山羊卵巢无腔卵泡卵母细胞的体外生长

山羊卵巢无腔卵泡卵母细胞的体外生长 第19卷第3期中国兽医 1999年5月ChineseJournalofVeterinaryScience Vol_19, May NO.3 1999 — 旦.墨苎(内蒙古农牧学院动物科学系,呼和浩特010018) 兰—至一一西北农业大学发育生物学研究室 摘要山羊卵巢无腔卵泡卵母细胞在以DMEM为基础,添加HEPES(20mmol/I),FCS(10),FSH(40 mg/I),次黄嘌呤(2mmol,L),异双丁酰环腺苷酸(2mmol/I,),IGF—I(50g/1),氢化可的橙(40/I)和 ITS(50/I)的培养液中得以存活井生长.在二维培养体系中,卵泡在体外的生长模式和体内有很大差别. 最显着的特征是卵泡不像在体内那样保持完整的立体结构一直到结束绝大部分卵泡不同程度地发生基膜 溶解和破裂,颗粒细胞向四周扩展并贴壁,形成单层.由于卵泡原有三维立体结构的破坏,易于导致卵母细胞 的迁移.在生长方式上以致个卵泡聚集生长对其卵母细胞的生长似 乎较为有利.卵泡卵母细胞在体外培养9 d,其直径可达150/tin以上,达到r成热时体积,存活率为53.实验证明, 山羊无腔卵泡卵母细胞在合适的 培养体系中,能在体外存活并生长,并能发育到成热时的大小 关键词山羊无腔卵泡卵母细胞体外生长 中圈分类号$827.36Q954.432 啮齿动物无腔卵泡卵母细胞的体外培养体系 已基本建立],并在小鼠获得了后代].但家畜 卵巢无腔卵泡卵母细胞的体外培养仍处于探索阶 段.对牛_9和猪[113的无腔卵泡卵母细胞的体外 培养研究表明,家畜无腔卵泡卵母细胞在体外条 件下也具有发育能力,但在山羊这方面研究尚属 空白.本研究采用二维培养法培养山羊卵巢无腔 卵泡卵母细胞,以期建立其体外发育的培养体系, 认识山羊卵泡卵母细胞的体外发育过程和规律, 为其体外成熟研究直至利用奠定基础. 1与方法 1.1无腔卵泡的分离卵泡取自当地60日龄前 沙能奶山羊卵巢.将卵巢切碎(1,2ram),置于 0.1胶原蛋白酶(type?SIGMA)和4OU/mL DNA酶(华美生物工程公司)混合消化液内,于 38.5C,5CO2,1OO湿度的培养箱内消化20--:- 25min.在消化的中途和结束,以直径略大于组织 块的玻璃吸管各悬浮2O次左右,再以DMEM 收稿日期:1998—09-l5 第1作者:局欢敏.男,1959年生,博士.剐教授 *农业郡生物技术重点项目(95牧-01—04—01) 3:1稀释后转入4C慢消化1O,15min,之后离 心(1000r/min)2,3次,洗去消化酶,再经网筛 (450脚)过滤后拣卵. 1.2无腔卵泡的选择将分离出来的各级卵泡 转移到含适量DMEM培养液的表面皿内.选择 正常完整的直径?150/urn,卵母细胞直径?9O m的卵泡(图1A),在DMEM培养液中洗涤2 , 3次,再转移到含新鲜培养液的表面皿内,置于 co培养箱内备用. 1.3无腔卵泡的培养 1.3.1培养液以DMEM为基础,添加不同的 培养成分:DMEM+20mmol/LHEPES+10 FCS+2mmol/L次黄嘌呤+2mmol/LdbcAMP +0.23mmol/L丙酮酸钠+40mg/LFSH+50 g/LITS+50ug/LIGF—I+40,ug/L氢化可的 松+75/L青霉素+5O/L链霉素 1.3.2二堆培养体系采用微滴法培养每个塑 料培养皿(3.5cm)铺5个微滴,每个微滴100 L.每个微滴接种5,1O枚卵泡,上盖矿物油后, 置于cO2培养箱内培养(38.5C,5%COz,100 湿度).于培养的第2天换新鲜培养液,每次换液 2/3,以后每隔3d换液1次. 1.4无腔卵泡的测量在卵泡培养之前,测定其 302中国兽医I999年 大小,此时作为卵泡生长的0时,其大小即为卵泡 的0时体积从培养的0时起,于培养的第3天和 第9天分别各测定1次,在相差显微镜下,卵泡两 端基膜外缘最大距离代表卵泡的直径,卵母细胞 两端最大距离为卵母细胞的直径,包括透明带. 1.5培养卵泡的鉴定正常发育的卵泡,其卵母 细胞呈圆形,位于卵泡的中央或略偏于一侧.胞质 均匀,色泽鲜明,具有健康的透明带,薄厚均匀一 致.颗粒细胞联系紧密,圆而光滑,不过早脱离卵 母细胞.