,同时获得个与这个连锁的标记,其中、 .、和? 个标记与其最近位点的连锁距离分别 、. 、. 和. 为. 。等通过和对 株黄瓜的标记基因位点进行作图,个标记中的个成功的转化为 之间,遗传距离分别为. 标记,位点定位在和 和.,并定位于号染色体上。 ...基因克隆 “等多数标记包含了可译框中的外显子,这为特定性状基因的 文献综述 分离克隆提供了极大方便。进一步测序与分析发现,通过群体获得 基因的显性标记与拟南芥中克隆中一未知基因的可 译框高度同源,该基因位于号染色体上,此基因座已经定位了一个去饱和基因。据 此推测标记也在这个基因内部。“等综合运用拟南芥相关基因 序列信息,应用技术对青花菜克隆测序,最终克隆了芥子油糖苷合成途 径中一关键基因..。等利用技术获得一个与? 基因共分离的标记,再用此标记序列来筛选青花菜文库的一个克隆,成 功分离到.基因,并通过遗传转化导