【doc】海藻酸盐固定化北京丙酸杆菌丙酸发酵的研究

【doc】海藻酸盐固定化北京丙酸杆菌丙酸发酵的研究 海藻酸盐固定化北京丙酸杆菌丙酸发酵的 研究 Lg/{廷 生物8(2):178"-:183,1902 Chinese1ourna~olBiotechnology' :', . : 海藻酸盐固定化北京丙酸杆菌丙酸发酵的研究 .至蕉垒互鎏v乐华爱?—————..一_——一V (中国科学院傲生物研究所北京)T 本文报道利用海藻貌钠固定化北京丙酸杆茁,及其丙酸发酵的最适条件a最适海藻酸钠 和菌体的起~JLth2NmlO0%(w/v).菌体和海藻酸盐混合滴CaC1溶液中得到直 径为3—4mm球形颗粒.将固定化细胞放八25ml厌氧管中5g颗粒,l5mI培养基.其成分为 (%):葡萄糖l,酵母膏05,CaCt20.1.30"(3静置培养产生大量的撮发酸,丙酸对乙酸的 比例接L~IO:1.固定化细胞重复利用发酵3O次,保持稳定活性65天. 关键l号.塞亘堡堑堕.堡苎墼塑垦堡茎! 北京丙酸杆菌是本买验室分离鉴定的 新种,?该菌的基本特性和丙酸发酵条件已 有报道"它是一个有应用前景的菌 株.由于丙酸及其钙钠盐有较强的抑菌作 用,可用作食品和饲料添加剂.丙酸还能 用来制造香料,生产溶剂,作为某些药物 合成的原料,因此对丙酸的需求量极大 尽管过去几十年内对细菌发酵生产丙酸进 行了许多研究,但因批式发酵周期长,菌 体重复使用困难,导致成本过高. 随着固定化细胞技术的兴起与发展, 人们将此技术引入丙酸发酵的研究中,借 此克服丙酸发酵的不利因素Bopo6be~a 等用聚丙烯酰胺凝胶固定化丙酸杆 菌,aatl~Tl等…将丙酸扦菌用明胶一琼 脂包埋.Cavin等t5描述了用海藻酸钙包 埋丙酸菌细胞的连续反应罐,对工业应用 有吸}I力本文报道,以价格低廉,无毒 安全,操作简便的海藻酸钠对北京丙酸杆 菌进行包埋和固定化细胞丙酸发酵的研究 结果. 材料和方法 (一)菌种 f(I ' ? 北京丙酸杆菌Pr0f60cferi4m beijinflenseP是我组冉沼气发酵液中分 离鉴定的新种. (--)细菌培养 将菌接到BPYL斜面上,用抽空 .气换氮气法于厌氧罐中,30~C培养4天. 然后转入三角瓶培养基,其戚分为(); 葡萄糖2,酵母膏1,蛋白胨1,80?静 置培养3天.经K70D冷冻离心机4000rpm 离心,收集菌体,并用生理盐水洗一次, 得湿菌体,即可使用. (三)固定化细胞的制备 秤取湿菌体log悬浮于lOml无菌水 中,与10ml2%(,v/V)海藻酸钠溶液充' 分混匀,混台物通过内径1mm胶管在恒 流泵带动下注入1CaC1.溶液中,形成. 直径3—4mm的小圆球,即成固定化颗 粒.颗粒在室温下放置于1%CaC1溶液 中泡1,2h,再用无菌水冲洗干净印可 使用.或装在含水分的烧杯中,于普通冰 箱(3—4?)保存备用. (四)分析方法 率文于t990年10月30日收到 国家自端科学基盘爵瑚项目 ? ? ? 2期王蓓等;海藻酸盐固定化北京丙酸杆菌丙酸发酵的研究179 1.菌体计数.菌体密度.湿重.干 重按一般常规.稀释平板计数按照Yong- smith的方法. 2.挥发酸}采用madzuGC, - 7^IG气相色谱测定丙酸和乙酸.取酸化 后的反应液ll进行测定.色谱柱及其他 条件同前报"'. 结呆 . (一)不同培养方式收获的钿艟固定 化后产t力的比较 将1支斜面菌体接~kS00ml三角瓶培 养基中,静置或摇床培养3'天收集菌体, 制备的固定化细胞,培养发酵后测定结果 如图1.静置培养的细胞比摇床培养的细 胞丙酸含量高,而且静置培养的细胞收获 量比较稳定,兰次平均菌体密度为0.570 (A52.nm),湿重3.60(g/s00ml培养液), 千重相当于1.04g.故采用静置培养收集 菌体. 图1不葡培养方式啦簌曲细胞 磺定化后产蘸由的比较 Fig.ICbmparistonofacidproductivity ofharvested?l1sfromdifferent ~uItiv毗ionstatesimmohi~a? tion. 1.?置S协tical丙嚷Propior~cacia 2.静置StatlcaI己嚷Aoeticacid, ?3.