RPHPLC法测定垂体后叶注射液升压素与缩宫素效价的研究

2013年《药物分析杂志》优秀论文评选交流会论文集 2(2分离度试验称取l、2、3、4适量，用流动相溶解并稀释制成每l mL中约含40斗g的溶液，作为分离度 测 试溶液，按“2(1”项色谱条件测定，见图2(图略)。结果显示出峰顺序为1、4、3、2，相邻色谱峰间的分离度 大于 3(0。 2(3检测限试验称取1、2、3、4适量，用流动相溶解并稀释制成一系列溶液，按“2(1”项下色谱条件测定。 结果3的浓度为0(20斗g?mL。时的S,N为2(8，1的浓度为0(12“g?mL一时的S,N为2(5，2的浓度为 0(25斗g?mL。1时的S,N为2(9，4的浓度为0(20}xg?mL。时的S,lV为2(8。 mL量瓶中，分别经酸(1 tool?L。1盐酸溶液5 2(4强制破坏试验称取美索巴莫约0(1 g，置于50 mL，室温放置30 min)、氧化(30,过氧化tool?L。1氢氧化钠溶液5 mL，室温放置30 min)、碱(1 10 氢 mL，室温放置3 h)、热(甲醇12 mL，100 oC水浴加热3 h)和光(甲醇2 mL，自然光下照射 h)破 坏后，将上述经酸、碱破坏的供试品溶液分别中和后，用流动相溶解并稀释至刻度作为测定5 液，其余 样品用流动相溶解并稀释至刻度作为测定液。按“2(1”项下色谱条件测定，见图3(图略)。试验结 果显示在碱性试验条件下最不稳定，在酸、热等试验条件下有降解产物产生，在氧化、光等试验条件 下基本稳定。 2(5影响因素试验旧。 取本品，分别放置在60?电热恒温箱中(高温试验)，RH 92(5,的容器中(高湿 度 试验)，光强度4500 k的试验箱中(强光照射试验)。于第10 d分别称取上述样品约0 (g，置于150 mL量瓶 中，用流动相溶解并稀释至刻度作为测定液。按“2(1”项下色谱条件测定。试验结果显示美索巴 有引湿性，在高温(60?)、高湿(RH 莫几乎没 92(5,)和光照(4500 lx)条件下基本稳定。表明本品在固体状态稳定 性良好。 3讨论与结论 根据美索巴莫的合成工艺，本品可能存在的杂质有1(起始原料)、2(中间体)和4[副产物，结构式见图 4(图略)]。经检测3批样品，结果发现样品中存在2个杂质，经对杂质与杂质对照品的相对保留时间和紫 外光吸收图谱进行比对，确定样品中的杂质为l和4。其中杂质1为未反应完全的起始原料，杂质4为中间 体2氨解时的副产物。 同样，在强制破坏试验中，采用降解产物与杂质对照品的相对保留时间和紫外光吸收图谱进行比对，确 定了在酸性条件下的主要降解产物为4;在热、碱性条件下的主要降解产物为I和4。杂质l来源于c处酯 键的水解，杂质4为a处羟基与b处羰基进行的酯交换反应产生的，见图5(图略)。上述试验结果表明:美 索巴莫在溶液状态，酸性条件下主要发生分子内的酯交换(重排)反应;热、碱性条件下还会发生酯键的 水解。 从以上试验结果可以获知:杂质l和4即是工艺杂质，也是降解产物。因此，合成工艺中通过优化反应 条件、工艺参数等可降低杂质的含量;贮藏环境避免高温和水分等可降低产生降解产物的风险;同时提示制 剂工艺中应避免酸性、碱性辅料的使用和高温操作的工艺。 本文采用HPLC—DAD法，结合杂质对照品确证了美索巴莫的杂质，简便。 参考文献(略】 lip—I-1PLC法测定垂体后叶注射液升压素与缩宫素效价的研究 史芳亮，黄坚，邵泓，陈钢 (上海市食品药品检验所，上海201203) 摘要 目的:建立测定垂体后叶注射液升压素与缩宫素效价的高效液相色谱法，探讨HPLC法代替生物测定法的可行性。方 x250 mm法:应用Inertsi]ODS—SP色谱柱(4(6 mm，5斗m);以0(02 mol?L“的磷酸二氢钠溶液为流动相A，以0(04 t001( L。1磷酸二氢钠溶液一乙腈(50:50)为流动相B，梯度洗脱;流速为1(0 mL?min,;检测波长为220 nm。结果:升压素和缩宫 素的峰面积与浓度的线性关系良好(r>0(9988)，平均加样回收率升压素在109(5,,116(2,之间，缩宫素在92(3,。 2013年《药物分析杂志》优秀论文评选交流会论文集 98(5,之Pq。RP—HPLC法与生物测定法测定结果有一定差异，但两者间有很好的相关性。结论:RP—HPLC法快捷，重复性 好，易于操作，影响因素少，可替代生物测定法测定垂体后叶注射液的升压素与缩宫素的效价。 