共聚焦激光扫描显微镜在皮肤科的应用

共聚焦激光扫描显微镜在皮肤科的应用 际皮肤性病学杂志2007年1旦筮鲞筮塑』堕』!,: 共聚焦激光扫描显微镜在皮肤科的应用 李欢徐丽敏 【摘要】共聚焦激光扫描显微镜是一种新兴的非侵入性图像仪 器,具有高分辨率实时成像的特 点.它可以观察活体内和体外的皮肤图像而不需要常规的组织固定, 切片,染色.该技术在皮肤科研究中 的应用及其临床意义日益得到重视.对于皮肤病的诊断和治疗,共聚 焦激光扫描显微镜是非常有前景的 技术,它为皮肤科学的发展开辟了广阔前景,促进了皮肤病学的医学 研究和临床治疗. 【关键词】显微镜检查,共焦;皮肤 Confo~laser~.annlngmicroscopetechniqueanditsapplicationindermatolo gyresearchLIHuan, XULi-min.T~anjmMedica/University,Tianjin300070,Chma 【A】 Confocallaserscanningmicroscopyisanovelnoninvasiveimagingtoolthatpro duces high-resolutionrea1.timeskinimaging.Skincanbeimagedinitsnativestateei therinvivooreXvivowithout extraprocessthatiSneededforroutinehistology.Theapplicationofconfocall aserscanningmicroscopyandits clinicalsignificanceindermato1ogicalresearchhavebeenrecognizedandne wprogresshasbeenmade. Confocallaserscanningmicroscopyisapromisingtechnologyfordiagnosisa ndtreatmentoftheskindisease. 【Keywords】Microscopy,confocal;SkiIl 共聚焦激光扫描显微镜(confocallaserscanning microscope,CLSM)是20世纪80年代发展起来的一 种先进的细胞生物学分析仪器,是近代生物医学图 像分析仪器最重要的发展之一,有细胞”CT”之称. 现介绍共聚焦激光扫描显微镜结构原理和在皮肤科 领域的研究进展 1概述[] CLSM采用点光源代替传统光镜的场光源,使 探测点与照明点相对于物镜焦平面是共扼的.焦平 面以外的点不会在探测点处成像,只有焦平面上的 点同时聚焦于探测点和照明点,即共聚焦.以激光做 光源并对样品进行扫描,在此过程中两次聚焦,因 此,称为共聚焦激光扫描显微镜.共聚焦成像系统利 用照明点与探测点共轭这一特点,可有效抑制同一 焦平面上非测量点的杂散荧光及来自样品中非焦平 面的荧光,从而获得普通光镜无法达到的分辨力,它 以一个微动马达控制载物台的升降.可以逐层获得 高反差,高分辨率,高灵敏度的二维光学横断面图 像,从而对活的或固定的细胞和组织以及较厚的组 织切片进行无损伤的系列光学切片.这一功能又被 简称为”细胞CT”.主要优点:?分辨率高,由于观 察的只是样品的一个聚焦平面的图像,光学系统使 用照明点与探测点共轭的独特结构,因此,分辨率 作者单位:300070天津医科大学(李欢);天津市长征医院皮 肤科(徐丽敏) ? 综述? 高,为普通光学显微镜的1.4倍,最小可观察厚度为 0.5m.?灵敏度高,由光电倍增管获得数字图像, 利用不同滤片可将不同光分开,甚至极弱荧光也能 被检测到.?扫描速度快,利用点扫描或缝扫描可 很快完成对图像的观察,速度可达毫秒级和微秒级. ?扫描范围大,使用台节扫描可观察2cm×2cm 的范围.?图像存取方便,使用计算机处理.?可进 行光学断层观察,被形象地称为”细胞CT”,可实现 立体三维重建.?可进行定量观察,提供显微测量 参数 2在皮肤科应用 共聚焦激光扫描显微镜一经问世,立即引起皮 肤病学家的关注.