银杏内酯B对胆固醇和载脂蛋白E4损伤海马神经元胆固醇代谢的影响

银杏内酯B对胆固醇和载脂蛋白E4损伤海马神经元胆固醇代谢的影响 word格式论文 银杏内酯B对胆固醇和载脂蛋白E4损 伤海马神经元胆固醇代谢的影响 作者,姜希娟 郭茂娟 苏金玲 薛洁 张瑞峰 马轶文 王强 范英昌 【摘要】 目的 探讨银杏内酯B对高胆固醇和载脂蛋白E4(ApoE4)损伤海马神经元胆固醇代谢的影响。方法 应用40 μg/ml胆固醇和30 μg/ml ApoE4联合处理海马神经元,模拟高胆固醇细胞损伤模型。银杏内酯B对此模型进行干预后,经实时定量聚合酶链反应(RT PCR)的方法分别测定低密度脂蛋白受体蛋白(LRP)1 mRNA、三磷酸腺苷结合盒转子A(ABCA) mRNA和内质网乙酰胆固醇酰基转移酶(ACAT) mRNA的表达,采用蛋白印迹法分别检测LRP1、ABCA1和ACAT1蛋白的表达。结果 模型组上调LRP1 mRNA 表达,对ABCA1和ACAT1 mRNA的表达有上调趋势,但是与对照组相比无显著差异。银杏内酯B可以有效上调ACAT1 mRNA 的表达,与模型组相比差异显著。上述因子蛋白的表达与mRNA表达趋势相一致,而且模型组与各组相比均有显著差异。结论 胆固醇和ApoE4联合作用影响神经元胆固醇的摄入、细胞内胆固醇转化和胆固 word格式论文 醇的排出。银杏内酯B对高胆固醇环境下神经元胆固醇代谢有一定的调节作用。 【关键词】 胆固醇;银杏内酯B;低密度脂蛋白受体相关蛋白1;ATP结合盒转运蛋白1;脂酰 胆固醇酰基转移酶1 大量研究表明脑胆固醇代谢异常在阿尔茨海默病(AD)发病过程中发挥重要作用,特别在载脂蛋白E4(ApoE4)亚型占优势的人群,这一作用尤为突出〔1〕。由于血脑屏障的存在,脑胆固醇代谢主要在局部进行,受外周胆固醇水平影响甚小,而AD发病的主要部位集中在海马组织。因此,直接观察胆固醇与ApoE4协同作用下,海马神经元胆固醇如何代谢有着重要意义。海马神经元胆固醇的水平主要依赖于胆固醇摄入、细胞内转化和逆向转运是否平衡;上述过程关键酶的变化是影响胆固醇代谢的重要因素。银杏内酯B是银杏叶的主要成分,具有明确降低外周胆固醇作用,同时也是防治AD的常用药物,但是其防治AD的机制是否与调节海马神经元胆固醇代谢有关尚不清楚〔2〕。因此,本文拟观察高胆固醇和ApoE4联合作用下,离体观察海马神经元局部胆固醇代谢相关关键酶的变化以及银杏内酯B对其是否具有调节作用,阐明银杏内酯B防治AD的分子机制。 1 材料与方法 word格式论文 1.1 药品与试剂 银杏内酯B,分子式C20H24O10,天津中一药厂从银杏叶中提取(纯度90%以上)。DMEM/F12培养基,B27、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)(Invitrogen),多聚 L 赖氨酸、Penicillin Streptomycin(Sigma),Power SYBR Green RT PCR Reagents Kit 试剂盒(Applied biosystems),内质网乙酰胆固醇酰基转移酶(ACAT)1一抗sc 21029、ABCA1一抗Sc 5490、低密度脂蛋白受体蛋白(LRP)1一抗sc 18823、相应二抗(Santa Cruz),其余试剂均为市售分析纯。 1.2 实验动物 18KW 新生24 h内SD大鼠,体重约10 g,由天津药物研究院实验动物中心提供。 1.3 其他实验材料 CO2培养箱(SANYO),超净化工作台(HITACHI),IX 70型倒置显微镜(Olympus),ABI7300实时定量聚合酶链反应(RT PCR)仪等。 1.4 海马神经元原代培养与鉴定 新生24 h SD大鼠,无菌条件下取脑,剔除脑膜和血管,分离出双侧海马,置于D Hanks中清洗2遍。经眼科剪充分剪碎 word格式论文 后,用尖端已被火焰抛光的弯头吸管充分吹打后过75 μm 组织筛网,将滤过液移入离心管中1 000 r/min离心10 min。弃上清,用含2% B27,20 μg/L bFGF 添加剂和1%双抗的DMEM/F12 重悬沉淀后计数,以5×105/cm的密度种植于事先用L 多聚赖氨酸包被的培养板。24 h后全量换液,以后每3 d半量换液。采用神经元特异性烯醇化酶免疫荧光法进行鉴定。 1.5 药物剂量的确定 银杏内酯B剂量的确定采用噻唑蓝(MTT)比色法。选择最高吸光度药物浓度160 μg/ml作为实验剂量。 1.6 分组与给药 采用无血清培养基培养海马神经元至4 d,弃掉无血清培养基,依据 文献 〔3〕加入含40 μg/ml胆固醇和30 μg/ml ApoE4的无血清培养基作用24 h,作为模型组;始终采用无血清培养基培养的,不做任何处理的作为对照组;正常无血清培养基培养至3 d,加入160 μg/ml银杏内酯B作用16 h后,于第4天再加入含40 μg/ml胆固醇和30 μg/ml ApoE4的无血清培养基继续作用24 h,作为银杏内酯B组。