我国南方甘蔗病毒种类初步鉴定

我国南方甘蔗病毒种类初步鉴定 臻3期JrG褒gAg篡.n物Bi.i2006年9月Sept.,2006 文章编号:1008—3464(2006)03—0226,03 我国南方甘蔗病毒种类初步鉴定 周国辉,许东林,蔡艳清,陈晓琴,李俊光 (华南农业大学资源环境学院,广东广州510642) 摘要:依据OenBank中已报道的甘蔗主要病毒基因组序列设计PCR引物,以采自我国广东,广西,云南, 海南等地的甘蔗叶组织总RNA或总DNA抽提物为,采用一步法RT—PCR及PCR扩增,对预期扩增产 物克隆,测序,根据序列同一性判断测定样品是否含有预期病毒,结果表明,我国南方甘蔗已受到甘蔗花叶 病毒(Sugarcanemosaicvirus,SCMV),高粱花叶病毒(Sorghummosaicvirus,SrMV),甘蔗黄叶病毒 (Sugarcaneyellowleafvirus,SCYLV)及甘蔗杆状病毒 (SugarcaneBacilliformVirus,SCBV)的侵染,未 发现甘蔗线条花叶病毒(Sugarcanestreakmosaicvirus,SCSMV)及甘蔗线条病毒(Sugarcanestreakvirus, SSV). 关键词:甘蔗病毒;PCR;RT—PCR;病毒检测 中图分类号:S432.41文献标识码:A PreliminaryidentificationofsugarcanevirusesoccurredinsouthChina ZHOUGuo—hui,XUDong—ling,CAIYan—qing,CHENXiao—qin,LIJun—guang (CollegeofNaturalResouresandEnvironment,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guang zhou510642,China) Abstract:RT—PCRandPCRwereperformedwithprimersbasedonreportedsugarcaneviral genomicsequenceinGenBank.databaseandtotalRNAorDNAextractedfromsugarcaneleaftissue collectedfromsouthChinaincludingGuangdong,Guangxi,Yunnan,Hainanprovinces.Amplified DNAproductswithexpectedsizewereclonedandsequenced.Viruswasidentifiedaccordingtothe nucleotideidentitieswithreportedviralgenomicsequence.Itwasrevealedthatthesugarcanegrownin southChinawasinfectedwithSugarcanemosaicVirUS(SCMV),Sorghummosaicvirus(SrMV), Sugarcaneyellowleafvirus(SCYIV)andSugarcaneBacilliformVirus(SCBV);butSugarcanestreak mosaicvirus(SCSMV)andSugarcanestreakvirus(SSV)didnotbefound. Keywords:sugarcanevirus;PCR;RT—PCR;virusdetection 甘蔗栽培及育种大多以蔗茎作种或种质交流材料,这过程病毒病易人为远距离传 播并逐代积累,是 生产上不容忽视的一大问题.迄今世界范围内发现侵染甘蔗的病毒超过15种,本 文报道笔者近年来对 我国南方蔗区的主要病毒种类进行分子鉴定及检测的初步结果. 1材料与方法 2001年至2005年间,从广东,广西,云南,海南甘蔗生产地及育种基地随机采集成熟 蔗茎或幼嫩 叶片,蔗茎播种于防虫网室内成苗,叶片置一2OC冻箱保存备用.采用RNA抽提试 剂盒(洛阳华美生 收稿Et期:2005—09—02;修回日期:2005—10—18. 基金项目:广东省科技攻关项目(2003B21604) 作者简介:周国辉(1963一),男,安徽太湖人,华南农业大学副教授,博士;E— mail:ghzhou@scan.edu.cn 第3期局国辉等:我国南方甘蔗病毒种类初步鉴定 物公司产品)抽提叶组织总RNA,或CTAB法抽提叶组织总DNA.根据GenBank数据库中已公 布的甘蔗病毒基因组或基因片段序列设计PCR扩增特异引物,每种病毒设计引物数不少于5对,引物 长度大干2O碱基.采用RT—PCR或PCR(试剂购自大连宝生物工程公司)对抽提的RNA或DNA样品 进行扩增,扩增产物经琼脂糖凝胶电脉判断目的片段的有无.切胶回收目的片段,直接测序或克隆于 pMD18一T载体(大连宝生物工程公司产品)扩繁后对重组质粒测序.测序结果运用Blast程序在 GenBank数据库中进行比对,根据序列同一性判断扩增产物是否为病毒基因组片段,进而鉴定样品中 的病毒种类. 2结果与分析 2.1甘蔗花叶病毒 在60份样品中,有46份(占7679/6)被成 功地扩增出甘蔗花叶病毒(Sugarcanemosaic virus,SCMV)CP基因片段(906bp).对该片 段进行序列测定,并将序列登录至GenBank (登录号为DQ227694),该序列与GenBank 中已公布的SCMVCP基因的相应片段序列 同一性为76.4,99.5.