Wnt3a在小鼠孤雌胚胎及正常胚胎早期着床部位的表达变化

Wnt3a在小鼠孤雌胚胎及正常胚胎早期着床部位的表达变化 Wnt3a在小鼠孤雌胚胎及正常胚胎早期着 床部位的表达变化 2010年12月 第18卷第6期 中国实验动物学报 ACTALABORAT0RIUMANIMALISSCIENTIASINICA December2010 Vo1.18No.6 Wnt3a在小鼠孤雌胚胎及正常胚胎早期 着床部位的表达变化 王灏,李贺娟,尹燕云,陈利平,刘云海,郭勇,倪和民 (北京农学院动物科学技术学院,北京102206) 【摘要】目的研究小鼠孤雌激活胚胎和体内正常发育胚胎在子宫中发生着床过程时,在早期着床部位上 Wnt3a信号分子的表达变化.方法运用免疫组织化学染色法比较受体子宫中的孤雌胚胎着床位点和体内正常 发育胚胎着床位点上Wnt3a的表达状况.结果免疫组织化学染色结果发现:(1)在着床期怀孕第5.5天和6.5 天,受体子宫中孤雌胚胎的着床位点处和体内正常发育胚胎的着床位点处,Wnt3a在两种子宫上的表达情况相似, 而在两种胚胎上的表达情况不同;(2)Wnt3a信号在空怀假孕母鼠子 宫上表达情况与相同怀孕期有正常胚胎着床 的子宫上的表达情况相似.结论胚胎着床与否及胚胎正常与否均不 影响Wnt3a在小鼠早期着床期子宫上的表 达,但在怀孕第5.5天和6.5天时孤雌激活胚胎和体内正常发育胚胎 上Wnt3a的表达有差异. 【关键词】小鼠;孤雌激活胚胎;正常胚胎;着床位点;Wnt3a;免疫组织 化学染色 【中图分类号】R321—33【文献标识码】A【文章编号】 10054847(2010)06-0503-03 Doi:10.3969/j.issn.1005—4847.2010.06.012 Expression0fWnt3aattheEarlyImplantationSites ofbothMouseParthenogeneticandNormalEmbryos WANGHao,LIHe-juan,YINYah—yun,CHENLi—ping, LIUYun—hai,GUOYong,NIHe—min (CollegeofAnimalScienceandTechnology,BeijingUniversityofAgricultur e,Beijing102206,China) 【Abstract】 0bjectiveThisstudywasaimedtoinvestigatetheexpressionofWnt3aattheearly implantationsites ofbothmousepanhenogeneticandnormalinvivoembryos.MethodsInthisst udy,theearlyimplantationsitesofroutine parthenogeneticandthenormalinvivoembryoswerefixedbyparaformaldehydeandimmunohistoehemicallystainedto observeandanalyzetheexpressionofWnt3aatthosesites.ResultsTheresultswereshownasfollowing:(1)During earlyimplantation(day5.5andday6.5afterpregnancy),theexpressionofWnt3aintheuterusfromtheearly implantationsitesofmurineparthenogeneticandnorinalinvivoembryoswasunderahomoplasticcondition,butits expressiononbothtypesofembryoswasdifferent.(2)Intheuterusofpseudopregnantones,theexpressionofWnt3awas alsosimilartothatinthenormalcontrolones.ConelusionsItcanbeconcludedtllatthereiSnodifferenceofthe expressionofWnt3aatearlyimplantationsitesintheuterusfrombothmurineparthenogeneticandnormalinvivoembryos, buttherearesomedifferencesintheparthen0geneticandnormalinvivoembryosontheday5.5and6.5ofpregnancy. 