凡卵母细胞变形,过暗或过淡,透明带严 重变形,颗粒细胞过早脱离均视为退化. 1.6统计分析试验数据经统计分析,作}检 验. 2结果 2.1山羊无腔卵泡的体外生长特征二维培养 条件下,无腔卵泡的体外生长和体内生长方式存 在很大差异.在培养的24h或48h内,卵泡的基 膜出现溶解,其特征表现为在卵泡的周边出现一 层透亮的晕圈,基膜变得薄而不清.随后,在卵泡 的边缘出现放射状结构,交织成不规则的网状(图 1B)卵泡行贴壁生长,颗粒细胞贴附到培养皿底 面.随着培养的延续,颗粒细胞向外周扩展.一般 情况下.大部分卵泡在培养24h内就出现了这种 现象,一少部分在48h内出现,个别卵泡可延迟 到72h.在实体镜下,卵泡呈丘状,并逐渐拉平. 颗粒细胞不断向四周扩展生长(图1C).最后,卵 母细胞由培养0时的隐蔽状态逐渐变得清晰,由 卵泡的中央移向边缘或上升到卵泡的顶部.部分 卵泡的卵母细胞游离出来(图1D).取这种生长方 式的卵泡均不能像体内那样保持卵泡的完整立体 结构和形态 卵泡在体外生长的另一特征是2个或2个以 上的卵泡常常在培养的24h内相互聚集在一起, 牯附成团状(图1E).取这种生长方式的卵泡能较 长时间地保持其结构的完整性,基膜消失和卵泡 颗粒细胞散开的现象出现得较晚.试验中发现,一 旦颗粒细胞散开,极易形成单层,具有很强的贴壁 生长能力培养后期,卵泡卵母细胞的生长方式类 似于体内,除了体积逐渐增加外,随着卵泡的生 长,卵母细胞渐渐移向卵泡内一侧.卵泡卵母细胞 图1山羊无腔卵泡卵母细胞的体外生长模式A.培养前卵泡卵母细 胞;B.卵泡基膜出现溶解现象;C.卵泡颗粒 细胞向周围扩展:n卵母细胞游离出卵泡之外;E.卵泡卵母细胞的聚 集生长;F.培养结束时的卵母细胞 第3期周欢敏等:山羊卵巢无腔卵泡卵母细胞的体外生长303 的这种行为在单个培养的卵泡中也常见. 2.2山羊无腔卵泡卵母细胞的体外生长在二 维培养条件下,在培养液环境中经9d的培养,卵 泡卵母细胞的直径可达150m以上,其培养结 果见表1 表1山羊无腔卵泡卵母细胞的体外生长姑果 3讨论 3.1关于无腔卵泡的生长模式在二维培养体 系中,山羊无腔卵泡在体外和体内的生长模式表 现迥异.最显着的特征是卵泡不像在体内那样保 持完整的立体结构一直到生长结束.尽管所选择 的卵泡均具有完整的基膜,但在培养过程中绝大 部分卵泡不同程度地发生基膜溶解或破裂,不能 保持原有形态,颗粒细胞向四周扩展并贴壁,形成 单层.这种模式在卵泡的二维培养体系中属常见 现象曾有报道称微滴法或常规培养(均属二维培 养)易于造成卵泡的塌陷.从本试验观察,山羊无 腔卵泡的这种现象的发生似乎更频繁 与体内所不同的是无腔卵泡被分离出来之 后.失去了周围的硬支撑环境,虽然卵泡尚有基膜 保护,暂时能保持其三维立体结构,但此时卵泡还 没有形成内膜和外膜,卵泡卵母细胞的透明带尚 未完全发育,卵泡几乎呈半流体状,极易变形,镜 下拣卵时就能观察到这种现象.所以在二维培养 时,卵泡与培养皿底面粘着后,必然会在底部形成 一 个大的接触平面,基膜撅易贴壁.在基膜溶解或 破裂后,颗粒细胞扩展,形成单层,似乎颗粒细胞 在行为上也尽力寻找附着物这种行为对卵泡三 维立体结构完整性的维持是极其不利的. 由于卵泡原有三维立体结构的破坏.易于导 致卵母细胞的迁移.卵母细胞的这种行为有3种 情况:(1)卵母细胞迁移至卵泡的顶部,但并不游 离出卵泡之外,卵母细胞的上表面仍有颗粒细胞 覆盖,其余部位依然能与其周围的颗粒细胞保持 接魁;(2)卵母细胞从卵泡的侧面渗出,在这种情 况下卵母细胞易于暴露于卵泡外面而使其部分或 全部裸露;(3)卵母细胞的底部与培养皿底面接 触.在培养过程中,虽然卵母细胞能与颗粒细胞保 持联系,卵母细胞也能生长,但在后期容易变扁而 不能保持其球形结构.试验中发现,第1种情况有 利于卵母细胞的生长.取这种生长方式,既能维持 卵母细胞的形态,又能与其周围颗粒细胞保持紧 密联系,而后者对卵母细胞生长是极为重要的. 试验发现,卵泡成簇培养时,在培养的初期数 个卵泡粘附在一起呈团状的生长模式,即使是多 个卵泡分散培养,也易于发生这种现象.取这种生 长方式,一般不会出现卵母细胞的过早裸露,因为 它不容易游离于卵泡之外,而且颗粒细胞也不会 过早地扩散.从理论上讲,这对卵泡及其卵母细胞 的生长和发育是有益的,保持了二者之间的缝隙 连接.