钙羧酸指示剂与牛血清白蛋白作用的研究

钙羧酸指示剂与牛血清白蛋白作用的研究 2001年2月 Feb.2001 华南师范大学(自然科学版) JOURNALOFSOtrl~CHINANORMALUN1VEKSi’I’Y (NATU1La.,LSCIENCEED1TION) 2001年第1期 No1.2001 文章编号:1000—5463(2001)01—0088—05 钙羧酸指示剂与牛血清白蛋白作用的研究 黄发德俞英蒋雄 华南师范丈学化学幕广京广州51063 摘要:在pH4.47的缓冲溶液中,用分光光度法和平衡透析法研究钙羧酸指示剂(ccA)与牛血清白蛋 白(BSA)的结台反应研究发现,CAA与BSA主要是以分子间的疏水作用结台,该结台反应符台Pe— se?lo提出的相分配模型,BSA对CCA的作用相类似于阳离子面活性剂的作用.并探讨了实验条 件对结台反应的影响. 关键词:牛血清白蛋白;钙羧酸指示剂;分光光度法;平衡透析法 中国分类号:{3657.3文献标识码:A 在生物体中,蛋白质是必不可少的生命物质,有关蛋白质的各类研究是目前生命科学,化 学和临床医学中共同感兴趣的课题[钙羧酸指示剂是一种络合指示剂,曾用于钙的络合滴 定,它的结构如图1所示.CCA作为光谱探针用于蛋白质 的反应与研究,目前尚未见报道.实验表明,在微酸性的—HH..H 环境下,CCA能够与蛋白质相互作用结合.这种作用表现HOS—-,-4 在uv光谱的变化及波峰的红移,据此,可进一步研究 CCA与蛋白质结合的形式,结合力,结合数等等一系列的 反应机理.从而由分子水平的角度认识蛋白质与小分子 之间的相互作用的机理,为生命科学提供有用的信息和图1钙羧酸指示剂的结构 数据. 1实验 1.1仪器与试剂 UV一240型紫外一可见分光光度计(日本岛津公司);721型分光光度计(上海第三分析仪 器厂);口Hs一3c酸度计(上海雷磁仪器厂).钙羧酸指示剂(分析纯)溶液:准确称取0.1010g, 加二次水溶解,定容于500ml容量瓶,浓度为4.61×10一mol/L.牛血清白蛋白(BovineSerum Albumin,简称BSA,上海伯奥生物科技有限公司,分子量以67(300计),用0.05mol/LNaCI溶液 配制,置于是1—4?冰箱中保存.缓冲溶液:Britton—Robinson广泛缓冲液,盐酸一乙酸钠缓冲 溶液.十二烷基苯磺酸钠:0.1%水溶液.溴化十六烷基三甲基铵:0.1%水溶液.聚乙烯醇: 0.1%水溶液.溴化十六烷基呲啶:0.1%水溶液(以上均为质量分数). 收稿日期:20oO一06—27 第一作者简介:黄发德.男.1998缎硕士研究生 1.2实验方法 在一系列.10mL比色管中,依次加入1.0mL4.61x10moVL的CCA溶液,2.0mL pH4.47的B—R缓冲溶液及BSA溶液,以水定容,摇匀,静置10min,以水为参比扫描吸收光谱 或在560nm下测定试剂空白的吸光度A0和结合反应体系的吸光度A,并求出AA=A一A. 1.3摩尔吸光系数的测定 1.3.1CCA摩尔吸光系数(F)F用朗伯一比尔定律求得,在选定的波长下,做出CCA浓度 与吸光度值的相关曲线,曲线斜率即为e. 1.3.2CCA与BSA复合物摩尔吸光系数(,B)固定CCA浓度,增加 BSA的量,采用Congden~】 的方法,以吸光度差值?d的倒数对蛋白质的浓度(或加人体积)的倒 数作图的方法,外推以求 ?A一,进而求得EB. 2结果与讨论 2.1吸收光谱 CCA在pH4.47的B—R缓冲剂中为红色,550 nm处出现最大吸收峰,加入一定量的BSA后,溶液 变为紫色,吸收峰移至560nm处,吸光度值明显降 低,结果如图2.这表明CCA与BSA之问存在相互 作用. 2.2条件对结台反应的影响 2.2.1缓冲体系,酸度和缓冲液用量的选择 试验了B—R缓冲溶液和NaAc—HC1缓冲溶 液对结合反应的影响,实验表明用Britton—Robison 缓冲液体系AA较大,且在pH3.75—4.85范围内, AA值变化较平稳,结果如图3.固定BSA和CCA 的量,改变B—R缓冲溶液的用量,测定反应的体 系的AA值.