【Keywords】 Mouse;Parthenogeneticembryo;Normalembryo;Implantationsite;Wnt3a; 动物孤雌生殖是指由雌性生殖细胞发育为完整 个体的过程.对于小鼠来说,卵母细胞可以在没有 staining 精子受精的情况下被人工诱导而启动胚胎发育,但 小鼠的孤雌胚胎都会在胚龄第1O天前死亡D,23. [基金项目】2009年度北京市自然基金重点项目”胚胎滋养层干细胞的功能性分析”(项目批准号:5091002);国家”十一五”863计期重 点项目”家畜卵泡高效诱导发育技术研究与应用”(项目批准号:2008AA101003);国家”十一五科技支撵”项目”肉羊高效育种关键技术 的研究与应用”(项目批准号:2008BADB2B04-4). [作者简介]王灏(1986一),男,硕士生,研究方向:动物产科及胚胎.E—mail:haohao0305@yahoo.com.cn. 李贺娟(1982一),女,硕士,研究方向:动物产科及胚胎工程,E—mail:lihejuan918@163.corn(共同第一作者). [通讯作者】倪和民,男,副教授,研究方向:动物产科及胚胎工程.E-mail:nihemin@yahoo.com.ca 504中国实验动物学报2010年l2月第l8卷第6期ActsLabAnitaSeiSin,December,2010,Vo1.18?No?6 对于小鼠孤雌胚胎无法发育到出生,一些学者认为 是基因印记的结果,并通过实验给出了证明.如 Kono等通过对小鼠卵母细胞印记基因的修饰, 将孤雌胚胎的发育能力提高到13.5及17.5d,最终 获得了世界上第一只成活的孤雌小鼠;但未经印 记基因修饰的孤雌胚胎即使发育到囊胚,其经过胚 胎移植后的着床率仍非常低,说明孤雌胚胎在着床 过程中存在某些缺陷.为了验证Wnt3a在小鼠孤 雌胚胎与正常胚胎早期着床组织上的表达变化,本 实验运用免疫组织化学染色法,定性检测了在着床 期怀孕第5.5天和6.5天时,两种小鼠胚胎早期着 床部位上Wnt3a的表达情况,为进一步探寻影响孤 雌胚胎着床能力偏低的原因奠定基础. 1材料与方法 1.1实验动物 本实验选用8,12周龄性成熟,体质量为28g 左右的ICR系雌性小鼠20只,购自北京维通利华实 验动物科技有限公司【SCXK(京)2002-2003】. 1.2实验试剂与器材 兔抗鼠Wnt3a多克隆抗体,购自Abcam公司, 货号:ab28472;抗体稀释液,生物素化羊抗兔IgG即 用型SABC试剂盒,3,3-二氧基联苯胺(DAB)显色 试剂盒购自武汉市博士德生物工程公司.倒置显微 镜:Olympus公司,BX51;普通光学显微镜:Nikon, YS2.H;石蜡切片机:上海莱卡仪器有限公司,Leica RM2126RT. 1.3实验方法 1.3.1卵母细胞获得:选择阴门淡粉色的雌鼠,腹 腔注射PMSG每只10Iu,48h后注射hCG每只10 IU.于hCG注射18h后,颈椎脱臼法处死,无菌情 况下取出输卵管.以HEPES—TL为体外操作液,在 实体显微镜下撕开输卵管膨大部得到卵丘卵母细胞 复合体(COCs).将COCs移入0.1%的透明质酸酶 中处理1,2min,脱去卵丘细胞,迅速在HEPES-TL 中洗三遍,备用.此时记为0.5d. 1.3.-孤雌激活:将卵母细胞移入7%的乙醇激活 液中,激活7min后迅速将卵母细胞移出,在HEPES. TL中洗3遍.然后在含2mmol/L6-DMAP的CZB 培养液中洗三遍后,移入30L的含2mmol/L6- DMAP的CZB培养液滴中,放人37?,5%CO培 养箱中继续激活3h.将卵母细胞移出,在CZB培 养液中洗三遍,移入CZB培养液滴,放入培养箱中 培养;48h换半液. 1.3.3受体准备:将雌鼠与结扎公鼠合笼,次日见 栓者分笼喂养,记为0.5d. 1.3.4孤雌胚胎移植:将培养4.5d的孤雌胚胎从 培养箱移出,挑选出形态正常的孤雌桑椹胚和早期 囊胚,移人含10%胎牛血清的HEPES—TL体外操作 液中,移植入3.5d的假孕受体雌鼠子宫中. 