传染性法氏囊病病毒A节段编码序列cDNA基因的克隆和序列分析

传染性法氏囊病病毒A节段编码序列cDNA基因的克隆和序列分析 第 2 1 卷 第 3 期 中 国 预 防 兽 医 学 报 Vol . 21 , No . 3 1 9 9 9 年 5 月 Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine May 1999 传染性法氏囊病病毒 A 节段编码序列 cDNA 基因的克隆和序列分析 1121 1 1 2 张曼夫陈红英袁克湖门昌平胡子信 ()11 中国农业大学生物化学与分子生物学系 ,北京 100094 ; 21 北京农学院动物医学系 ,北京 102206 ( ) 摘要 对反转录2聚合酶链反应 RT2PCR扩增克隆的传染性法氏囊病病毒超强毒 Harbin 毒株的 A 节段编码序 列 cDNA 基因进行了核苷酸序列分析 。结果 ,克隆的 A 节段基因共 3101bp ,包括两个完整的阅读框架 ORFA1 和 OR2FA2 分别编码 1012 氨基酸的前体蛋白 VP和 145 氨基酸的 VP,两者有部分重叠 。A 节段编码序列基因的克隆成 22423 5 功为分子流行病学和基因工程疫苗的研究奠定了基础 。 关键词 传染性法氏囊病病毒 Harbin 毒株 ;A 节段编码序列 cDNA ; RT2PCR ;序列分析 () 中图分类号 Q78 S85513 文献标识码 A 文章编号 100820589 19990320178204 Cloning and Sequence Analysis of Genomic segment A of Very Virulent Infectious Bursal Disea se Virus 112 1 1 1 2HU ZiXin,ZHANG Man fu,CHEN HongyingYUAN Ke hu ,MEN Changping (11Department of Molecular Biology and Biochemistry China Agricultural University ,Beijing 100094 ; )21Department of Animal medicine Beijing Agricultrual College ,Beijing 102206 Abstract By RT2PCR ,the complete cDNA for the coding region within segment A of Infectious Bursal Disease Virus strain () Harbin was sequenced The 3101bp sequence contains two overlapping open reading frames ORFA1 and ORFA21The large ORF () of 3036bp coding a polyprotein VP22423,whereas the small ORF is 435bp coding for VP51Both the nucleotide sequence and de2 duced amino acid sequence were compared with 12 published sequences of segment A segment A genes of IBDV strains including UK661 ,OKYM ,52/ 70 ,Cu21 ,P2 ,STC ,002273 , GLS , GZ29112 ,23/ 82 and OH1It was shown that the Harbin strain was most closely related to the P2 and Cu211 Key words IBDV ; Strain Harbin ; Coding region of Segment A ; RT2PCR ; Sequence ( ) ( ) 由传染性法氏囊 IBDV引起的鸡传染性法氏囊 3’端非编码区 。A 节段 3132314kb包括两个完整的 阅读框架 ORFA1 和 ORFA2 分别编码 VP和 VP;B 22423 5 病 ,由于近年来变异株和超强毒的流行 ,已严重威胁 () 2节段 182219kb编码 VP。VP是病毒 RNA 聚合酶 , 1 1 着包括我国在内的世界养鸡业的发展 。 它与病毒 RNA 复制有关 。