揖瞢Shaking丙蕊Proplonicacid 4.撅蔼Shaking乙嚷A辟ticacid (--)游离细胞与固定化细胞活性的 比较 将游离细胞悬液lI11l接入20ral厌氧 管培养液中,与同量菌体的固定化细胞发 酵产酸结果相比(1)说明固定化之后的 细胞有活性,此方法可行,因为丙酸发酵 不是简单的葡萄糖转化,它是多酶体系作 用的结果,所以培养基还需补加些酵母膏. 裹1*?粗矗与固定化埋?活性的比较 Table1Comparislonof珊i廿between freeeellsandimmobilizedcells (24h) 擗冉I2.240.20 FlI4.5Oi.船 目定亿】1.420.12 hnmob'dlzedI2.4SO.75 I蕾尊赣Glucose2 I蕾萄糖2+群母青1 Gluooae2+Yeastaxtract1 (三)固定化爱培养条件的选择 1.海藻酸钠起始浓度的选择;将不 同浓度的海藻酸钠与l00%起始菌浓的菌 体,按1:l体积混合,由恒浇系经内径1 mm的胶管滴入170g/L的CaC1.溶液中. 1,2浓度的海藻酸钠与菌体混合 后;可以顺畅地通过胶管在Cac】:中成 粒.而4浓度的通过胶管不太J蝣利,海 藻酸钠起始浓度增至6,8时,与菌 体混合后易凝聚,阻塞胶管,无法成粒. 由于固定化细胞使用的重复性和长期性, 制成的固定化颓粒需要足够的强度,在这 种意义上讲,选用2和4的起始海藻 酸钠浓度比1的好.2和4%起始浓 度形成的颗粒直径分别为3—4mlyl和5 -- 5.5mm,2浓度者颗粒较小,产酸量 略高,结果表2所示.4浓度者在操作 I80生物工程 寰2海藏t钠起始{妻虞对固定化簟雎产t?的蓐响 Table2E雠ectofink~alconcentration , ofsodiumat#hateonacidpro. ductionof~_mobillzedcells 海蕞酸钠起始穰整 In]Salconcentra- B0dlumal rion0, nate() 产馥量 Acidproductlvity(g/L) 患导州{ 上具有一定困难,故采用2%海藻酸钠起 始浓度. 2.起始菌浓度对产酸量的影响;一 般来说,菌浓度越高,转化原料所需时间越 短,可以尽快得蓟较高的产量,如图2所 示.12h产酸量明显以菌浓度lO,50,100, 200%依次增加,但到24h;~同菌浓度阔的 产酸量差距减小,但是菌浓度太高所需菌 体太多,在制备过程中,易过早发生菌体 与海藻酸钠的凝聚,所以选择100怍为 起始菌浓度. 匪2起抬菌敢度对产蕞量曲影响 Fj2Effect0fh-1城aleellBconceniration onacidproduction 】.12(h)荫葭propionicacid 2.12(hi己藏Acetacid 3.24(h)雨馥Propionie?? 4.s4(h)己酸AceticacId 3.起始pH对产酸量的影响:固定 化细胞反应用的培养基,不加缓冲液,灭 8卷 菌前不同起始pH用HCI或NaOH调节,每 天测定产酸量,如图3所示,pH8--9, 2天就可达至最高产酸量,而pH5,6, 7财需4—5天才可充分转化.测定灭菌 前后培养基pH变化为: 灭菌前pH5678 8.59 灭茼后pH4.65.16.d6.8 6.97.0 灭菌前H调至8—9,灭菌后tm实为 6.8—7.0,正是细菌生长和丙酸黟鳙酶系 反应的最适范围,产酸最快而多,当pH 下降对原料也几乎用尽. 9H 圈3起始p}I对产藏t的髟垧 Fig.3Effectof.m拙alpH,onacidproduction 1.1(d)丙藏Propionicacid 2.2(d)丙砬PropJo*lk:acid 3.d)丙藏Propbnlcacid 4.2(d)乙蕞Aceticacid 4.温度对产酸的影响;周定化细胞 产酸的最适温度(图4).在一天时以30? 最好'二天时26—30?都巳接近最高峰I 34?时虽已超过该菌的最适温度,然而固 定化细胞仍有一定的产酸力,但培养剽5 — 6天仍不能达到30~C的水平.所以选择 3O?进行固定化细胞的发酵. 5.