1.3.5孤雌胚胎着床点的获得:在受体妊娠至5.5 d和6.5d时,尾静脉注射芝加哥蓝(每只0.1mL), 5min后颈椎脱臼法处死小鼠,剖检得到有着床点 的受体子宫,将子宫在4%的多聚甲醛溶液中固定 48h. 1.3.6正常体内发育胚胎着床点的获得:将雌鼠与 正常公鼠合笼,次日见栓者分笼喂养,记为0.5d. 在第5.5天和6.5天时,尾静脉注射芝加哥蓝,5 min后颈椎脱臼法处死小鼠,剖检得到有着床点的 子宫,将子宫在4%的多聚甲醛溶液中固定. 1.3.7空怀子宫的获得:将雌鼠与输精管结扎公鼠 合笼,次13见栓者分笼喂养,记为0.5d.在第5.5 天和6.5天时颈椎脱臼法处死小鼠,得到空怀子宫, 将子宫在4%的多聚甲醛溶液中固定. 1.3.8孤雌胚胎着床点与正常体内发育胚胎着床 点的免疫组化检测:取出固定的有孤雌胚胎着床点 与正常体内发育胚胎着床点的子宫,切下有着床点 的子宫部分,按常规方法石蜡包埋,切片后做免疫组 织化学检测.免疫组化SABC法操作程序参考林 自力等的方法. 2结果 2.1孤雌胚胎移植着床情况 移植的12只受体中,10只有着床位点 (83.3%).移植的256枚孤雌胚胎均为桑椹胚或 囊胚,其中A级胚胎为106枚.10只怀孕受体子宫 中的着床点总数是4O个,占移植的106枚A级胚胎 总数的37.7%,占总移植数的15.6%. 2.2免疫组化检测结果 免疫组化检测结果见图1.棕色为Wnt3a信号 的表达位点,浅蓝色为苏木精复染的细胞核位点. 怀孕第5.5天时,正常胚胎和孤雌胚胎着床位点的 子宫内膜都发生了蜕膜化(图1A,C);正常胚胎着 床位点的子宫上,Wnt3a在子宫内膜基质和子宫腺 体上都有表达,在环层肌上没有表达,在胚胎周围的 子宫内膜基质上没有Wnt3a的表达(图1A,B);在 孤雌胚胎着床位点的子宫上,Wnt3a在子宫内膜基 质和子宫腺体上都有表达,在环肌层上没有表达 (图1C).另外,可以清楚地观察到正常胚胎和孤 雌胚胎上Wnt3a的表达不同:在正常的体内发育第 5.5天的胚胎上,wnt3a的表达定位于整个胚胎;而 中国实验动物学报2010年12月第18卷第6期 ActsLabAnimSciSin,December,2010,Vo1.18.No.6505 此时的孤雌胚胎上Wnt3a不表达(图1B,D).在怀 孕第6.5天时,正常胚胎着床点的子宫上,Wnt3a在 靠近胚胎周围的子宫内膜基质上不表达,在外侧子 宫基质和子宫腺体上有表达,在环层肌上没有表达 (图1E,F);此时孤雌胚胎着床点的子宫上,Wnt3a 在胚胎周围的子宫内膜基质上不表达,在外侧的子 宫内膜和子宫腺体上有表达,在环层肌上不表达 (图1G,H).另外,可以清楚的观察到此时正常胚胎 上有Wnt3a的表达,孤雌胚上Wnt3a出现表达(图 lF,H).在第5.5天,6.5天没有着床胚胎存在的空 怀小鼠子宫中,子宫上仍然有Wnt3a的表达:在空怀 第5.5天时,Wnt3a在整个子宫基质和子宫腺体上都 有表达,在环层肌上没有表达(图1I,J);在空怀第 6.5天时,Wnt3a在靠近子宫腔上皮的基质上没有表 达,在靠近外侧的子宫基质和子宫腺体上有表达,在 环层肌上没有表达(图1K,L).图1见彩插13. 3讨论 Xie等证明Wnt/~-catenin信号通路对胚胎 从1-细胞发育到囊胚没有明显作用,但对于胚胎着 床有重要作用;对经典的Wnt/~一catenin信号通路的 抑制不会影响子宫的接受性,影响的是胚胎的着床 能力;Wnt3a可以激活胚胎滋养层核内8.catenin通 路,诱导滋养层分化.Mohamed等叫证明在子宫上 的Wnt/~-catenin信号通路影响着胚胎着床.总之, Wnt/~一catenin信号通路在胚胎着床过程中胚胎与 子宫的对话中扮演着重要角色,但其具体的分子机 制还不清楚.Kemp等运用实时反转录PCR检 测了主要的Wnt蛋白家族成员在小鼠囊胚及着床 后期部位的表达量,发现Wnt3a在胚胎发育的所有 阶段都表达.其中Wnt3a在囊胚期高表达,而在着 床期第5.5天和第6.5天时低表达,这与本实验体 内发育着床胚胎实验组的检测结果有差异,估计是 mRNA水平与蛋白表达水平之间的差异造成的. 