医学毕业论文脂质体携载atp对顿抑心肌的保护作用

医学#毕业#脂质体携载atp对顿抑心肌的保护作用 X X 大学 毕业论文 脂质体携载ATP对顿抑心肌的保护作用 姓 名:__________ 2014年6月25日 脂质体携载ATP对顿抑心肌的保护作用 作者:李伟杰 贾国良 郭文怡 刘兵 【关键词】 心肌顿抑 关键词: 心肌顿抑;脂质体;三磷酸腺苷 摘 要:目的 观察恢复顿抑心肌的能量代谢对其功能的影响. 在18 只麻醉开胸犬上建立局部心肌顿抑(My-ocardium Stunning)模型，在顿抑心肌 局部灌注脂质体包裹的三磷酸腺苷(ATP)，用高效液相色谱法测量心肌腺苷酸 含量.动态监测血流动力学及局部心肌收缩力的变化. 结果 冠脉灌注脂质体携 载ATP可以明显提高心肌细胞ATP含量，减少顿抑局部血清丙二醛的产生，降 低心肌细胞Ca2+ 含量，提高局部心肌收缩力，加快心脏收缩功能的恢复.而冠 脉灌注游离ATP则无此作用. 结论 顿抑心肌能量代谢与心功能之间有着密切 联系，提高顿抑心肌ATP含量可以加快心功能的恢复.脂质体作为载体可以将外 源性ATP导入心肌细胞内，是一种很有前途的治疗措施. Keywords:Myocardium stunning;liposome;ATP Abstract:AIM To test whether restoration of adenosine triphosphate(ATP) levels in myocytes after brief coronary artery occlusion might improve the function of postischemic myocardium.METHODS Eighteen anesthetized，ventilated dogs underwent thoracotomy.A silastic perfusion shunt was established between the left carotid and proximal LAD arter-ies.Then the dogs were subjected to15min of LAD occlu-sion and60min of reperfusion.ATP-liposome(n=6，2.5mmolmin-1 )，free ATP (n=6，2.5mmolmin -1 )or an equivalent volume of saline(control，n=6)was injected into the proximal LAD respectively during the reperfusion.The adenine nucleotide content of myocardium was studied with high-performance liquid chromatography.Regional myocar-dial contractility was measured with a myocardial tension transducer.RESULTS ATP-liposome increased the ATP content of postischemic myocardium significantly ,(2.49?0.23)mmolg-1 vs control(1.90?0.21)mmolg-1 ， P0.01,，decreased myocyte calcium ,(1.82?0.27)mmolg-1 vs control(2.21?0.20) mmolg-1 ，P0.05,and mal-ondialdehyde content of serum and improved the regional my-ocardial contractility，while free ATP failed to do so.CONCLUSION Restoration of ATP levels in stunned my-ocardium may improve the contractility of the heart.Lipo-some-entrapped ATP infusion into the stunned myocardium can increase myocardial ATP content，and may be a beneficial therapy. 0 引言 随着急性心肌梗死溶栓治疗及经皮冠状动脉腔内成形术等心脏介入性治 疗和心脏外科手术的广泛开展，心肌顿抑(Myocardium Stunning)现象已引起国 内外学者的极大关注,1，2, ，对其发生机制及防治方面进行了大量的实验和 临床研究.能量代谢在心肌顿抑发生中的作用一直是研究的一个热点.研究发现， 顿抑心肌三磷酸腺苷(ATP)含量下降需数小时或数日才能恢复正常，与心功能 的恢复相一致,3, .我们首次采用脂质体携载ATP加快心肌ATP含量的恢复， 观察其对顿抑心肌功能和生化的影响. 1 和方法 1.1 ATP脂质体的制备 采用改良的逆相蒸发法,4, ，按分子比为5?5? 