关键词:垂体后叶注射液;RP—HPLC;升压素效价;缩宫素效价; Studies on RP-—-HPLC determination of the assays of andofvasopressin oxytocin injection posteriorpituitary SHI Fang—liang，HUANG Jian，SHAO Hong，CHEN Gang Institute for Food and 201203，China)(Shanghai Drug Control，Shanghai establish for the and Abstract RP—HPLC method determination of of a0bjecfive: Toassays oxytoein vasopressin of to estimate if the could be substituted RP—HPLC(Methods: posterior pituitary injection，and biological assay by The was on Inertsil ODS—SP mm×250 mode with performed column(4(6 mm，5 Ixm)in gradient using analysis 0(02 tool?L,sodium mobile and 0(04 mol?L一1 sodium asAdihydrogen dihydrogen phosphate phase B(The flow was 1(0 mL?min一1 the detection rateandin 50,acetonitrile as mobile phosphate wavelength phase was at 220 method had linear between the and the amount about nnl(Results:The good relationship response and with the correlation coefficients above 0(9988(The recoveries of vasopressin oxytoein average vasopressin were 109(5,一 obtained from RP1 those of were 92(3,一98(5,(There were differences between the results 16(2,(and oxytoein with those method(but —HPLCandthetheresultsobtainedfromRP—HPLCshowedcorrelation biologicalgood PR—HPLC method offers and fast it from method(Conclusion: Thesimple operation，high accuracy，and biological the method( canbiological replace of of oxytocinKey words:posterior pituitary injection;RP—HPLC; assaythe vasopressin;the assay 垂体后叶注射液系由猪或羊或牛等动物的脑垂体后叶经脱水、干燥、研细，再用稀醋酸提取制得的无菌 溶液 ，为激素类药物。本品为生物提取的多组分制剂，主要具有2种生物功效:升压作用和缩宫作用，而起 这2种功效作用的成分就是升压素和缩宫素，两者均为九肽化合物。大多数哺乳动物来源(如人、牛等)的 升压素8一位为精氨酸，称精氨酸升压素;猪源升压素有1个氨基酸与前者不同，8一位为赖氨酸，称赖氨酸 升压素;不同来源的缩宫素结构均相同[2]。本品在临床上可用于肺、支气管出血，消化道出血，并适用于产 科催产及产后收缩子宫、止血，对尿崩症有减少排尿量的作用。本品为国家基本药物，收载于2005年版中国 药典二部n]。升压素作为效价测定，缩宫素作为检查项，两者的测定均采用生物测定法。本文旨在探讨RP —HPLC法测定垂体后叶注射液升压素与缩宫素效价的可行性，为本品的质量提高提供一个方向。 1仪器与试药 MP十六道生理记录仪。 仪器:Agilent 1260高效液相色谱仪，Biopac 试剂:垂体后叶国家标准品(1(48升压单 位?mg,，1(87缩宫单位?mg,，批号502—8709)、EP缩宫素 标准品(0(96 IU?mg,，批号4(0)、猪源升压素(肽含量87,，纯度98,，批号mg?瓶,，600 V6879— 039K0319，Sigma公司)、牛源升压素(肽含量89,，纯度97,，水分7,，批号V9879—038K8728，Sigma公 司);乙腈为色谱纯;其他试剂均为分析纯。 