当用量为1.0—4.0mL肘,AA达到最 大且稳定,实验选pH4.47的B—R缓冲溶液2.0 mL作为反应条件. mM)7【xl Inm 图2CCA—BSA的吸收光谱 (G比–461×10_.mol/L,atpH4.47,4呲water.c卧 ×107(mol/L):B.Ob.2.98c447;d597;e.746; f.8.95;昏10.4) 互. DH 图3酸度的影响 l/mL’ 图4离子强度的影响 2.2.2CCA用量的影响 固定pH值及缓冲液用量,BSA的量,改变CCA的量,测定反应体系?A值,AA值随着试 剂用量的增大而不断增大,鉴于仪器测量误差的限制,试剂用量不能太大,实验选取4.61× 10mol/L的CCA溶液用量1.0mL 2.2.3试剂加入顺序的影响 试剂的加入顺序对复合物的生成的影响很小,实验选用CCA溶液与缓冲溶液首先混台 后,再加入BSA. 2.2.4反应时问 实验表明,CCA与BSA的结台反应很快完成,4rain后?A值稳定,至少稳定5h. 2.2.5温度的影响 固定DH值及缓冲液用量,BSA的量及CAA的量,将温度由0—40?变化,AA改变在测量 误差范围之内,表明此结台反应体系受实验温度条件的限制较小. 2.2.6离子强度的影响 固定pH值,缓冲液用量,BSA用量及CCA的量,在体系中加入不同量的?a溶液,改变 体系的离子强度,测定反应体系的AA值,结果如图4,随着NaC1溶液浓度增大,AA值在离子 强度小于0.017时变化不大,离子强度大于0.017时,?A不断减小,说明离子强度增大,使 CCA与BSA的结台减弱,这是因为Na和a一对BSA与CCA之间具有电荷的竞争和屏蔽作 用. 2.2.7表面活性剂的影响 试验了十二烷基苯磺酸钠,聚乙烯醇,溴化十六烷基三甲基铵和溴化十六烷基呲啶对反应 体系的影响,从吸收光谱图可以看出,阳离子表面活性剂演化十六烷基三甲基铵,溴化十六烷 基呲啶使CCA最大吸收峰红移,加入BSA光谱没有变化,说明CCA 与BSA的结台作用较CCA 与阳离子表面活性剂之间的相互作用弱.阴离子表面活性剂十二烷基苯磺酸钠加入到CCA— BSA体系后变浑浊,说明阴离子表面活性剂破坏了CCA与BSA之间的结合,十二烷基苯磺酸 钠与BSA缔台成太分子析出.非离子型表面活性剂聚乙烯醇对CCA—BSA体系的影响很小,且 有一定的稳定作用.此外,研究了在CCA溶液中加入不同类型的表面活性剂,作出其吸收光 谱,从光谱图中可以看出,阴离子表面活性剂十二烷基苯磺酸钠,非离子型表面活性剂聚乙烯 醇与CCA役有作用.阳离子表面活性剂溴化十六烷基三甲基铵,溴化十六烷基吡啶使CCA吸 收光谱红移,与BSA使吸收光谱红移有相同之处.故认为在此实验条件下BSA对CCA的作用 与阳离子表面活性剂相似. 2.3结台模型与结合常数 有机小分子与蛋白质的作用机理和平衡规律尚在研究之中,人们提出了各种各样的结台 模型,有Scatchard模型,相分配模型【等,其中ScatchaM模型较经典,它不考虑个体之间的 相互作用,认为有机小分子与蛋白质上每个结台部位的’隋况完全相 同,各个结台点互不干扰, 其方程为:n/CF=一Ko(其中为每一分子蛋白质上所结台的配体数,为常数,?为晟太 结台部位数,CF为溶液中游离的配体浓度)从方程可以看出,n值越大,n/CF值越小,作n/C , 图应得一条直线.Pesaverto提出的相分配模型其思想是BSA对配体吸收光谱类似于表面 活性剂胶束的作用,没有明确的专一性结台点,把BSA当作不溶于水的微相,配体在微相和水 90 相中分配,其分配常数Ka=n/C,即n/C为一恒定值. 2.3.1分光光度法求结合数与结合常数 按文献L,固定CCA的量,改变BSA的量,测出相应的?A,由下列式:Ae=EF一,B,?A= 盘.CB,n=CB/CBsA.计算出结合态的CCA的浓度和每分子BSA结合的CCA分子个数n,所得 结果列于表1,作n/Cr—图,发现n/CF为一常数,本文认为ccA与BSA的结合不符合 Scatchard模型,而符合相分配模型. 表1实验数据 (c=9.22×10,mol/L,pH4.47.n560?,EF=7630,=347o) 2.3.2平衡透析法求结合数与结合常数 按文献|3_,将固定量的BSA(6.0×10一r?L/Lj放于是15cm的透析袋内,将总量(CCCA)逐 渐增加的CCA放于袋外,避光放置48h.以水为参比,测定透析袋外溶液560nm处的吸光度, 计算出游离态的CCA的浓度CF和结合态CCA的浓度CB与每分子BSA结合的CCA分子个数 . 