液相色谱法检测强化牛奶和奶粉中维生素D

液相色谱法检测强化牛奶和奶粉中维生素D 液相色谱法检测强化牛奶和奶粉中维生素D 液相色谱法 〔应用于液体牛奶和奶粉含维生素D大于等于1IU/g〕 A 原理 样品经皂化和提取，维生素D及异构体在净化柱上与干扰物分离。第二根柱子将维生素D与杂质分离，由于在皂化过程中生成一定量的维生素D前身，所以维生素D的含量需校正。维生素D是维生素D和维生素D前身之总和。 B 仪器 B.a 液相色谱仪 具有254nm波长紫外检测器及2根柱子:净化柱与分析柱。 B.b 净化柱 不锈钢250×4.6〔内径〕mm，用粒度为10μm Sil-60D-10CN填装，典型操作条件为纸速:1cm/min;洗脱液流量:1ml/min;检测器灵敏度:0.128AUFS;温度:室温;阀进样容积200μl;流动相为含0.35%正戊醇的正已烷。 B.c 分析柱 不锈钢，250×4.6〔内径〕mm。充填粒度为5μm，通过系统适应性试验。典型操作条件:纸速1cm/min;洗脱液流量2.5ml/min;检测器灵敏度0.008AUFS;温度:室温;阀进样容积500μl;流动相为含0.35%正戊醇的正已烷液。 C 试剂 C.a 正已烷 C.b 抗氧剂溶液 0.1%丁基化羟基甲苯〔BHT〕的正已烷溶液。 C.c 维生素D溶液 参比标准麦角钙化醇〔如样品标明维生素D2〕或胆钙化醇〔如标明含维生素D或D3〕。精确称取维生素D标准约12.5mg置于100ml棕色容量瓶中，不加热以甲苯溶解并定容。将此液10ml用流动相稀释至100ml，将此液25ml用甲苯-流动相(5+95)稀释至100ml，作为维生素D标准(3.125μg/ml，125IU/ml〕。每日新鲜制备。 C.d 系统适应性标准溶液 制备每克植物油中含维生素D3 2mg及反式维生素D3 0.2mg的溶液。反式维生素D3及维生素D3前身的峰必须具有同样的峰高。必要时，于90?温热油溶液45min以增加维生素D3前身的含量。于5?贮存溶液。 D 分析柱的系统适应性试验 将0.1g系统适应性标准溶液溶解于100ml甲苯-流动相(5+95)中。从中取200μl作色谱检查。测定维生素D3前身与反式维生素D3两峰的分辨率:R,2D/(B+C);式中，D,维生素D3前身与反式维生素D3最大峰之间的距离;B,维生素D3前身的峰宽;C,反式维生素D3的峰宽;若R大于等于1.0则柱子性能满意。 E 校正 化工原料,化学试剂,化玻仪器,食品添加剂，医疗辅料 通过进样阀向净化柱注入200μl维生素D标准溶液，并按“测定”项中测定维生素D在分析柱及净化柱上的保留时间及维生素D在分析柱上的峰高。维生素D在净化柱上的保留时间应在10,20min之间;必要时，可调整流动相中戊醇含量以达到上述情况。 F 样品制备 F.a 不皂化物从粉剂中分离 精确称取约50g奶粉置于皂化瓶中。加入100ml乙醇，25%的抗坏血酸钠溶液及25ml(w/w)KOH水溶液，在蒸气浴上回流45min，在流水下迅速冷却，用两份75ml水，两份25ml乙醇和两份100ml乙醚将液体转移至分液漏斗中。剧烈振摇30s，静置至两层澄清。将水相转移到第二个分液漏斗中，用25ml乙醇和10ml戊烷的混合液振摇。让其分层，将水相转移至第三个分液漏斗中，戊烷相移至第一个分液漏斗中，用两份10ml戊烷洗涤第二个分液漏斗，洗脱液并入第一个分液漏斗中，水相用100ml戊烷与25ml乙醇混合液振摇，戊烷相加到第一个分液漏斗中，用三份100ml新制备的3%KOH的10%乙醇溶液洗涤合并的戊烷提取液，剧烈振摇，然后每次用100ml水洗涤至洗液对酚酞呈中性。排尽最后几滴水，将4张9cm的滤纸剪成的纸条加至分液漏斗中并振摇。