VP和 VP是病毒的主要 2 3 IBDV 属于双链双节段 RNA 病毒科 ,基因组由 A结构蛋白 ,共同构成病毒衣壳 ,是主要的宿主保护性 抗原 。VP是血清型特异性抗原 ,VP为群特异性抗 和 B 两个节段组成 ,包括 5’端非编码区 ,编码区和2 3 原 。抗原变异主要发生在 VP的可变区 ,VP在病毒 2 4 蛋白成熟过程中起重要作用 , VP功能目 前 尚 不 清 5 基金项目 :国家自然基金重大项目 NO ,39893290 ,北京市自 然基金资助项目 NO 5952004 收稿日期 :1998 - 12 - 291 ,2 楚。 海科技出版社 ,1985 ,236,3081 () 戴瑞良 :中国兽医科技 ,1991 , 12:23,251 参考文献 4 () 程遂来 ,张栓紧 :中华皮肤科杂志 ,1986 ,19 2:801 5 1 全国中等卫生学校试用教材《微生物检验技术》编写组 : 微生物及 () 朱树萍 ,程遂来 ,白凤菊等 :中华皮肤科杂志 ,1983 ,16 2:851 6 检验技术 ,广州 :广东人民出版社 ,1979 ,289,291 ,340 ,472,4761 ( ) 林得宝 ,万俊增 ,李会珍等 :中国人兽共患病杂志 ,1989 ,5 4: 33, ( ) 2 吕得群 ,张致中主编 :医学真菌学 全国送学真菌学习班教材, 沈 7 351 阳 :1984 ,3,60 ,236 ,241,2491 () 许冰政 ,李燕平 :中华皮肤科杂志 ,1985 ,18 1:351 3 WT 休伯特 ,WF 麦克洛克 ,PR 施努伦贝格尔 :人兽共患病 ,上海 : 上 8 鉴于 IBDV 的抗原基因均在 A 节段上 , 因此 , 我 116 序列分析 选取经酶切及 PCR 鉴定后的阳性克隆 () 进行序列测定 。采用渐进法 prime walking即 5’端和 3’ 们通过 RT2PCR 扩增克隆 A 节段的 cDNA 基因 ,进行 端分别先用通用引物进行反应 ,而后依据两端测出序 了序列分析 ,现如下 。 列 ,另外中间段测序引物 ,再进行测序反应 ,共计 71 材料和方法 段结果拼接出 A 节段全长 cDNA 序列 ,为保证测序结果 111 毒 株 IBDV2Harbin 毒株于 1992 年从哈尔滨 的准确 ,全部测序反应重复两次 。测序时模板的制备采 地区某鸡场的病鸡法氏囊中分离的由中国农业科学 用 PEG法 ,利用 ABI377 自动测序仪 。院哈尔滨兽医研究所提供 。 结果和讨论2 112 载体与菌种 p GEM ?2T 载体购自 Promega 公 司 ,JM由本室保存 。 211 病毒基因组 dsRNA 的提取 IBDV 经过超速 109 113 RT2PCR 引物设计 参考已发表的 IBDV2STC 毒 离心沉淀 ,蛋白酶消化 ,酚/ 氯仿/ 异戌醇抽提 ,乙醇沉 株 A 节段 cDNA 序列 ,用 OL IGO510 软件在 5’端非编 淀后 ,琼脂糖凝胶电泳检测 ,有分子量 313kb 和 219kb ( ) 码区和 3’非端编码区之间 ,设计合成了 4 个引物 , P1 左右的两条带 , 图 1符合已报导的 IBDV 基因组 A ( ) ) ( + 5′2CTC CTC CTT CTA CAA CGC TAT23′, P2 25′2和 B 节段的分子量 。 ( ) CGT CRA CTA CGG GAT TCT GG23′, P3 + 5′2AGT 212 反转录获得了全长 cDNA 以 3’端引物 P4 进行 ) (YGA CGG RAT TCT TGC TT23′,P4 25′CCT YAC TCA 反转录得到 cDNA ,以此为模板 ,不仅能够以 P3 、P4 为 AGG TCC TCA TCA GAG A23′以 p1p2 为引物扩增的引物 PCR 扩增而得到 3′端特异性 PCR 产物 ,而且也 5′端称上段 ,以 p3/ p4 为引物扩增的 3′端称下段 , 上 能够以 P1 、P2 为引物扩增而得到 5′端特异性 PCR 产 段和下段有部分重叠 。在 p2 p3 p4 中均有简并碱基 物 ,说明本实验反转录而得到的 cDNA 为 A 节段的全 ( 是考 虑 到 这 一 碱 基 处 可 能 有 变 异 Y: C/ T , R : A/ 长 cDNA 。 3 ,4 ) 。 213 PCR 扩增结果 经琼脂糖凝胶电泳检测 ,以引 G ( ) 114 病毒基因组 dsRNA 的反转录2聚合酶链反应 物 P1 、P2 的 PCR 产物有 117kb 左右 1659的特异性 5 。 