在46份阳性样品 中,16份为果蔗样品(包括黑皮及黄皮果蔗, 检测总数为20份,),30份为糖蔗样品(包括 华南地区7个主栽品种,检测总数为40份). 甘蔗花叶病症状见图1. 2.2高粱花叶病毒 以高粱花叶病毒(Sorghummosaic virus,SrMV)CP基因特异引物对35份样品 进行RT—PCR检测,仅在40(6/15)的果 图1由SCMV或/和SrMV引起的甘蔗花叶病典型症状 (叶片颜色黄绿相问,条状褪绿) Fig.1Typicalsymptomofsugarcanemosaicdisease causedbySCMVor/andSrMV 蔗样品中获得阳性结果,未能在20份糖蔗样品中获得阳性结果.对阳性样品的扩增片段进行测序,并 将序列登录至GenBank(登录号为DQ227695),该序列与GenBank中已公布的SrMVCP基因的相应 片段序列同一性均大于80.此外,有3份阳性样品同时被检测到SCMV. 2.3甘蔗黄叶病毒 根据GenBank已报道的甘蔗黄叶病毒 (Sugarcaneyellowleafvirus,SCYLV)基因 片段序列,在病毒CP基因两侧设计6条引 物,组合形成9个引物对.其中8个引物对能 够从广东某引种基地部分甘蔗品种样品中经 RT—PCR扩增出预期大小的DNA产物,其核 苷酸序列(634bp)与分离自巴西的SCYIV— B1株系(GenBank登录号AF369925)完全 相同].巢式RT—PCR能够从甘蔗绵蚜 (Ceratovacunalanigera)总RNA提取物中获 得阳性结果.甘蔗黄叶病早期症状见图2. 2.4甘蔗杆状病毒 根据GenBank数据库中已报道的甘蔗 杆状病毒(SugarcaneBacilliformVirus, SCBV)两个分离物(澳大利亚分离物和摩洛 图2由SCYLV引起的甘蔗黄叶病早期症状 (叶片中脉黄化) Fig?2Earlystagesymptomofsugarcaneyellowleaf diseasecausedbySCYL 广西农业生物科学第25卷 哥分离物)的基因组序列(登录号AJ277091和M89923),在两者的保守序列区段设计10对PCR引物, 仅复制酶基因及外壳蛋白基因引物可从部分甘蔗(包括糖蔗和果蔗)叶组织~,DNA样品中经PCR扩增 获得阳性结果,PCR产物核苷酸序列(589bp和795bp)与SCBV澳大利亚分离物相应区域相似性分 别为75.04和6O.63].由于SCBV基因组为环状双链DNA,并且大小仅为7.5kb左右,理论上根 据所测定序列设计引物,能够扩增出病毒基因组其他区域,但本研究多次重复试验均未成功. 2.5甘蔗线条病毒 甘蔗线条病毒(Sugarcanestreakvirus,SSV)基因组为环状单链DNA,仅2700nt].根据GenBank 中报道的SSV基因组序列(登录号M82918,AF088881等),并参考与SSV亲缘关系相近的玉米线条 病毒(Maizestreakvirus,MSV)基因组序列(登录号AJ225010,AF329879等),设计了15对PCR 引物,以表现条纹症状的甘蔗植株叶组织总DNA为模板,进行PCR扩增,其中两对引物可获得与预期 大小相近的产物,但其核苷酸序列与已报道的SSV序列无相似性,而与甘蔗及玉米基因组部分序列有 相似性.其他引物不能获得预期大小的扩增片段. 2.6甘蔗线条花叶病毒 甘蔗线条花叶病毒(Sugarcanestreakmosaicvirus,SCSMV)为马铃薯Y病毒科未归属成员. GenBank中报道了7个分离物(登录号AY193783,Y17738等)基因组3一末端序列, 根据已报道序列 设计引物,未能从甘蔗叶组织总RNA抽提物中RT—PCR扩增出预期片段. 3结论与讨论 本研究采用分子生物学方法,证明我国甘蔗上普遍发生SCMV,果蔗还受到SrMV侵染,SrMV与 SCMV存在混合侵染的现象,糖蔗尚未或很少受SrMV侵染.SCYIV已传人我国,并有可能经甘蔗绵 蚜实现田间传播.我国南方甘蔗是否受到SCBV侵染尚需进一步研究证实.初步判断我国南方甘蔗尚未 受到SSV和SCSMV侵染. 采用PCR或RT—PCR技术对植物病毒进行鉴定和检测已被许多研究者所采用,其优点是简便快 速,但存在假阳性或假阴性的风险.为了防止假阳性,扩增产物的测序分析是必要的,本研究中SSV 基因组部分序列扩增就出现了假阳性;对于一些基因组序列变异性较大的病毒,仅根据基因组部分序 列的相似性仍不能对病毒作最终的鉴定,本研究中SCBV的鉴定尚需获得其他相关的信息;对于病毒检 测,要谨慎选择合适的引物,以确保扩增产物的特异性.为了防止假阴性,病毒的鉴定或检测过程中, 均应采用简并引物或多条引物进行平行试验. 参考文献: [1]许东林,周国辉,任小平.等.广东甘蔗引种基地甘蔗黄叶病毒分子鉴定EJ-I.植物病理,2005.35(5): 415—417. E23蔡艳清,许东林,周国辉,等.广东首次发现甘蔗杆状病毒EC]//中国植物病理学会.2004年学术年会论文集. 北京:中国农业科学技术出版社,2004:213—215. E3]BIGARREL,SALAHM,GRANIERM,eta1.Nucleotidesequenceevidenceforthreedis tinctsugarcanestreak mastrevirusesEJ].ArchivesofVirology.1999,144(12):2331—2344. (责任编辑装润梅)