共三组,每组6只大鼠。 1.7 RT PCR测定胆固醇代谢相关基因的表达 采用Trizol试剂提取神经元总RNA。依试剂盒说明书,采用TaqMan Reverse Transcription Reagents 试剂盒(Applied Biosystems)和oligod(T)16 引物将总RNA(0.2 μg)反转录为 word格式论文 cDNA(10 μl体系)。0.5 μl的cDNA产物用作定量PCR扩增的模板。PCR扩增反应采用SYBR Green PCR Master Mix reagent kits试剂盒和特异性引物,见表1,看家基因GAPDH作为内参。数据采用2-ΔΔCT相对定量法〔4〕分析。表1 看家基因和待测基因特异性引物序列 1.8 Western印迹法测定ACAT1,ABCA1和LRP1蛋白的表达 细胞蛋白裂解液加上样缓冲液(1?4),沸水浴5 min,采用十二烷基硫酸钠 变性聚丙烯酰胺凝胶不连续缓冲系统,先后配制12%的分离胶和3%积层胶;取蛋白样品各10 μl经上样缓冲液处理后上样,电泳120 V,约1 h,在转移缓冲液中进行电转移至硝酸纤维素膜(NC膜)上;将NC膜在丽春红染液中染色2 min,观察电泳及转移效果;转移后放入含有0.5% Tween220的磷酸盐缓冲液(PBST)中洗膜5 min,封入含有5%牛血清白蛋白(BSA)封闭液的塑料袋中,37?缓慢摇动1 h,PBST洗膜;将膜封入塑料袋中,加入兔抗人Survivin单抗(1?200 稀释),4?过夜;加入羊抗兔二抗(1?500 稀释),在ECL 反应物中反应2 min后,压X2线片,5,10 min之后显影定影。应用增强化学发光法(ECL)显色发光系统,若有显色带出现为阳性;若无显色带出现为阴性。山羊ACAT一抗sc 21029,50 kD;山羊ABCA1一抗Sc 5490,202 kD;山羊LRP1一抗sc 18823,160 kD;二抗,HRP标记的小鼠抗羊IgG,sc 2354。 1.9 统计学处理 采用SPSS10.0软件包进行,数据以x?s表示,显著 word格式论文 性差异采用单因素方差分析。 2 结 果 2.1 银杏内酯B对海马神经元损伤模型LRP1、ACAT1和ABCA1 mRNA表达的影响 模型组下调LRP1 mRNA表达,与对照组相比差异显著(P0.01);银杏内酯B可以有效提高LRP1 mRNA表达,与模型组差异显著(P0.01)。各组间ABCA1差异不显著(P0.05),但是呈现上升趋势。模型组ACAT1 mRNA与对照组相比有上升趋势,但是差异不显著性(P0.05);银杏内酯B上调ACAT1 mRNA的表达,与模型组相比差异显著(P0.01),见表2。 2.2 银杏内酯B对海马神经元损伤模型LRP1、ACAT1和ABCA1蛋白表达的影响 胆固醇在ApoE4环境下,下调神经元LRP1蛋白的表达,与对照组相比有显著性(P0.01);银杏内酯B上调LRP1蛋白的表达,与模型组相比有显著差异(P0.05)。胆固醇在ApoE4环境下,下调神经元LRP1蛋白的表达,与对照组相比有显著性意义(P0.05);银杏内酯B上调LRP1蛋白的表达,与模型组相比有显著性差异(P0.05)。胆固醇在ApoE4环境下,下调神经元LRP1蛋白的表达,与对照组相比有显著性意义(P0.01);银杏内酯B上调LRP1蛋白的表达,与模型 word格式论文 组相比有显著性差异(P0.01),见图1,表3。表2 银杏内酯B对损伤海马神经元LRP1、ACAT1、ABCA1 mRNA表达的影响表3 银杏内酯B对海马神经元损伤模型LRP1、ACAT1和ABCA1 蛋白表达的影响 3 讨 论 长期以来,人们对脂类代谢的研究多局限于非神经元的体循环系统,对于脑内胆固醇代谢了解甚少。近20年来,由于发现很多中枢疾患,特别是AD与脑内胆固醇水平异常有关〔5〕,对脑胆固醇代谢进行大量研究。结果发现脑组织胆固醇的代谢与其他组织之间存在很大差异,脑内胆固醇含量极高,大多存在于特化的髓鞘膜中,由于髓鞘更新率极低,实际上其相关胆固醇基本固定不变。另外少量的胆固醇存在于神经元、神经胶质细胞和细胞外脂蛋白,这一部分胆固醇代谢速度比较快,其中,尤以海马神经元最为明显〔6,7〕。因此,认为这一小部分胆固醇参与了中枢内胆固醇的平衡调节。由于血 脑脊液屏障(BBB)的存在,通常认为脑内胆固醇主要源于原位自身合成,不受外周胆固醇影响〔8〕。脑内胆固醇主要由星形胶质细胞合成,由ApoE经LRP1转运给神经元,本实验通过RT PCR发现高胆固醇环境下LRP表达降低。神经元在高胆固醇环境下如何变化的 文献 未曾发现,有关LRP1的研究主要集中在动脉粥样硬化过程中巨噬细胞向泡沫细胞的转化。