其穿透力强,可获得200,350 m深度细胞水平的活体皮肤图像,可分析未经脱 水,固定,组织染色的活体样本,能对皮肤的血管进 行三维分析,具有独特的优势. 2.1接触性皮炎:接触性皮炎根据发病机制的不同 可以分为刺激性接触性皮炎和变应性接触性皮炎两 类.前者是由于皮肤接触了某种具有刺激性的物质 后引起皮肤发疹的一种炎症反应,绝大多数人接触 该物质后皆可发病;后者则是对各种产生炎症反应 的物质的获得性过敏反应,而且仅见于以前曾接触 过该变应原的人.两者临床现和组织病理特点极 为相似,不易区分.只有明确区分,才可以在明确诊 断后,针对不同发病机制进行不同的治疗.CLSM可 国际皮肤性病学杂志2007年箜鲞箜塑nt』!_V』型!翌. 以在活体内高效地分辨出两者在皮肤的表现. Swindells等_2_用变应原和十二烷硫酸钠对22例志 愿者进行斑贴试验,并在24h,72h记录CLSM图 像,结果在刺激性接触性皮炎和变应性接触性皮炎 中均可见到海绵水肿,表皮炎症细胞浸润,水疱形 成.与变应性接触性皮炎不同的是,刺激性接触性皮 炎可以见到角质层严重断裂和大量的角化不全细 胞.Astner等_3_应用此项技术研究变应性接触性皮 炎的敏感性和特异性时发现所有的CLSM图像有高 度的特异性,从95.8%,100%,敏感性的范围在 51.9%,96.3%.最显着的是棘层海绵形成和炎细胞 外渗,认为CLSM是有前途的非创伤性检查技术手 段之一.Hicks等[4]研究刺激性接触性皮炎与肤色的 关系中.根据肤色的不同将受试者分组,在前臂掌侧 分别以l%和4%的十二烷硫酸钠作为刺激物,分别 在6h,24h,48h进行图像记录.结果发现白种人的 临床表现比黑种人严重,进一步印证了深色皮肤对 刺激的耐受性比浅色皮肤强. 2.2银屑病:是一种常见的炎症性皮肤病,患者通 常接受各种各样的局部或系统治疗.随着新的免疫 调节治疗方法的不断出现,迫切需要一种客观公正 的组织病理评价方法.用CLSM观察到的银屑病的 典型特征与传统的组织病理学是一致的,包括角化 不全,Munro微脓疡,棘层肥厚,真皮乳头上延等.这 种非创伤性检查可以排除传统的组织病理检查中取 材对人体的损伤和制片过程中的人为因素影响-5]. 在银屑病基础研究中,Vaccaro等[6]用CLSM采用免 疫组化的方法观察层黏蛋白仪l链在银屑病皮损的 分布,发现在正常人皮肤中抗层黏蛋白仪l链抗体 在真表皮连接处规则而连续的显示染色.而在银屑 病皮损中断续表达,主要在真皮乳头处. 2.3系统性硬皮病:Sauermann等[7]使用Vivascope 100型共聚焦激光扫描显微镜研究l5例系统性硬 皮病的皮肤改变,研究主要观察了角质层厚度,表皮 最小厚度,基底层棘细胞层比(黑素含量的半定量参 数),真皮反射指数(棘层与真皮乳头比),真皮乳头 顶部与有血流血管距离(PC)等参数,每种参数均采 集4,l0个,取平均值.研究中分别以正常人(健 康组)和因特应性皮炎,移植物抗宿主反应,皮肌炎, T细胞淋巴瘤进行过体外光疗的患者(光疗组)为对 照.结果显示,系统性硬皮病组角质层厚度为11.0? 2.6m,与对照组之间差异无统计学意义,系统性 硬皮病组表皮最小厚度为44.0?7.0m,与健康组 和光疗组差异有统计学意义(P=0.049,P=0.025). 系统性硬皮病组的黑素含量(1.79?0.24)比对照组 显着为高(P=0.0008).系统性硬皮病组的真皮反 射指数(1.06?0.20)与两个对照组比较,差异有统 计学意义(P=0.000006).而系统性硬皮病组的真 皮乳头顶部与有血流血管距离为22.7,18.0m, 中位值18.2m,与对照组比较,差异有统计学意义 (P<0.001).这些差异显示了系统性硬皮病的确有 共聚焦激光扫描显微镜可分辨的特征,提示了共聚 焦激光扫描显微镜技术在系统性硬皮病诊断方面的 应用前景. 2.4基底细胞癌:基底细胞癌是常见的皮肤肿瘤之 一 ,危害人体健康,早期诊断至关重要,可以降低危 害和提高生活质量.