这种生长方式是否类似于体内经腔期发育. 尚未证实.之所以强调经腔期发育是因为它在体 内生理状态下对卵母细胞成熟能力的获得是必要 的. 从本试验结果看,卵泡或单个或成团生长,以 卵泡基膜不过早溶解或消失,颗粒细胞不迅速扩 展而避免形成单层,卵母细胞在培养的中后期前 不迁移而过早地暴露于卵泡之外为宜.卵母细胞 在培养的后期,从卵泡的中央逐渐迁移至卵泡的 边缘是卵泡体外生长的特有表现.在某种程度上, 它类似于体内的发育行为.这可能有益于卵母细 胞的成熟 3.2关于卵泡细胞的体外存活预试验发现,在 培养液中添加IGF-I和氢化可的松后,卵泡的体 外存活时间延长,一直到培养的结束.在不含这2 种成分的培养液中,卵泡卵母细胞只能存活3d, 至多不超过7d,卵母细胞的直径增长也很慢. Roy等E报道在仓鼠腔前卵泡的体外培养时,不 管是否用促性腺激素处理,缺乏胰岛素都会导致 各期卵泡在24h内退化因此认为,胰岛素是卵 泡体外存活的必要成分,而氢化可的松能促使细 胞的牯着和增殖.在本研究中使用IGF—I取得了 相同的效果.试验中发现,FSH对卵泡的体外存 活能力来显示出明显的促进作用,在卵母细胞的 生长能力上,其影响也不是很大,尽管比不含 FSH组的增长幅度有所提高,但无明显差异.也 可能是由于未添加FSH组的血清中的促性腺激 素起了作用.但是添加嘌呤类物质以后,在培养的 24h甚至48h内,卵泡颗粒细胞问的联系显得更 加紧密,基膜的结构也相对完整些.这和Eppig 等的报道是一致的.然而对牛腔前卵泡的体外 304中国兽医1999正 培养表明,添加FSH可使其直径增长加快,颗粒tolivey~uagaftergrwth?maturation,andfertilizationin 细胞增多.虽然预试验结果未显示出FSH对?BioReprod,1989,41:, 卵泡作用的明显优势,但并不能因此就作出定论.caroIIWoMJ,etaL… 也许是添加了IGF—I和氢化可的松之后,促进了ryfollicIJRepodFer【1lw9o.90:32l~327 卵泡对FSH应答反应才使卵泡得以存活并生 长.6KiIShhC,GldGSAiediffe…h 实际上,这一作用在试验中得到了证实_l.Lisatwainhalltsterand?intheaffectofeostrogensongrowthof 等7也认为,胰岛素对大鼠所有各级卵泡的存活gPaic一Jepr.’t..,:17.,185 是必要的还能提高生长卵泡对FSH的应答反I.isaC,ShillsC, . f , ollicu!oge .n: 应.同样有报道称胰岛素对卵泡最初的存活是必 8EpzJJ0rBrMJI.p.t….m. 要的,但只有胰岛素不足以维持健康卵胞,还需要.yf.pnmordiIfolliI.]3i.IRepfod,199854:177 其他因子的联合作用,胰岛素样生长因子也具有,m 同样的作用El6].在山羊无腔卵泡的体外培养中 也.nckF,Mermi”odPtMassiPtat.Chterimt10n 可能具有同样的作用机制.”mg..b0”‘raA呐y 3t3关于卵母细胞的体外生长本试验结果表l0Fig’u.R.sh0fscJ,dHfkR, 明,在培养到第9天,卵母细胞的平均直径增长到Preservario…focy 吣ndgran11lorphologyi 15330m,该体积超过了山羊卵巢卵泡组织学 bovinepreantralfolliclesculturedinvitro.Therlogenology. 形态观察值(125m左右)2173.后者是经固定处1994,1:】333,13 理后的测值.即使活体测量也因研究者的不同而nHi肿YNT’K曲.M砷小ndm 异,许多测值不包括透明带厚度,而且在液体环境12u Ro rationof ,絮.JRe.prod.::: 中测量往往有一定误差.本试验发现,卵母细胞的Frothndcliff咖tion ?fhp懈Ifotliin 直径最大可达180?.