参照有关文献进行条带 。应 用 引 物 P3 、P4 的 PCR 产 物 有 114 Kb 左 右 () () 1444的特异性条带 图 2。与预计扩增的 5′端和 3′ 115 PCR 产物的克隆及鉴定 将纯化的 PCR 产物 按 端大致相同 p GEM ?2T 载体操作手册进行连接和转化 。挑取 ,因此初步认为 A 节段的 cDNA 基因 5′端 和 3′端上下两段被扩增了 。白色菌落提取质粒用酶切和 PCR 鉴定 。 图 21IBDV 基因组节段的 PCR 扩增 图 11 纯化的 IBDV 基因组双股双节段 RNA Figure 21Amplification of Segment A gene by Figure 1 Purified genomic dsRNA of IBDV PCR111PCR product of 5′end of Segment A , 11DNA/ EcoRI + Hind ?Markers , 21DNA/ EcoRI + Hind ?Markers ,31PCR product 21 Genomic of 3′end of Segment A RNA of IBDV 21511 5′端重组质粒的鉴定 : 从小规模培养的阳性 214 PCR 产物的克隆 将 PCR 产物连接到 p GEM ?2 , 以此为模板分别用引 物 P1 、 克隆中提取重组质粒 T 载体转化 E1coli JM109 受体菌 ,将转化菌培养于含 P2 、VP2 可变区的引物 P1 、P2 及 VP5 的引物 P1 、P2 进 氨苄青霉素的培养基上培养获得了多个阳性菌落 。 215 重组质粒的鉴定行 PCR 扩 增 , 获 得 三 条 DNA 片 段 , 长 度 分 别 约 为 中 国 预 防 兽 医 学 报 180 1999 年 117 Kb 、650bp 和 450bp , 与预期的一致 。对 提 取 的 重 的大小一致 。 组质粒 DNA 用 Sal I 和 Pst I 进 行 双 酶 切 , 获 得 两 条 216 序列分析 通过对 5′端克隆和 3′端克隆的序列 DNA 片段 ,长度分别为 310 Kb 和 117 Kb 左右 ,分别与 两次重复测定 ,获得 IBDV2H 毒株 A 节段 cDNA 基因 ( ) 质粒和 5′端 P1P2PCR 扩增基因的大小相吻合 。 3101bp ,包括两个完整的阅读框架 ORFA1 和 ORFA2 21512 3′端重组质粒的鉴定 : 从小规模培养的阳性分别编码 1012 氨基酸的前体蛋白 VP22423 和 145 氨 基酸的 VP5 ,两者有部分重叠 。序列分析表明传染性 克隆中提取重组质粒 ,以此为模板分别用引物 P3 、P4 进行 PCR 扩增 ,获得一条 DNA 片段 ,长度约为 114 Kb 法氏囊病病毒中国株 A 节段编码序列 cDNA 基因获与预期的一致 。对提取的重组质粒 DNA 用 Sac ?进 得克隆成功 ,此为 IBD 的分子流行病学和基因工程疫 () 行酶切 , 获得 两 条 DNA 片 段 , 长 度 分 别 为 310 Kb 和 苗的研究奠定了基础 图 3。 ( ) 114 Kb 左右 ,分别与质粒和 3′端 P3P4PCR 扩增基因 图 3 传染性法氏囊病毒 Harbin 毒株 A 节段编码序列基因 cDNA 序列及推导的氨基酸序列 Figure 3 Nucleotide sequence of the cloned cDNA and the deduced amino acids sequence of the coding region of segment A of IBDV strain Harbin 3 () Kibenge F S ,Jackwood D J ,Mercado C C :J 1 Gen1Virol ,1990 , 71:569, 参考文献 5771 ( ) 4 Mundt E1Vakharia V N : Sy Proc1Natl1Acad1Sci1USA 1996 , 93: 11131 () 1 Azad A A ,Barret S A ,Fahey K J :Virology ,1985 , 143:35,441 ,111361 () 2 Brown M D ,Skinner M A :Virus Res ,1996 , 40:1,151 () Jackwood D1J 1Hanes G ,Miller S H :Avian Dis11996 , 40:457,4601 5