$$转移干燥了的戊烷提取液至500ml圆底烧瓶中，用戊烷洗涤分液漏斗及滤纸，加入1ml抗氧剂溶液在小于等于40?水浴上真空旋转蒸发至干，在流水下冷却，通氮气恢复常压，立即用2.0ml甲苯-流动相(5+95)溶解残留物。$$转移提取物至10ml圆底烧瓶中，用戊烷洗涤500ml圆底烧瓶。室温通氮气蒸发，立即用2ml甲苯-流动相(5+95)溶解残留物。用此液作为样品工作溶液以备注样。 F.b 不皂化物从液体牛奶中分离 精确称取约50g奶粉置于皂化瓶中。加入100ml乙醇，25%的抗坏血酸钠溶液及25ml(w/w)KOH水溶液，在蒸气浴上回流45min，在流水下迅速冷却，用两份75ml水，两份25ml乙醇和两份100ml乙醚将液体转移至分液漏斗中。剧烈振摇30s，静置至两层澄清。将水相转移到第二个分液漏斗中，用25ml乙醇和10ml戊烷的混合液振摇。让其分层，将水相转移至第三个分液漏斗中，戊烷相移至第一个分液漏斗中，用两份10ml戊烷洗涤第二个分液漏斗，洗脱液并入第一个分液漏斗中，水相用100ml戊烷与25ml乙醇混合液振摇，戊烷相加到第一个分液漏斗中，用三份100ml新制备的3%KOH的10%乙醇溶液洗涤合并的戊烷提取液，剧烈振摇，然后每次用100ml水洗涤至洗液对酚酞呈中性。排尽最后几滴水，将4张9cm的滤纸剪成的纸条加至分液漏斗中并振摇。$$转移干燥了的戊烷提取液至500ml圆底烧瓶中，用戊烷洗涤分液漏斗及滤纸，加入1ml抗氧剂溶液在小于等于40?水浴上真空旋转蒸发至干，在流水下冷却，通氮气恢复常压，立即用2.0ml甲苯-流动相(5+95)溶解残留物。$$转移提取物至10ml圆底烧瓶中，用戊烷洗涤500ml圆底烧瓶。室温通氮气蒸发，立即用2ml甲苯-流动相(5+95)溶解残留物。用此液作为样品工作溶液以备注样。 G 测定 G.a 净化 经进样阀向净化柱注入200μl工作样品溶液，调节检测器操作条件，以使维生素D在记录纸上的峰尽可能最大，收集维生素D峰前及峰后各2min之间的组分至10ml容量瓶中。加入1ml抗氧剂溶液并在氮气流下蒸干，立即用2ml甲苯-正已烷(5+95)溶解残留物，向分析柱注入此溶液。$$注:如需净化柱的再生，可用戊醇-正已烷(10+90)洗涤，流量为6ml/min，直至检测器响应回到零〔约15min〕。移动相的开关设到含0.35%戊醇的已烷流动相。净化柱可重新使用。 G.b 分析 经进样阀向分析柱注入500μl溶液(a)，调整检测器操作条件，使维生素D在记录纸上的峰化工原料,化学试剂,化玻仪器,食品添加剂，医疗辅料 尽可能最大。重复进样品及标准液以验证响应保持恒定。测量样品及外标溶液中维生素D的峰高。 G.c 计算 维生素D效价IU/g,(1.25×P×W’×V×40000)/(P’×W×V’)。式中，1.25,在皂化回流中生成的维生素D前身的校正因子。P及P’分别为样品中和参比标准中维生素D的峰高;W及W’分别为样品克数及参比标准品毫克数;V及V’分别为样品溶液总毫升数及参比标准溶液总毫升数;40 000,维生素D IU/参比标准mg。 液相色谱法，强化牛奶和奶粉中维生素D ----------------------------------?????------------------------------------- 昆明能振商贸有限公司供应/提供液相色谱法检测强化牛奶和奶粉中维生素D化学试剂及大批量的液相色谱法检测强化牛奶和奶粉中维生素D工业级/食品级/医药级原料或检验方法，天天为客户发货至:云南省内各州市，含昆明、曲靖、玉溪、昭通、楚雄、红河、文山、普洱、西双版纳、大理、保山、德宏、丽江、怒江、迪庆、临沧等辖下县级市(www.nengzhen.com.cn )。 化工原料,化学试剂,化玻仪器,食品添加剂，医疗辅料