固定化颗粒重量/培养掖体积不 同比例对产酸率的影响:实验中一直选用 体积25m]厌氧管培养包埋细胞,l保持颗粒 ? lI ? "? 00 65i32J 一1,再甚Iq.》 ? ? ? 2期王蓓等海藻酰盐固定化北京丙酸杆菌丙酸发酵的研究 lu加3035 T【?】 图4盟庭对产酸的影响 F.4E~eetoftemperatureon Bcldproduction i.【(d'再奠Propl~nicacid 2.t由再麓P?响_macid ..(d)再麓Propior~acid '.2(d)乙酸Acet.坨acid 与反应液总积为20ml,留出5ml空 气,菌体所耗氧来自余留的5rnl空气柱, 保持该菌新陈代谢所需的兼性厌氧环境. 在起始酱浓度为100的条件下,对四种 不同的固定化颗粒重置(g)与反应液体积 (m1)的比例进行实验.由表3结果可见, 此比例值越大,单位体积反应液中菌体越 多,转化越快,短时问内产率就高.根据 综合考虑,试验中一直采用的比例是0.333 g固定化颗粒7rnl反应液. 寰s一主北?奠重量/培葬液体识 |t翻对产宰的嚣响 Table3O~mparlsonofyieldatthedi— fferentratioimmobilizedce— llsweight/brothvoftlr~ 商定似?童,培养蕞 Y.塘Idp器慧删()Immobilizedcofls/broth (g/m1)12hl18hl24h 6.固定化细胞发酵状态对产酸的影 响;把新鲜固定化细胞拄sg/15ml培养液 的比例装入厌氧管中,分别以振荡和静置 状态发酵,测定其产酸量(图5)除脚开始 的16h外,其他时间内,两种发酵状态产 酸结果几乎没有差别.这是因为静置发酵 一 定时间后,固定化细胞也能因发酵自然 起浮翻动,所以固定化细胞丙酸的产量基 本上不受机械振动与否的影响.乙酸的含 量振荡发酵者似乎略高.由于在厌氧管内 造成了较少的溶氧量,正好符合丙酸菌兼 性厌氧的生理条件,因此选择厌氧管内静 置发酵方式. 圉6不同发酵状淼对固定忧细胞产融抽形哺 F.5Effectddifferenfstaresof fermentatlonofimmob?ized ceilso11acidproduction 1.静置Statical丙酸Propionlcac|d 2.静置Statical乙酸Aeeticacid 3.振甍Shaking丙藏Propionicacid 4.振蔼8haklng乙瞳Aceticac".d 7.酵母膏浓度对产酸的影响酵母 膏是丙酸菌最理想的氨源之一?,因它 除了提供氮源之外,尚含有一些非氮生长 因子.前述实验巳证明固定化细胞丙酸发 酵只用葡萄糖效果不好,需要加些酵母 膏.因此选用酵母膏作为固定化丙酸菌生 长发酵的补充营养.以1葡萄糖为碳 源,试验酵母膏的最适用量,结果(图6) 所示,其含量0.25时产酸很少,而0.5 和l%对包埋细胞产酸已达一'定水平并无 6::0 一,I量i. 一一P!0> 生物工程 , 一, /, l囤B酵母膏赦度对产豌的影响 F.BEffect.fyeast朝j灯actconcentration Qnacidproduction 1.两酸Propbnkacid 2.己酸Aceticacid 差别,所以选用0.5%酵母膏用最. 8.不同糖浓度对产酸转化率的影 响:本菌株可以广泛地利用单糖,双糖和 多糖,这里选择含一水分子的葡萄糖为碳 源,以固定化细胞对四种不同糖浓度的产 酸结果进行比较,发现转化率随糖浓度 0o5%至l0依次递减,产量依次递增. 在糖浓度0.5,1时,产酸率很快迭 至慑高值,当糖浓度为5%,10时产酸率 增长缓慢,始终不高(图7).考虑要求 0 三 . g. 8卷 ? , j?. 图7糖巍宦对礴簿转l化串曲黟响Il Fig.7E,,ec.:畦.g~etltration Dnp?pl哪虹缸曲- 1.o.5f—l齄3:缔:4.1o 较高的转化率和将来荆用废水发酵,糖浓 度也不会太高所段进择1%葡萄糖敢爱 进行半连续发酵探索. g.固定化颠粒的批式发酵以最佳 固定化程序制备的固定化颗粒;'.甩上面逛 出的最适固定化细胞发酵条件辞离二 3夫置换一次新鲜培养澈,固定化细膨重 复发酵30次连续作用65天对,产酸量保持 稳定(图8),主要产物为丙酸. 