使用CLSM这一既具敏感性又 具特异性的非创伤性技术可以做到这一点.Nori 等[8]在一次回顾性研究中对来自4个组织机构的患 者152处皮肤损害包括良性和恶性制定了5项组织 学标准,采用盲法回顾分析了152处皮损的图像.根 据这5项CLSM诊断标准来判断检查的敏感性和特 异性.结果有两项及以上的标准敏感性100%,4项 及以上标准的特异性是95.7%.敏感性是82.9%,随 着诊断标准增加提高了特异性降低了敏感性,而 CLSM在基底细胞癌亚型的鉴别需要进一步研究. Agero等[9]也观察了色素型基底细胞癌的一些特征, 肿瘤细胞在真表皮处紧密聚集形成结节状结构,瘤 细胞在瘤块周围排列成栅栏状.以及明亮的树枝状 细胞结构黑素细胞和朗格汉斯细胞. 2.5黑素瘤与Spitz痣:Gerger等_l0]请5例既往无 使用CLSM诊断经验的观察者,评价117例皮肤黑 素细胞的肿瘤,包括90例良性痣和27例恶性黑素 瘤,结果得出88.15%敏感性和97.6%特异性,统计 分析表明细胞形态学,结构,角质形成细胞界限是首 先考虑的诊断要点.Pellacani等…]对组织病理不易 区分的恶性黑素瘤与Spitz痣患者进行CLSM检查 可以发现恶性黑素瘤的特征性图像提高诊断率. Spitz痣是一种良性的黑素细胞损害,有时误诊为黑 素瘤,用CLSM可以观察细胞形态学与组织结构的 特征,与传统组织病理学的结果是一致的. 2.6皮肤附属器疾病:Tachihara等[12]观察色素型小 汗腺汗孔瘤的CLSM图像,发现肿瘤团块由小而均 一 的细胞构成,与周围正常组织界限清晰,含有黑素 的树突状黑素细胞混落在肿瘤细胞团中.真皮上部 可见大量嗜黑素细胞.Aghassi等[13]对10例皮脂腺 增生患者的29处损害使用585nm脉冲染料激光治 疗,用CLSM观察了治疗前后及随访2,4,8周的图 国际2007年1月第33卷第1期IntJDennatolVenereol,』27,: 像,结果发现损害完全消失者占28%,损害直径减 少者占66%,变平者占93%. 2.7Mohs显微外科:CLSM作为非创伤性检查可以 观察某些需要Mohs显微外科手术治疗的疾病的损 害边界,以确定手术范围,特别对恶性黑素瘤,基底 细胞癌及一些很难诊断的疾病,如无黑素的黑素瘤, 硬化性浸润性基癌等.这种技术可以明确定位,彻底 切除肿瘤,促进了Mohs显微外科发展.有学者运用 CLSM这项检查对115例需要一期Mohs外科手术 的病例观察,认为不用传统的冰冻组织切片,可以发 现结节状基底细胞癌,促进Mohs显微外科发展ll4]. 用CLSM在Mohs显微外科观察到使用氯化铝可以 提高肿瘤组织与非肿瘤组织的对比度[]. 2.8紫外线照射:Gambichler等[]使用CLSM观察 了8例志愿者接受长波紫外线照射后皮肤的改变及 与未照射处皮肤的比较.主要观察了角质层厚度,表 皮最小厚度,有活力的表皮最小厚度,颗粒层细胞大 小,表皮黑素含量等参数.结果显示,UVA照射处的 角质层厚度(15?2.9m)显着高于非照射处,虽然 表皮最小厚度在UVA照射处(40.4-4-3.6m)明显 增加,但有活力的表皮最小厚度是减少的(25.5? 2.1m),且无统计学意义(P>0.05).颗粒层细胞大 小在这两处则差异有统计学意义(P=0.008).表皮 黑素含量在UVA照射处比未照射处显着增高(P= 0.014).这项CLSM研究证实了UVA照射可以导致 色素和表皮厚度的改变,且使用CLSM不需要切片, 染色,在活体内进行光生物学研究是有前景的 综上所述,CLSM作为一项新发展的技术,它的 非侵人性检查特点在皮肤科领域将有广阔的应用前 景,CLSM正被广泛地认识和应用,相信随着这一技 术不断完善和发展,必将促进对某些难治性皮肤病 病因,发病机制的研究,为诊断和治疗提供新的有效 的方法,推动皮肤科学发展. 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