样品:62批样品为2011年国家评价性抽验样品，来自4家生产企业，动物来源均为猪源。 2方法与结果 2(1标准品溶液的制备 垂体后叶标准品溶液:参照2010年版中国药典二部附录?1升压素生物测定法中标准溶 液的配制，将垂 UmL含升压素3 u和6 U的溶液，此溶液相应每1 mL含缩宫素3(79 体后叶国家标准品制成每1 和7(58 U。 一73一2013年《药物分析杂志》优秀论文评选交流会论文集 mL含升压素5(0斗g、10(0斗g升压素标准溶液:精密称取猪源升压素适量，加0(25,醋酸溶液制成每 1 的溶液。 mL含缩宫素4(8卜g(2(88 缩宫素标准品溶液:取EP缩宫素标准品1瓶，加0(25,醋酸溶液制成每1 IU)、9(6斗g(5( IU)76的溶液。 mm×250 mol?L“的 pm);流动相:A为0(02 —SP色谱柱(4(6 mm，5ODS2(2色谱条件色谱柱:Inertsil min:70,—40,A; tool?L一磷酸二氢钠溶液一乙腈(50:50)，梯度洗脱 (O,30磷酸二氢钠溶液，B为0(04 min:40,A:40。 50min:40,---+10,A;50,60 min:10,A);流速为l mL?min,;检测波长为220 30。40Ilm;柱温:30?;进样量: IxL50;取样品原液进样。系统适应性溶液各成分间的分离度应不小于1(5，系统适 应性 溶液、垂体后叶标准品溶液、供试品溶液及0(25,醋酸溶液色谱图见图1(图略)。 2(3线性、精密度及回收率考察精密称取猪源升压素，用0(25,醋酸溶液制成浓度为46(46斗g?mL。1 的标准溶液。取EP缩宫素标准品1瓶，加0(25,醋酸溶液制成浓度为48(00 I(Lg?mL。1的标准品溶液。精密量取上述 2种溶液各l、3、 5、7、9 mL，分别置同一10 mL量瓶中，用0(25,醋酸溶液稀释至刻度，制 成6个系列浓度的线性溶液。按“2(2”液相色谱条件进行测定，以标准品进样浓度(I(Lg?mL。1)为横坐 标，峰面积为纵坐标，进行线性拟 合，升压素在4(646—46。46 Izg?mL一浓度范围内，线性良好，相关系数 为0(9988;缩宫素在4(800,48(00 Iu?mL。1)浓度范围内，线性良好，相关系数 斗g?mL‘1(2(88—28(8 为0(9999。 精密量取升压素浓度为6( U?mL’1的垂体后叶标准品溶液50?L，在“2(2”项色谱条件下，连续进样626 次，升压素峰面积的RSD为1(84,，缩宫素峰面积的RSD为2(76,。 4家企业各选取一批样品进行加样回收率考察，平均回收率升压素在109(5,一116(2,之间，缩宫素在 92(3,,98(5,之间。 2(4 以垂体后叶标准品溶液为定量标准品溶液，采用RP—HPLC法与生物测定法结果比较 RP— HPLC法与2010年版中国药典二部附录?，4 o升压素与缩宫素生物测定法，分别对62批样品进行了测 定，结果见表1(表略)。对2种方法测得的数据进行相关性分析，结果见图2(图略)。分 缩宫素效价2种方法相关性良好，测定升压素效价2种方法相关性较好，测定两者比析显示测定 值2种方法相关 性较差。 3讨论 3(1参照BP(2010)”1缩宫素的含量测定方法建立垂体后叶注射液升压素与缩宫素的RP—HPLC测定方 法。本品的成分复杂，含多种杂蛋白，为使升压素和缩宫素能与相邻的色谱峰达到基线分离，并确保各成分 均能洗脱，将梯度进行适当调整，并延长洗脱时间。该色谱条件可同时分离三氯叔丁醇，样品的色谱图表明 有其他成分干扰三氯叔丁醇出峰，因此三氯叔丁醇的测定未采用该方法测定。3(2垂体后叶注射液的现行标准中缺少升压素和 缩宫素的鉴别项，本方法可作为本品的鉴别项。在该液相 色谱条件下，猪源升压素峰与牛源升压素峰分离度可达到1(7，升压素峰、缩宫素峰与相邻的色谱峰均能达 到基线分离。 3(3为使2种测定方法具有可比性，RP—HPLC法也采用垂体后叶国家标准品制备标准品溶液，2种测定 方法标准品溶液的水平有差异，标准品溶液的制备方法决定了2种测定方法就会有一定的实验误差。本试 验的结果表明采用RP—HPLC法及生物测定法测定本品的升压素和缩宫素效价有一定的差异，但是2种方 法之间有很好的相关性。由于生物测定法的影响因素多，测定结果误差大，目前药典的发展方向也尽可能用 其他方法如液相方法来替代生物测定法，减少实验动物的使用，故建议采用RP—HPLC法替代生物测定法 测定本品的升压素与缩官素效价，同时建议采用纯的标准品定量。 参考文献(略)