田8嗣定化细胞半连续培并产酸憧品 Fig.BProplon~acldproductiono王immobilizedceilsbys眦iconnnu0uscuItivation 讨论 术实验采用海藻酸盐包埋北京丙酸杆 菌,在包埋细胞潜过程啦,按一YQ喈 smSrh~…的方法进行稀释平板活菌计数 发现活菌数出最初包埋时2×.个颗 ? ? ? ? 2精王蓓等:诲酸盐固定化北京丙酸杆菌丙酸发酵的研究 粒于笫二天很侠增民至10.一2×10个/g 颗粒.丽发酵液中也很快就有从颗粒中溢 出的游离细胞,由I6h均10个/ml培养液 至第3天10个/mI培养液.说明本实验 巾包埋后的细胞增嫩,属固定化活细胞. 本实验起初采用磷酸盐缓冲液配制培 养基,凝胶颗粒在培养基中24h后即软化 变形,甚至溶解,后改用NaOH调节培养 澉pH,这虽不能控制其产酸引起的pH 变化,但可消除磷酸盐破坏凝胶结构的缺 点.同时在培养基中补加0.1CaCi, 在综合的最适条件下,颗粒可保持稳定产 酿活性这6天,形态始终完好,主要产物 为丙酸.固定化细胞克服了游离细胞收集 重复使用的困难,使用寿命延长. 参考文献 (i)乐华丑等s梭生物,27(2):loB—lO口,1口BT. [2]乐华爱等Il_微生物,30(1):22—28'19, [3]B0P0如en,?.H.H?p.t?t??EaB??n?M?tpo6?.T?A,15(4):s53P^l97 [4]Clausen,E.C.andGaddy,JLChem.Eng.Pro9.,t0(12)l5g一63,198d. [5]Carin,J.F.etaI.1西otechnoI.Left.,70(11):821--826,】9B5., (6]Yongsmith,B.andChutlma,K.1.Ferment.Techno1.,61(6):3~598,1g83. StudiesonPropionicAcidFermenta.tidnbyImmobilized - I , cellsofPropionibacteriumbeijingvnsewithhlgihate 'WangBe]JinShiyunYueHuaai (nsin【把o,肼crobf0口Ac础msfni%Bering) Theopt]mumconditionsforin~obilizafionandferentationof尸tO- plonlbac~eriurabeijingensewith.alginatetOproduceatgreat—amountof 出opio~caddwerereported;Theoptimumiti越concentrationsofsodium alginaleandcellswere2%and100%(w/V)respecti~vely.Tmixture ofcellsandalginafewasdroppedintoaCaCI:solutiontOgetspherical particles.州thadiameterof3—4m.Theimmobiiizedceilswereput jna25mlanaerobictubeattheratioof5gparticles/15mlmediumcon- ~ained():glucose1,yeas~.exct0.5,andCaQ20.1.Theywerecu]- tivatedstaticallyal;30~Ct0producesignificantamoua~ofvolatileacids. Theratioofpropionicacid1.;OaceticacidwasapproximatJyt0:4.7rr~T,一 obilizedcellsv/e1"ereutilizedfor30timesconsecutive".fermentaff~n.The activity6fimmobilizedcellswerestablefor65days. . KeyW0rds iPropionlb州bei]f?口.;sodiualginat.;propiicacid fermentation,