在前期实验中我们观察到,体外培养的小鼠孤 雌胚胎的发育慢于体内正常胚胎的发育,即孤雌胚 胎体外培养到4.5d时才能发育到早期囊胚,而体 内发育的正常胚胎在第3.5天时已经成为早期囊 胚.为了尽量保证两种胚胎发育的一致性,本实验 中将体外培养到4.5d的早期孤雌囊胚移植到假孕 3.5d的受体子宫中,以受体假孕天数获取子 宫.结果表明,正常着床的小鼠胚胎在着床期5.5d 时,Wnt3a的表达定位于整个胚胎,在着床期6.5d 时,Wnt3a有表达;孤雌小鼠胚胎在着床期5.5d 时,Wnt3a没有表达,在着床期6.5d出现表达.这 种结果说明小鼠正常胚胎和孤雌胚胎在着床的窗口 期,Wnt3a的表达不同.导致这种现象可能是由于 孤雌胚胎的发育较正常胚胎迟缓,Wnt3a的表达也 晚于正常胚胎.但同时还可以观察到,没有正常 Wnt3a表达的孤雌胚胎也可以发生着床过程. Wnt3a的表达变化,是否会影响胚胎激活而导致孤 雌胚胎着床能力下降,并进而影响孤雌胚胎着床后 的正常发育而导致发育潜力下降等问题仍有待于进 一 步研究.对于子宫的观察发现,在怀孕第5.5天和 6.5天时,正常小鼠胚胎着床点处和孤雌胚胎着床点 处的子宫上,Wnt3a表达情况相似.对空怀小鼠第 5.5天,6.5天子宫上的Wnt3a的表达检测结果表明: 空怀子宫第5.5天和6.5天时的子宫内膜和子宫腺 体上Wnt3a的表达情况与有正常胚胎着床的子宫中 的情况相似,表明Wnt3a在子宫中的表达可能受子宫 自身调控.子宫上Wnt3a的表达到底与胚胎着床有 什么样的关系,还有待于进一步研究. (本文图1见彩插l3.) 参考文献 [1]SuraniMAH,Ba~onSC.Developmentofgynogeneticeggsinthe mouse:Implicationsforparthenogeneticembryos[J].Science, 1983,222:1034—1036. [2]SuraniMA,KotharyR,AllenND,eta1.Genomeimprintingand developmentinthemouse[J].Development,1990,89—98. [3]KonoT,ObamY,YoshimzuT,eta1.Epigenetiemodifications duringoocytegrowthcorrelateswithextendedparthenogenetic developmentinthemouse[J].NatGenet,1996,13:91—94. [4]KonoT,SotomaruY,Ka~uzawaY,cta1.Mouse parthenogeneticembryoswithmonoallelicH19expressioncan developtoday17.5ofgestation[J].DevBio1.,2002,243:294 — 300. [5]KonoT,ObataY,WuQ,cta1.Birthofparthenogeneticmice thatcandeveloptoadulthood[J].Nature,2004,428:860— 864. 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A-D:TheexpressionofWnt3aatimplantationsitesofparthenogeneticandnormalembryosinvivoonday5.5afterpregnancy.E-H:The expressionofWnt3aatimplantationsitesofparthenogeneticandnormalembryosinvivoonday6.5afterpregnancy.I-L:Theexpression ofWnt3ainuterusonday5.5andday6.5afterpseudopregnancy.em,embryo;le,luminalepithelium;s,stroma;myo,myometrium;ge, glandularepithelium. F.1Immunohistochemica1anab,sisoftheWnt3aexpressions ? l3?