1称取卵磷脂、胆固醇和十八胺，共溶于乙醚中，加入含ATP的0.05molL-1 的 PBS，逆相蒸发成膜，超声震荡制备出直径80,100nm、均匀稳定带正电荷的 ATP脂质体.包裹率测量:采用透析法分离出游离ATP.将透析后的脂质体乳浊液按 10?1比例加入50mLL-1 Trston X-100振荡，待完全透明后用高效液相色谱法测 量ATP含量.本实验测量包裹率为35%. 1.2 动物模型建立 健康成年杂种犬(由第四军医大学实验动物中心提 供)，雌雄不拘.以戊巴比妥钠麻醉后开胸，做一心包床，分离心大静脉插入Y形 胶管，连通右心房，建立静脉回流和供采血用.于冠脉左前降支第一对角支远端 分离冠脉，行颈动脉-左前降支旁路术:将外径3mm的薄壁塑料管插入左颈总动脉，另一端与插入左前降支远端的塑料管相连，中间串入三通开关，通过旁路三通开关，造成冠脉关闭及开放，并经此冠脉内给药.经股动脉插管测量左室压及动脉压，在左前降支第二对角支下插入肌张力传感器(XH-1型)缝线固定在心外膜上，张力变化由八导生理仪(RM-6000)记录.同步记录左心室压力图形.测量收缩末和舒张末心肌张力差，以缺血前为基点，计算缺血后及再灌注各时间点的心肌张力变化，以百分比表示. 1.3 心肌能量物质的测量 实验结束后迅速将犬处死，立即取左室缺血再灌区和非缺血区全层组织各一块，置于液氮中速冻，后切取约0.5g心肌组织，准确称质量，置于预冷的玻璃匀浆器中，按1?10的比例加入预冷的0.6molL-1 HClO4 ，在冰浴条件下制成心肌匀浆，在-4?冰箱内放置24h后，低温4000rmin-1 离心15min，取上清液，在0?条件下，用5molL-1 KOH滴定调节pH值为7.0，低温4000rmin-1 离心15min，取上清置于冻存管内-40?冻存待测.测量前取出标本，室温融化后立即.测量采用HPLC法，每份标本测量4次，取平均值. 1.4 心肌Ca2+ ，Mg2+ 含量 采用常规火焰吸收法测定. 1.5 血清丙二醛(MDA)测量 用改良八木国夫法. 1.6 实验分组 阻断冠脉15min，再灌注60min，于再灌同时冠脉灌注药物55min.动物随机分为3个组:顿抑对照组(CON，n=6)冠脉灌注生理盐水;游离ATP组(LAA，n=6)冠脉灌注空白脂质体加ATP2.5μmolmin-1 ;ATP脂质体组(LEA，n=6)冠脉灌注脂质体包裹ATP2.5μmolmin-1 .统计学处理:数据用x ?s表示，组间均数比较采用单因素方差分析，组内比较采用配对t检验. 2 结果 2.1 血流动力学及局部心肌收缩力变化 心率(HR)、平均动脉压(MAP)和左室收缩压在缺血及再灌注过程中，有缓慢下降趋势，各组之间无显著差 异.?dp/dtmax 在缺血后下降，再灌注后逐渐恢复，3组间比较无显著差异.LEA组+dp/dtmax 在再灌注15min后与缺血前无差异，较LAA和CON组恢复提前，左室舒张末压各组间无显著差异.局部心肌收缩力在缺血及再灌注过程中明显低于缺血前水平(P0.01)，LAA组对局部心肌收缩力的影响与CON组比较无显著差异，LEA组使局部心肌收缩力增强，与CON组比较P0.01(Tab1). 表1 犬心肌局部收缩力变化 略 表2 再灌注60min犬心肌核苷酸含量 略 2.2 心肌腺嘌呤核苷酸含量变化 顿抑组冠脉阻断15min再灌注60min时心肌ATP含量为正常区的63%，LEA组ATP含量为正常区的79%，较CON组明显升高，LAA组ATP含量与CON组比较无显著差异(Tab2). 2.3 顿抑局部血清MDA含量变化 CON组缺血15min及再灌注过程中血清MDA含量升高，LEA组再灌注过程中血清MDA含量明显低于CON组，而LAA组与CON组间无差异(Tab3). 表3 犬心大静脉血清MDA含量 略 2.4 心肌Ca2+ 和Mg2+ 含量变化 CON组再灌注60min时心肌Ca2+ 明显高于正常区(P0.05)，LEA组心肌Ca2+ 低于CON组(P0.01)，LEA组心肌Mg2+ 含量高于CON组，但未达到统计学意义.而LAA组心肌Ca2+ ，Mg2+ 与CON组比较无明显差异(Tab4). 表4 犬顿抑区心肌钙离子和镁离子含量 略 3 讨论 能量是维持细胞结构完整性和心肌收缩功能的基础.心肌顿抑时ATP含量 的恢复和结构损伤的恢复及心功能的恢复相平行，三者之间有着一定的内在联系.心肌线粒体功能下降，能量产生障碍，导致ATP含量的低下，是心功能低下的一个原因.纠正心肌能量代谢可使其功能得到改善,5, .又有研究发现心肌ATP含量与心功能的高低并不直接相关,6, .补充外源性ATP，直接提高心肌ATP含量是研究能量与心功能之间关系最直接的方法，但由于ATP是一种大分子化合物，正常情况下难以通过细胞膜进入细胞内，其作用主要是通过作用于细胞表面的受体或降解为腺苷而发挥的.脂质体是用人工方法制备的，由磷脂双分子层薄膜形成的微球体，它可以将药物包封于其囊内的水相内.它可通过融合、胞饮等方式，将药物带入细胞内，改变原来药物的代谢、清除和排泄过程，提高了药物在靶组织中的分布.研究发现缺氧心肌和去极化心肌细胞摄取带正电荷脂质体增加，特别是缺血再灌注区心肌摄取脂质体能力最强,7, .故脂质体是一种较理想的载体被用来携载药物及生物活性物质治疗心肌缺血 ,8，9, .本实验采用脂质体将外源性ATP导入心肌细胞内，改变了其作用方式和代谢，使其药理作用发生了变化.