相关研究认为高胆固醇上调LRP1表达,从而促进巨噬细胞吞噬脂质而形成泡沫细胞〔9〕,与本研究在神经元的研究结果正好相反, word格式论文 其原因可能为,神经元并非吞噬细胞,因此高胆固醇对其不是正向刺激,存在饱和现象,高胆固醇环境下造成细胞内胆固醇升高,而出现负反馈使得LRP1下调。银杏内酯B与模型组相比可以在基因和蛋白水平上上调LRP1表达,可能是细胞内胆固醇水平降低,而致负反馈减轻所致,其深入机制尚待进一步研究。 胆固醇一旦进入神经元,一部分在神经元内经ACAT1将游离胆固醇酯化,ACAT1是调节细胞内胆固醇代谢和分布的关键成分,另外一部分胆固醇经ABCA1排出细胞外,ABCA1是脑组织胆固醇逆向转运(RCT)的关键酶。上述任何一个环节出现障碍都会造成神经元胆固醇水平和分布改变〔10,11〕。本实验发现高胆固醇环境下,上述两种关键酶都存在上升趋势,说明存在负反馈,通过加速细胞内胆固醇转化和逆向转运而对细胞内胆固醇水平进行调整。本研究发现银杏内酯B可以在蛋白水平上调ABCA1的表达,在基因和蛋白水平上均能上调ACAT1的表达,说明银杏内酯B可以有效促进胆固醇的细胞内转化和逆向转运,从而达到降低细胞内胆固醇含量的目的,其降细胞内胆固醇的作用与胆固醇摄入关系不大。 【 参考 文献】 1 Xiong H,Callaghan D,Jones A,et al.Cholesterol retention in AlzhEimer′s brain is responsible for high beta and gamma secretase activities and Abeta production〔J〕.Neurobiol Dis,2008;29(3):422 37. word格式论文 2 Ivetic V,Popovic M,Naumovic N,et al.The effect of Ginkgo biloba (EGb 761) on epileptic activity in rabbits〔J〕.Molecules,2008;13(10):2509 20. 3 Clark CM,Karlawish JH.AlzhEImer disease,current concepts and emerging diagnostic and therapeutic strategies〔J〕.Ann Intern Med, 2003;138(15):400 10. 4 Roses A.Apolipoprotein E alleles as risk factors in Alzheimer′s disease〔J〕.Ann Rev Med,1996;47:387 400. 5 Anstey KJ,Lipnicki DM,Low LF.Cholesterol as a risk factor for dementia and cognitive decline,a systematic review of prospective studies with meta analysis〔J〕.Am J Geriatr Psychiatry,2008;16(5):343 54. 6 Livak KJ,Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using real time quantitative PCR and the 2 ΔΔCT method〔J〕.Methods, 2001;25,402 8. 7 Puglielli L,Tanzi RE,Kovacs DM.Alzheimer′s disease,the cholesterol connection〔J〕.Nat neurosci,2003;6(4):345 51. word格式论文 8 Lütjohann D.Cholesterol metabolism in the brain,importance of 24S hydroxylation〔J〕.Acta Neurol Scand Suppl,2006;185:33 42. 9 熊 鸣,毕勇毅,张德玲,等.阿魏酸钠对高脂血症致动脉粥样硬化过程 中胆固醇和甘油三酯代谢的影响〔J〕. 中国 病理生理杂志,2008;24(9):1670 5. 10 Eckert GP,Vardanian L,Rebeck GW,et al.Regulation of central nervous system cholesterol homeostasis by the liver X receptor agonist TO 901317〔J〕.Neurosci Lett,2007;423(1):47 52. 11 Huttunen HJ,Kovacs DM.ACAT as a drug target for Alzheimer′ s disease〔J〕.Neurodegener Dis,2008;5(3 4):212 4.