综合考虑上述若干因 素,longrmeultur~.JReprodFertil1989.87;103~144 本试验中卵母细胞的生长体积属于正常范 围.13EppigJJtDD…SMTheeffectofh~poxanthhaeogl coocytegrowthanddevelopmentin?maintemnee 参考文献ofmeiotic?tandgorindotrot’An-inducedoocytetrlat~uI— don.DevB[ol,1989,119{313~321 1RyteM.Thegrowthofuseovarianfolliclesofdif一 14HulshofSCf,F[gueiredoJRtBeckersfF,a1.Effectsof ferentsisinrespottsetopurifiedgoratdotropi~JReprodfetalbovines~[umtFSHand17~eostradiolonthecultureof Fertil.1978.30398~405bovineprea~tra]follicles.Tbo~ogenoJogyt1995t447, 2EppigJJ.Mouseoocytedevelopmentinmwithvarious228 culturesystem.IvBid,1977.60:371~38815HirshfietdAN.DevelopmentoffoLlictesinmammaliano一 3CantpariR.Palomh[F.RaminucetM.Earlyprogrammingofvary?lntlRevCytol,1991124:43~101 maturationcompetenceinseooeytegrowth.DevBio1.18GuideceLCI~ulin—likegrowthfactorsandovat’~nfoLLicu一 1984.102:519~524lardevelopment.Endc~rRevt1992t13:641~689 4EppizfJ,SchroederAC.c砷achyofmous~oocytesfrom17谭景和t孙青 原,扬增明t等-山羊卵母细胞发育的超散结构 preantralfolliclestoundergoemhryogeneshanddeveLopment研究?解剖 t1992,23(1):1O6,110 GrowthofHircine0varianNon—antralFollicle0ocytesinvitro ZhouHuanmin(FacultynfAnimalScience.InnerMmlgloliaInstitutenfAgricultureand AnimalHusbandry,Hohhot010018) ZhangYong(DepartmentnfDevelopmentalBiologytNorthwestAgriculturalUniver~ty) AbstractThehircineDon—antralfollicleoocyteswereprovedinthepresentexperimenttosurviveandgrowin DMEMsupplementedwithHEPES(20mmoL/L),FCS(10),FSH(40mg/I)hypoxanthine(2mmol/I)tdbcAMP (2mmol/I),IGF一 1(50vg/I)hydrocortisone(40/~g/I)andITS(50g/I).Inatwo—dimensionalcult uresystem,the int~trogrowthpatternofthefolliclesinaheapseemedtobeofbenefittotheoocytes.Afterthefollicleooeyteswere culturedinvitrofor9daystheoocyteshadgrownuptobeoverl50btrnindiameter,reachingthematurationsizewith thesurvivalrateof53.Theexperimentdemostratedthatthehircinenon—antr a[follicleoocytesmaysurviveandgrow in”itroinasuitablecuhuresystemuptotheirmaturationsize. Keywordshircine;nonantralfollicle;oocyte;in,growth