本实验结果显示脂质体包裹ATP，提高了心肌细胞ATP含量，使再灌注60min时ATP含量升高到正常的79%，明显高于对照组.心肌腺嘌呤核苷酸总量较对照组和空白脂质体加ATP组升高，这为心肌线粒体再磷酸化提供了基础.能量负荷(EC)是反映心肌再磷酸化能力的一个指标，缺血及再灌注过程中EC较正常区显著下降，而脂质体包裹ATP可以提高顿抑心肌能量负荷，提示顿抑心肌再磷酸化能力增加，ATP产生增加.本实验结果还显示脂质体携载ATP减少了氧自由基的产生和脂质过氧化的发生，减轻细胞内钙超载，使再灌注损伤减轻.同时使心肌收缩力增加，心脏收缩功能恢复加快.当然，顿抑心肌是一个多因素参与的复杂病理过程，如有研究表明乙醇通过ATP依赖的K通道以外途径促进顿抑心肌收缩功能恢复,10, .本研究提示，顿抑心肌能量代谢与功能之间有着密切联系，提高心肌ATP含量可以加快心功能恢复，脂质体可以外源性ATP导入心肌细胞内，可能会有良好的应用前景. 参考文献: ,1,Rinaldi CA，Hall RJ.Myocardial stunning and hibernation in clinical practice ,J,.Int J Clin Pract，2000;54(10):659-664. ,2,Grubitzsch H，Ansorge K，Wollert HG，Eckel L.Stunned my-ocardium after off-pump coronary artery bypass grafting ,J,.Ann Thorac Surg，2001;71 (1):352-355. ,3,Kloner RA，Bolli R，Marban E，Reinlib L，Braunwald E.Medi-cal and cellular implications of stunning，hibernation，and pre-conditioning:An NHLBI workshop ,J,.Circulation，1998;97(18):1848-1867. ,4,Wu DC，Xu L，Zhang XY.The synthesis of the derivative of oleoyl mitomycin C and its liposomes ,J,.Di-si Junyi Daxue Xuebao(J Fourth Mil Med Univ)，1994;15(2):148. ,5,Allibardi S，Chierchia SL，Margonato V，Merati G，Neri G，Dell’ Antonio G，Samaja M.Effects of trimetazidine on metabol-ic and functional recovery of postischemic rat hearts ,J,.Cardiovasc Drugs Ther，1998;12(6):543-549. ,6,Saupe KW，Eberli FR，Ingwall JS，Apstein CS.Hypoperfusion-induced contractile failure does not require changes in cardiac energetics ,J ,.Am J Physiol， 1999;276(5Pt2):H1715-H1723. ,7,Tang CS，Su JY，Li ZP，Zhang LZ，Yang J，Qi M，Liu FA，Tang J.Feasibility study of liposome-medication to treat is-chemic heart disease(I) ,J,.Zhongguo Kexue B Ji(Science in Chin，series B)，1992;2:165-171. ,8,Meldrum DR，Meng X，Shames BD，Pomerantz B，Donnahoo KK， Banerjee A，Harken AH.Liposomal delivery of heat-shock protein72into the heart prevents endotoxin-induced myocardial contractile dysfunction ,J,.Surgery， 1999;126(2):135-141. ,9,Niibori K，Wroblewski KP，Yokoyama H，Crestanello JA，Whitman GJ.Bioenergetic effect of liposomal coenzyme Q10on myocardial ischemia reperfusion injury ,J,.Biofactors，1999;9(2-4):307-313. ,10,Gross ER，Gare M，Toller WG，Kersten JR，Warltier DC，Pagel PS.Ethanol enhances the functional recovery of stunned myocardium independent of K(ATP)channels in dogs ,J,.Anesth Analg，2001;92(2):299-305.