所得结果列于表2,可以看出n/CF趋向于一常数,符合Peasvemo的相分配模型的假设 表2实验数据 (c斑–60xi0一’nL,pH447,F=7630,,H:3470,址560nm) 2.4ocA与BSA结合作用力的确定 在不同温度下,固定CCA的量,改变 BSA的量,测出相应的?.根据文献6,用 虽小二乘法作出双倒数图,可计算得到结合 参数.结果列于表3. 表3结台参数 91 小分子与生物大分子的作用力包括氢键,范德华力,静电引力,疏水作用力等.小分子不 同,与蛋白质作用力类型也不同.当温度变化不大时,反应的焙变AH可以看作一个常数.由下 二式 ?G=一RT1nK=?H—S Ln(/K1)=AH/R(1/T1—1/) 可以求得AH,?G,?s(?G为自由能,?s为 熵变)结果表明,CCA与BSA结合反应的AH >O,?S>0.故认为,CCA与BSA之间的作用 力主要是疏水作用力[71. 表4热力学参数(303.15K) 参考文献: [1]俞英,程晓伟.牛血清白蛋白与酸性品红结合反应的研究[J].分析化学.20OO,28(5):583—586. [2]0mgd?RW,ulIlGW,S~10erAG.TheBi她lntealcfim0f0聃?日趟iemuewithPI吼由B【JJ.AnalBiochem, 1993,213:407—413. [3]SeatchardG,schdnbergIH,ArmstrongSHPhysicalChemistry.fProteinS olution[J].TheCombination0fHuman SerumAlbuminwit11ChlorideIon.JA皿ChemSoe,1950.72:535—540. [4]PesavexttoM,ProfttmoA.Inteme~on0fSerumAlbumin.slthAsI?砌 AzoDyeinAcidicSolution[J].Talanta, 1991,38(10):1099—1106. [5]魏永巨,李克安,童沈阳.溴甲酚绿与血清白蛋白的结合反应[J].分 析化学.1996,24(4):387—391. saesu~K,1watsukaM.SpcetrophotometfieMeasm’emem0fProteinBindin gConstantandSiteNumber[J] Yak~gaku,1979,39(1):43—48. 【7]Ph61ipDRoss,SubramardanS.ThermodynamicsofProteinAssociationReactions:ForcesContr~ngtoStability 【JJ.Bioehem,1981,20:3096—3102. 1l?SIIJDYON1l?REACIloNBETWEEN HUANGFa—deYUYingBANGXiong nl1利Q,emistry.SouthChimNonmlUnivec~ty,Q肌叫,0I|丑rI510631. Al~lraet:TheinteractionofCalcon~licAcid(CCA)andbovine8emmbum_n(BSA)wasim,esti— gatedbyusiJ1gspectrophotometricmethodandequilibriumdialysismethodinacidicsolution(pH4.47).It issuggestedthatthehyamphobieforceisthemambindingforce.nemodelofpIlasedistributionis印一 propfiateinthetrealrn~ntofdataobtainedhere.Theeffectofsurfaceactiveagenttotheinteractionalsys— telTflisdiscussed.ItisfoundthattheeffectsofBSAonthespectrumofCCAweresimilartothatofcation— icsuffaetam.1l1einfluencesofexperimentalconditions013theinteractionwerealsodiscussed. Keywords:CalconarboxylicAcid;BorineSerumAlbumin(BSA);spectrophotcmetry;equlibriumdialy- sismethod 【责任编辑黄玉萍】